Name: In Vivo Test zum Nachweis von Antigen-spezifischen T-Zell Zytolyse-Funktion mit einer Impfung-Modell (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-28T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 5 s
Description: Erfahren Sie die in vivo Detektion antigen-spezifischer T-Zell-Zytolyse in einem murinen Modell. Diese Methode ermöglicht die direkte und schnelle Bewertung zytolytischer Potenziale für immunologische Forschung.

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Diese Arbeit wird unterstützt von der NIH Forschung (A1R03AI120027 (RN) und 1R21AI20012 (RN)), institutionelle Research Grant (RN), Start-up zu gewähren (RN) und MD Anderson CIC Samen zu gewähren (RN).

Alle hier beschriebene Methoden wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) von der University of Texas MD Anderson Cancer Center genehmigt.
1. Vorbereitung des Peptids für den Impfstoff
<ol><li>Auflösen der gefriergetrockneten Peptid mit Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) auf die entsprechende Konzentration und Wirbel für 30 s. Hinweis: Für hgp10025–33, die Endkonzentration ist 1 mg/mL und für OVA257–264, die Endkonzentration 0,5 mg/mL. Peptid vor der Injektion zu rekonstruieren. Lagern Sie nicht nach der Rekonstitution.</li>
</ol>2. Isolierung des Splenocyten von transgenen Maus
Hinweis: Zelle isoliert aus der Milz muss auf sterile Weise durchgeführt werden.
<ol><li>
Einschläfern der OT-1 transgenen Maus mit der genehmigten CO2 Erstickung Methode und die Milz zu entfernen. Hinweis: Geeignete transgenen Maus wird in diesem Schritt spezifisch für das Peptid Wahl genutzt.<ol>
<li>Legen Sie die Maus auf der rechten Seite. Die linke Seite der Maus mit 70 % igem Ethanol (EtOH) besprühen. Ziehen Sie die Haut mit Pinzette und schneiden Sie die Haut mit einer chirurgischen Schere; die Milz ist innerhalb der Bauchhöhle sichtbar. Vorsichtig aufschneiden der Bauchhöhle um die Milz zu gelangen. Entfernen Sie die Milz mit Pinzette.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Disaggregieren der Milz, indem man es in einen 70 µm-Filter in einer Petrischale mit 2 mL Medium A (PBS mit 1 % fetalen bovine Serum (FBS)) und Zerschlagung der Milz mit dem Ende von einem Kolben.
	<ol>
<li>Sammeln Sie die Splenocyten aus der Petrischale und in einem 50 mL konische Röhrchen. Waschen Sie die Petrischale mit 5 mL Medium A zweimal, bis alle Zellen zu sammeln. 25 mL Medium A bis hinzu und Zentrifugieren Sie die Zellen für 5 min bei Raumtemperatur bei 475 X g.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aspirieren Sie die Zellen und in 1 mL / pro Milz rote Blutzelle (RBC) Lysis Puffer aufzuwirbeln. Inkubation bei Raumtemperatur für 5 min. Fügen Sie 10 mL Medium A und Zentrifuge bei Raumtemperatur 475 X g. Aufschwemmen das Pellet in 10 mL Medium A und entfernen Sie Verschmutzungen durch Filterung der Zellsuspension durch einen 70 µm-Filter in einem sauberen 50 mL konisch.</li>
	<li>
Zählen der Zellen verwenden Trypan blau und ein Hemocytometer. Aufschwemmen Zellen in PBS, eine Endkonzentration von 106 - 1006 Zellen/mL. Für OVA257–töten,264 spezifische 106 Zellen/ml Aufschwemmen und für hgp100 töten,25–33 bestimmten 1006 Zellen/ml aufzuwirbeln.
