Vorbereitung der Chitosan-basierten injizierbaren Hydrogele und deren Anwendung in 3D Zellkultur

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, ein injizierbares Chitosan-Hydrogel für die dreidimensionale Zellkultur herzustellen, um es schließlich in therapeutischen Behandlungen zu verwenden. Diese Methode kann Fragen im Bereich des selbstheilenden Hydrogels beantworten, z. B. wie man ein selbstheilendes Hydrogel durch vollständiges Eintauchen herstellt und wie man es für die 3D-Zellkultur verwendet. Der Vorteil dieser Technik ist, dass durch die Kompatibilität von selbstheilendem Hydrogel auf sehr einfache Weise und durch die Verwendung einer 3D-Zellkultur hergestellt werden kann.

Dieses Hydrogel ist auch injizierbar, so dass es als Träger für die Zelltherapie verwendet werden kann. Nun zeigt Ihnen Herr Yongsan Li, wie Sie das Hydrogel herstellen und wie Sie die 3D-Zellkultur mit diesem Hydrogel durchführen. Yongsan Li ist unser Doktorand unseres Labors.

Um die Hydrogele herzustellen, synthetisieren Sie zunächst DF PEG. In einem Abzug werden vier Gramm Molekulargewicht von 4.000 PEG in einen Rundkolben gewogen und 100 Milliliter Toluol hinzugefügt. Um die Polymere aufzulösen, erwärmen Sie dann die Lösung.

Nachdem sich alle Polymere aufgelöst haben, verwenden Sie einen Verdampfer, um alle Lösungsmittel zu entfernen. Wiederholen Sie dann den Vorgang des Einmischens von Toluol und des Verdampfens noch zweimal, um die trockenen PEG-Polymere vorzubereiten. Anschließend lösen Sie die Polymere mit einem Magnetrührer und 100 Millilitern DHF auf.

Löse dann 0,9 Gramm 4-Carboxybenzaldehyd in der Lösung auf. Löse anschließend 0,07 Gramm Dimethylaminopyrimid in der Lösung auf. Geben Sie nun 1,25 Gramm DCC in ein Trockenröhrchen, das mit wasserfreiem Calciumchlorid gefüllt ist.

Lassen Sie die Reaktion nun etwa 12 Stunden lang bei Raumtemperatur rühren. Verwenden Sie am nächsten Tag 500 Milliliter kalten Diethylether, um die weißen Feststoffe auszufällen, und verwenden Sie eine Vakuumfiltration, um die Feststoffe zu sammeln. Entsorgen Sie den gelösten Stoff und trocknen Sie die Feststoffe unter guter Belüftung.

Als nächstes lösen Sie die weißen Feststoffe in 100 Millilitern THF auf. Alle unlöslichen weißen Feststoffe müssen herausgefiltert werden, bevor Sie fortfahren. Nun werden die gelösten Feststoffe mit frischem Kaltdiethylether ausgefällt.

Verwenden Sie dann eine Vakuumfiltration, um die Feststoffe aufzufangen, und lassen Sie sie wieder trocknen. Wiederholen Sie diesen Vorgang zwei- bis dreimal und geben Sie dann die weißen Feststoffe in einen Vakuumtrockenofen, um sie vollständig zu trocknen. Das resultierende weiße Pulver ist das Endprodukt: Benzaldehyd-terminiertes DF PEG.

Um die Zellen für die Kultivierung in das Hydrogel einzukapseln, lösen Sie zunächst 0,44 Gramm DF PEG in zwei Millilitern Zellwachstumsmedium in einem Vier-Milliliter-Röhrchen auf. Die Mischung zu einer 20%igen Lösung verrühren. Als nächstes sterilisieren Sie die Lösung.

Geben Sie es in eine 10-Milliliter-Spritze und drücken Sie es durch einen 0,22-Mikron-Bakterienfilter. Mischen Sie nun 0,165 Gramm Glykol-Chitosan mit vier Millilitern Zellkulturmedien und stellen Sie mit einem Wirbel eine Chitosanlösung von 4 Gew.-% her. Sterilisieren Sie dann die Lösung mit einem weiteren 0,22-Mikron-Filter mit bakterienretentivem Filter.

Als nächstes ernten Sie die Zellen, wie z. B. L929-Zellen mit Trypsin. Waschen Sie die gesammelten Zellen und resuspendieren Sie sie in Medien mit 3,75 Millionen Zellen pro Milliliter. Im folgenden Schritt werden die Zellen in eine 3D-Matrix gepflanzt.