	<ol>
<li>Spin die verbleibenden Zellen bei Raumtemperatur für 5 min bei 475 X g. Aspirieren überstand und Aufschwemmen in 15 mL kaltem PBS, Zellen zu waschen. Wiederholen Sie der Waschschritt noch einmal. Spin die Zellen bei Raumtemperatur für 5 min bei 475 X g. Aspirieren überstand und in kaltem PBS nach das Endvolumen in Schritt 2.4 ermittelten aufzuwirbeln.</li>
		<li>Übertragen Sie einzelne Zellsuspension auf einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch und auf dem Eis bis Injektion Empfänger C57/BL6 Maus.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Injektion von Splenocyten von transgenen Mäusen
<ol><li>Legen Sie Empfänger C57/BL6 Maus in eine einschränkende mit der dorsalen Seite nach oben. Sprühen Sie Injektion Schweif Grundfläche mit 70 % Isopropylalkohol. Verwalten Sie 100 µL der einzelnen Zellsuspension (Abschnitt 2) intravenös in die Rute Vene mit einer 27 G Nadel mit der abgeschrägten Seite nach oben.</li>
</ol>4. Covax Verwaltung
Hinweis: Wenn Zellen am Nachmittag injiziert werden, sollte die Covax am nächsten Morgen innerhalb von 18 Stunden Zelle Injektion verabreicht.
<ol><li>Platzieren Sie den Mauszeiger in einer klaren Anästhesie-Box mit ca. 1-3 % Isofluran. Nachdem Mäuse vollständig betäubt sind, übertragen Sie die Mäuse an der Nase Kegel an den Verteiler in der Anästhesie-Kammer angebracht. Halten Sie Mäuse zurückhaltend mit der dorsalen Seite oben. Hinweis: Anesthetization wird bestätigt durch eine kurze Zehe Prise zu überprüfen, ob eine Rücknahme-Antwort nicht ausgelöst wird. Bundesgesetz schränkt Isofluran-Nutzung in der Größenordnung von einem zugelassenen Tierarzt.</li>
	<li>Sprühen Sie Injektion Schweif Grundfläche mit 70 % Isopropylalkohol. 100 µL der Peptidlösung (von Abschnitt 1) subkutan injizieren mit einer 27 G Nadel mit der Spritze, 4-5 mm in der Rute Basiszone der Nadel abgeschrägten Seite nach oben eindringt. Hinweis: Die Mäuse werden in einer Flanke mit subkutane Injektion an der Unterseite der Rute10geimpft.</li>
	<li>100 µL Anti-CD40 Antikörper (0,5 mg/mL Brühe) seitlich auf die Injektionsstelle Impfstoff zu injizieren.</li>
	<li>Imiquimod-Creme 50 mg/Maus sorgfältig auf die Impfung-Seiten anwenden Reiben Sie Imiquimod-Creme auf der Oberfläche, bis die Creme nicht mehr sichtbar ist und wird vollständig absorbiert.</li>
	<li>100 µL 100.000 IU/mL RhIL-2 Protein intraperitoneale Injektion (i.p.) an der unteren Bauchregion. Beobachten Sie Mäuse für 5 Minuten, nachdem sie vollständig aus der Narkose zu erholen. Hinweis: Experiment wird an dieser Stelle für 3 Tage angehalten.</li>
</ol>(5) Isolierung von Target Splenocyten zur Beschriftung mit CFSE
Hinweis: Zelle isoliert aus der Milz muss auf sterile Weise durchgeführt werden.
<ol><li>Einschläfern der C57BL/6 Mäusen nach genehmigten CO2 Erstickung Methode. Spleen(s) wie in Schritt 2.1.1 zu entfernen. Disaggregieren der Milz und Splenocyten wie in den Schritten 2.2.1 - 2.2.3 zu waschen. Lyse der roten Blutkörperchen wie in den Schritten 2.3 - 2.3.2.</li>
	<li>Zellen für die Zählung mit einem Hemocytometer zu entfernen und für eine Endkonzentration von Zellen bei 106 Zellen/mL in CFSE--Kennzeichnung Lösung (in Schritt 7 beschrieben) zu berechnen. Drehen Sie die verbleibende Zellen bei Raumtemperatur für 5 min bei 475 x g. Aspirat überstand.</li>
</ol>(6) Peptid Pulsieren des Target Splenocyten
Hinweis: Peptid pulsieren muss auf sterile Weise durchgeführt werden.
<ol><li>Aufschwemmen Zellen 106 Zellen/ml in komplette Medien (RPMI 1640 Medien mit 10 % FBS, 1 % L-Glutamin (L-Gln), 1 % Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep)). Teilen Sie die Zellen in 2 Röhren (15 mL Conicals). Beschriften Sie jedes Rohr als gepulste oder ungepulsten.</li>
	<li>
Fügen Sie Peptid, das Rohr mit der Bezeichnung gepulst. Fügen Sie für OVA257–264 pulsieren 1 µg/mL und für hgp10025–33 pulsieren, fügen Sie 2 µg/mL. Hinweis: Die ungepulsten Zellen durchlaufen die gleichen Inkubation wie die gepulsten Zellen nur ohne den Zusatz des Peptids.<ol>
<li>Inkubieren Sie Zellen + Peptid bei 37 ° C für 1 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fügen Sie 10 mL komplette Medien (RPMI 1640 Medien mit 10 % FBS, 1 % L-Glutamin (L-Gln), 1 % Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep)) auf jedes Rohr zu waschen beide gepulsten und ungepulsten Zielzellen. Drehen Sie die verbleibende Zellen bei Raumtemperatur für 5 min bei 475 x g. Aspirat überstand.</li>
</ol>7. Vorbereitung der CFSE zur Kennzeichnung Ziel Splenocyten
<ol><li>
Bereiten Sie CFSE--Kennzeichnung Lösung, während die Zelle im Schritt 6.3 waschen; Die gepulsten Zellen werden als CFSE-Hallo und die ungepulsten als CFSE-lobeschriftet werden. 106 Zellen 1 mL CFSE--Kennzeichnung Lösung vorbereiten. Hinweis: CFSE ist lichtempfindlich und sollte zu allen Zeiten vor Licht geschützt werden.<ol>
<li>Bereiten CFSE-Hallo -kennzeichnen Medien durch Zugabe von 1 uL/mL CFSE (5 mM Stammlösung) für eine Endkonzentration von 5 µM/mL RPMI Medien 1640 mit 2 % FBS.</li>
		<li>Bereiten CFSE-lo -kennzeichnen Medien durch Zugabe von 1 uL/mL CFSE (0,5 mM Stammlösung) für eine Endkonzentration von 0,5 µM/mL RPMI Medien 1640 mit 2 % FBS.</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. Kennzeichnung der Ziel-Splenocyten mit CFSE-
Hinweis: CFSE-Kennzeichnung muss auf sterile Weise durchgeführt werden.
<ol><li>Aufschwemmen der gepulsten und ungepulsten Zielzellen (aus Schritt 6.3) bei 106 Zellen/mL CFSE--Kennzeichnung Media. Aufschwemmen der gepulsten Zellen mit vorbereiteten CFSE-Hallo-Kennzeichnung, Medien und die ungepulsten Zellen mit vorbereitet CFSE-lo-kennzeichnen Medien.</li>
	<li>Mischen Sie Zellen und CFSE--Kennzeichnung Medien durch sanfte Umkehrung oder wirbeln. Verwechseln Sie nicht durch aufschütteln. Brüten Zellen und CFSE--Kennzeichnung Medien bei 37 ° C für 15 min. Remix den Zellen alle 5 Minuten.</li>
	<li>Jede Zelle Aussetzung und Spin-Zellen bei Raumtemperatur für 5 min bei 475 X g 10 mL komplette Medien hinzufügen.</li>
	<li>Aspirieren Sie überstand und aufzuwirbeln Sie Zellen in 10 mL kaltem PBS. Spin-Zellen bei 4 ° C für 5 min bei 475 X g.</li>
	<li>Wiederholen Sie Schritt 8.4.</li>
	<li>Zählen der Zellen und Mix Peptid-gepulste CFSE-Hallo-beschriftet mit ungepulsten, CFSE-lo-Zellen im Verhältnis 1:1 für die Injektion in Empfänger Mäuse beschriftet. Halten Sie eine Aliquote von 1 x 106 gemischte Zellen für einen Flow Cytometry Basisbewertung (Abschnitt 11) zu verwenden. Hinweis: Das Endvolumen Injektionslösung ist 100 µL pro Maus. Die endgültige Zellenzahl ist 10e6 Zellen. Verlust von Volumen in der Spritze und Nadel muss Rechnung getragen werden und sollte bei 500 µL abgeschätzt werden.</li>
</ol>(9) Injektion von Zielzellen
Hinweis: Halten Sie CFSE--markierte Zellen vor Licht vor und während der Injektion so weit wie möglich geschützt.