Die genaue Befolgung dieser Schritte ist entscheidend für den Erfolg. Mischen Sie nun 0,4 Milliliter der Zellsuspension mit 0,4 Millilitern Chitosanlösung unter Verwendung eines Wirbels. Pipettieren Sie diese Mischung in die Mitte einer Petrischale mit einem Durchmesser von zwei Zentimetern und pipettieren Sie 0,2 Milliliter der DF PEG-Lösung in die Schale.

Verwenden Sie dann vorsichtiges Pipettieren, um die Bildung des Hydrogels zu induzieren. Beurteilen Sie die Bildung des Hydrogels, indem Sie die Schale kippen und die Viskosität der Lösung beobachten. Um die Injektionsfähigkeit der verkapselten Zellen zu testen, stellen Sie das gleiche Präparat in einer 10-Milliliter-Spritze her.

Nachdem sich das Hydrogel gebildet hat, stoßen Sie das Hydrogel langsam durch eine 48-Gauge-Nadel in die Petrischale aus. Geben Sie dann einen Milliliter Nährmedium zu dem Hydrogel-Zell-Gemisch in der Platte und geben Sie die Platte zur Kultivierung in einen Inkubator. Wechseln Sie jeden zweiten Tag das Medium und überlagern Sie die 3D-Hydrogel-Zellkultur.

Um die in Hydrogelen verkapselten Zellen für die Bildgebung vorzubereiten, spülen Sie die Hydrogele zunächst zweimal mit einem Milliliter PBS aus. Färben Sie dann die Hydrogele mit Fluorescein-Diacetat-Lösung und Propidiumiodid-Lösung. Überlagern Sie das Hydrogel mit 0,5 Millilitern beider Lösungen und inkubieren Sie das Hydrogel 15 Minuten lang bei Raumtemperatur.

Nach der kurzen Inkubation mit den Fleckenlösungen saugen Sie alle Lösungsmittel ab. Beobachten Sie nun die Hydrogele mit konfokaler Mikroskopie, mit Anregung bei 488 Nanometern, um lebende Zellen zu betrachten, und Anregung bei 543 Nanometern, um tote Zellen zu betrachten. Sammeln Sie Bildstapel mit Zwei-Mikron-Scheiben, um die Verteilung der Zellen im Hydrogel zu validieren.

L929-Zellen. Eine typische Maus-Fiberglas-Zelllinie mit einer in-vivo-Gewebesteifigkeit von etwa 5.600 Pascal wurde in einem Hydrogel verkapselt. Ihre Lebensfähigkeit war während des gesamten Kulturprozesses extrem hoch und sie erreichten eine bemerkenswerte Zelldichte.

Nach siebentägiger Kultivierung im Hydrogel erhöhte sich die Zellzahl um 200 %Hydrogele, die durch eine 48-Gauge-Nadel in ihre Zellkulturschale ausgestoßen wurden, konnten sich nach etwa einer Stunde selbst heilen, um ein integriertes Hydrogel neu zu bilden. Nach sieben Tagen in Kultur vermehrten sich auch diese Zellen dramatisch. Es konnten Hinweise auf Zellspaltungsereignisse gefunden werden, bei denen einige Zellen in zwei geteilt auftraten.

Der Lebendtot-Assay zeigte eine sehr hohe Viabilität, was die erfolgreiche Zellproliferation im 3D-Hydrogel nach der Injektion zeigt. Diese Zellproliferationsrate betrug nach siebentägiger Kultivierung etwa 3/4 der von nicht injizierten Zellen. Obwohl also die Scherkraft während der Injektion einen messbaren negativen Effekt hat, waren die injizierten Zellen immer noch recht proliferativ.

Nachdem Sie dieses Video gesehen haben, sollten Sie wissen, wie Sie ein selbstheilendes Hydrogel vorbereiten und wie Sie dieses Hydrogel für die 3D-Zellkultur verwenden und wie Sie die Zelle mit diesem Hydrogel abgeben. Einmal gemeistert, kann diese Technik innerhalb einer Stunde durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Nach dem besten Verfahren können auch andere Methoden, wie z. B. die In-vivo-Injektion für die Zelltherapie oder die Verabreichung von Medikamenten, durchgeführt werden.