<ol><li>Legen Sie Empfänger C57BL/6 Mäusen in eine einschränkende mit der dorsalen Seite nach oben. Sprühen Sie Injektion Schweif Grundfläche mit 70 % Isopropylalkohol. Verabreichen Sie 100 µL der einzelnen Zellsuspension intravenös mit der abgeschrägten Seite nach oben in die Rute Vene.</li>
</ol>10. erneute Isolation der Zielzellen
Hinweis: Der Zeitpunkt für diesen Schritt ist kritisch und abhängig von der CTL Zytotoxizität und die Stärke des Antigens zur Stimulation. Zur Beurteilung einer OVA257–264 gepulste Ziel zu töten müssen die Zellen geernteten 4-6 h nach der Injektion. Da CFSE--markierte Zellen Licht empfindlich, Prozess Milz im Dunkeln.
<ol><li>Die Empfänger C57BL/6 Mäusen nach der genehmigten CO2 Erstickung Methode einschläfern.</li>
	<li>Spleen(s) wie in Schritt 2.1.1 zu entfernen. Disaggregieren der Milz und Splenocyten wie in den Schritten 2.2.1 - 2.2.3 zu waschen. Lyse der roten Blutkörperchen wie in den Schritten 2.3 - 2.3.2.</li>
	<li>Aufzuwirbeln Sie Zellen in 1 mL Fluoreszenz aktiviert Zelle sortieren (FACs) Puffer (1 % BSA + PBS) für die Bewertung von Durchflusszytometrie.</li>
</ol>11. gating Logik CTL-Aktivität durch Durchflusszytometrie bestimmen
<ol><li>
Führen Sie Beurteilung der CTL-Aktivität mit einem standard Flow Cytometry Protokoll. Zellen mit der FITC-Kanal auf einem Durchflusszytometer mit 488 nm Laser für Erregung11zu erwerben.
	<ol>
<li>Tor auf live Lymphozyten mit den forward Scatter (FSC) Vs Side Scatter (SSC) Parametern. Subgate innerhalb des live Lymphozyten-Gates für die Gesamtbevölkerung CFSE--positiv. Hinweis: Die injizierten CFSE--markierten Zellen werden eine kleine Teilmenge der gesamten Lymphozyten vorhanden in der Milz bilden. Die CSFE-positiven Zellen sollte als zwei verschiedene Populationen auf der logarithmischen Skala angezeigt werden.</li>
		<li>Verwenden Sie ein Histogramm-Format um zu bestimmen, den Prozentsatz der ungepulsten (linke Spitze, CFSE-lo) und gepulste (richtige Spitze, CFSE-Hallo) Bevölkerungen. Verlust der CFSE-Hallo Zellen zeigt die Antigen-spezifische CTL Aktivität.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+and+quantification+of+T+cell-mediated+cytotoxicity+using+cell-permeable+fluorogenic+caspase+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Visualization and quantification of T cell-mediated cytotoxicity using cell-permeable fluorogenic caspase substrates.</a> Nat Med. 8 (2), 185-189 (2002).</li>
<li>Wherry, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+relationship+and+protective+immunity+of+memory+CD8+T+cell+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Lineage relationship and protective immunity of memory CD8 T cell subsets.</a> Nat Immunol. 4 (3), 225-234 (2003).</li>
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<li>Hailemichael, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+antigen+at+vaccination+sites+induces+tumor-specific+CD8%28%2B%29+T+cell+sequestration%2C+dysfunction+and+deletion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Persistent antigen at vaccination sites induces tumor-specific CD8(+) T cell sequestration, dysfunction and deletion.</a> Nat Med. 19 (4), 465-472 (2013).</li>
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<li>Cho, H. I., Celis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+peptide+vaccines+eliciting+extensive+CD8+T-cell+responses+with+therapeutic+antitumor+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Optimized peptide vaccines eliciting extensive CD8 T-cell responses with therapeutic antitumor effects.</a> Cancer Res. 69 (23), 9012-9019 (2009).</li>
<li>Ya, Z., Hailemichael, Y., Overwijk, W., Restifo, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+model+for+pre-clinical+study+of+human+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mouse model for pre-clinical study of human cancer immunotherapy.</a> Curr Protoc Immunol. 108, 21-43 (2015).</li>
<li>Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+protocols+for+surface+and+intracellular+antigen+analyses+of+neural+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types.</a> J Vis Exp. (94), (2014).</li>
<li>Durward, M., Harms, J., Splitter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+specific+killing+assay+using+CFSE+labeled+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Antigen specific killing assay using CFSE labeled target cells.</a> J Vis Exp. (45), (2010).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Während dieses Protokolls sehr einfach ist, gibt es ein paar wichtige Schritte, die sorgfältig durchgeführt werden müssen. Die Covax Grundierung nach Injektion von antigenspezifischen T-Zellen getestet ist notwendig, um jegliches Töten der gepulsten Ziele zu sehen. Es ist zwar möglich, dass die wässrige Covax Impfung eine akute entzündliche Erkrankung, für die chronischen entzündlichen Phase schafft kann anstelle der kurzlebigen wasserbasierte Formulierung mit einem langsam-Antigen Version Öl basierenden Ansatz eine bess...

Mehrere Protokolle gibt es zur Beurteilung der Zytolyse (CTL) Potenzials eine CD8+ oder CD4+ T-Zellen. Diese Einschätzung kann ohne weiteres in Vitro unter kontrollierten Bedingungen1,2,3erfolgen. Darüber hinaus haben Infektionskrankheit Modelle, wie z. B. LCM, CTL-Funktion durch den Einsatz von differentiell CFSE-(5-(and 6)-Carboxyfluorescein Diacetat Succinimidyl Ester) mit der Bezeichnung Zielzellen klassisch geprüft wo die CFSE-Hallo-markierte Zellen sind gepulst mit einem Peptid und CFSE-lo-ungepulsten beschrifteten Ziel Zellen sind links. Die Zellen sind dann im Verhältnis 1:1 gespritzt und bewertet für den Verlust von den CFSE-Hallo-gepulste Ziele von Flow Cytometry4beschriftet. Impfstoff und Ablehnung Modelle haben auch ähnliche Strategien zur Beurteilung der in Vivo zu töten, indem beide CD8 verwendet+ und CD4-Zellen sowie NK Zellen5,6+ T. Dies ist ein leistungsfähiges Assay, sondern erfordert die Verwendung von Infektionserregern, die das Immunsystem vor der Ziel-Injektion prime.
Dieses Protokoll auf der anderen Seite erfordert keine vorherige Infektion des Wirtes und nutzt stattdessen eine Impfstrategie um das Immunsystem vor der Ziel-Injektion prime. Diese Impfung ist eine wasserbasierte Formulierung der Peptid-Impfstoff, der Bereitstellung von einer immunstimulierenden cocktail namens Covax7, bestehend aus einem Toll-Like Rezeptor 7 (TLR7) erfordert bestehend Agonist (Imiquimod-Creme), eine agonistische Anti-CD40 Antikörper und Interleukin-2 (IL-2) führt zu synergistische Kombination von immunstimulierenden Agenten für die Erhebung von Peptid-spezifische Grundierung und robuste Immunantwort. Als solches bietet dieser Assay eine schnellere Auslesen der CTL-Funktion, da der Impfstoff nur drei Tage vor der Injektion von den Zielzellen zusammen mit den Zellen zur Beurteilung der Funktion verwaltet wird. Darüber hinaus ist die Covax Grundierung stark genug, dass die Tötung Kapazität des grundiert antigenspezifischen T-Zellen zwischen 4 und 24 h nach der Injektion gesehen werden kann.
Die größte Beschränkung dieses Protokolls ist die Zeitachse in Vivo für den Nachweis von Ziel Tötung identifizieren, die angebracht ist, das Antigen und die Hypothese getestet. Sorgfältige Bewertung durchgeführt werden muss, als Variationen in Antigen Stärke sowie genetische Veränderungen in T-Zellen getestet Differenzial CTL-Funktion führen, die eine Erkennung von unterschiedlichem Timing Ziel töten erfordern würde. Darüber hinaus zwar die entsprechende Konzentration des Peptids für Impfung für menschlichen Melanom Antigen Glycopeptide 100 (hgp10025-33) optimiert wurde und Ovalbumin257-264 (OVA257-264)8,9 , Verwendung eines anderen Antigen-Modells, die möglicherweise besser geeignet, eine gegebene Studie würde weitere Validierung erfordern. Optimierung der IL-2 Dosis Konzentration und Dosis Frequenz möglicherweise aufgrund erwarteten Unterschiede in einem Ziel-Antigene Kapazität, CTL-Effektor-Funktion in Kombination mit der Covax als Adjuvans zu stimulieren muss das gewünschte Ziel zu erreichen. Insgesamt ist dieses Protokoll ermöglicht eine schnelle Beurteilung der Funktion in Vivo zu töten und kann an jedem bestimmten Antigen angepasst werden.

<table><tbody><tr><td>6 bis 12 Wochen altes Weibchen C57BL/6 Mäuse&nbsp;</td><td>Charles River</td><td>027</td><td>C57 Schwarz 6 Mäuse</td></tr><tr><td>OT-1 6-12 Wochen alte weibliche Mäuse&nbsp;</td><td>Jackson Labs</td><td>003831</td><td></td></tr><tr><td>hgp10025&ndash; 33&nbsp;</td><td>CPCScientific</td><td>834139</td><td>KVPRNQDWL</td></tr><tr><td>OVA 257&ndash; 264&nbsp;</td><td>CPCScientific</td><td>MISC-012</td><td>SIINFEKL</td></tr><tr><td>Imiquimod Creme 5%&nbsp;</td><td>Fougera</td><td>51672-4145-6</td><td>Aldara Creme</td></tr><tr><td>CD40-spezifisch mAb&nbsp;</td><td>BioXcell</td><td>BE0016-2</td><td>Klon FGK4.5</td></tr><tr><td>rhIL-2 Protein&nbsp;</td><td>Hoffman LaRoche Inc</td><td>136</td><td>Rekombinantes humanes IL-2-Protein</td></tr><tr><td>70% Isopropylalkohol Zubereitung</td><td>Kendall</td><td>S-17474</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>26140-079</td><td>fötaler</td>Rinderserum-RBC-Lysepuffer</tr><tr><td></td><td>Life Technologies</td><td>A10492-01</td><td>Puffer zur Lyse roter Blutkörperchen</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Media</td><td>Life Technologies</td><td>11875119</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td>Penicillin/Streptomycin</td></tr><tr><td>CFSE</td><td>Life Technologies</td><td>C34554</td><td>5-(und 6)-Carboxyfluoresceindiacetat-Succinimidylester</td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA)</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL MCT graduiert natur</td><td>Fisher</td><td>05-408-129</td><td>Mikrozentrifugenröhrchen</td></tr><tr><td>70% Ethanol</td><td>Fisher</td><td>BP8201500</td><td>EtOH</td></tr><tr><td>Trypanblau Lösung, 0,4%&nbsp; &nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Hämozytometer</td><td>Fisher</td><td>267110</td><td></td></tr><tr><td>27 Gauge Nadel</td><td>BD</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>1 mL Spritze</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo test zum nachweis von antigen-spezifischen t-zell zytolyse-funktion mit einer impfung-modell

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

Aktuelle Methoden zur antigenspezifischen Tötung sind beschränkt auf in-vitro- Verwendung oder bei Infektionskrankheiten Modelle verwendet. Allerdings gibt es kein Protokoll speziell antigenspezifischen töten ohne eine Infektion zu messen. Dieses Protokoll dient und beschreibt Methoden, um diese Einschränkungen zu überwinden, indem es ermöglicht für den Nachweis von Antigen-spezifische Tötung von einer Zielzelle durch CD8+ T-Zellen in Vivo. Dies geschieht durch eine Impfung-Modell mit einem traditionellen CFSE--markierten Ziel töten Assay zusammenführen. Diese Kombination erlaubt es den Forscher, die Antigen-spezifische CTL Potenzial zu bewerten, direkt und schnell, da der Test nicht Tumorwachstum oder Infektion abhängig ist. Darüber hinaus das Auslesen basiert auf Durchflusszytometrie und so die meisten Forscher leicht zugänglich sein sollten. Die große Einschränkung der Studie ist die Zeitachse in Vivo identifizieren, die die Hypothese getestet werden. Variationen in Antigen Stärke und Mutationen in T-Zellen, die im Differenzial Zytolyse-Funktion ergeben müssen sorgfältig geprüft werden, um den optimalen Zeitpunkt für die Zellernte und Bewertung zu bestimmen. Die entsprechende Konzentration des Peptids für die Impfung wurde optimiert für hgp10025-33 und OVA257-264, aber weitere Validierung für andere Peptide, die möglicherweise besser geeignet, eine gegebene Studie benötigt werden würde. Insgesamt dieses Protokoll ermöglicht eine schnelle Beurteilung der Funktion in Vivo zu töten und kann an jedem bestimmten Antigen angepasst werden.

Vor der Injektion des CFSE--markierten Zielzellen läuft die Zelle 1:1-Mischung auf einem Durchflusszytometer bestimmen die Grundlinie Frequenzen CFSE-Hallo sowohl des CFSE-lo Zielzellen. Abbildung 1 A zeigt die gating Strategie zum Erkennen von Änderungen in der CFSE-Bevölkerung, eine erste Tor erfolgt über FSC und SSC-Parameter. Die gesamte CFSE--positiven Zellen sind dann vor der Bewertung der Änderungen in der Frequen...

Das Ziel dieses Protokolls ist es, für die Erkennung von in Vivo Antigen-spezifische Tötung einer Ziel-Zelle in einem Mausmodell ermöglichen.

In Vivo Test zum Nachweis von Antigen-spezifischen T-Zell Zytolyse-Funktion mit einer Impfung-Modell

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, die in vivo antigenspezifische Zerstörung einer Zielzelle in einem murinen Modell nachweisen zu können. Diese Methode kann helfen, Fragen im Bereich der Immunologie zu beantworten, beispielsweise bezüglich der ausreichenden Nachweisbarkeit antigenspezifischer zytolytischer Zerstörung von Zielzellen in einem angegriffenen Immunsystem und wie diese durch gezielte Modifikation der T-Zellen zur Verbesserung der Funktion in vivo verändert werden könnte. Der entscheidende Vorteil dieser Technik liegt darin, dass der Forscher das antigenspezifische zytolytische Potenzial direkt und schnell bewerten kann, da der Test nicht auf Tumorwachstum oder Infektion angewiesen ist.Diese Prozedur wird Cara Haymaker sowie Yared Hailemichael aus der Abteilung für Melanom-Medizinische Onkologie vorstellen. Nach der Anästhesie der Mäuse gemäß dem schriftlichen Protokoll den Schwanzansatzbereich mit 70 % Isopropylalkohol besprühen, um die Injektion vorzubereiten. Mit einer an eine Spritze angebrachten 27-Gauge-Nadel, wobei die Schräge nach oben zeigt, vier bis fünf Millimeter in den Schwanzansatzbereich eindringen und 100 Mikroliter der zuvor hergestellten Peptidlösung injizieren.Danach 100 Mikroliter Anti-CD4D-Antikörper lateral zur Impfstoffinjektionsstelle injizieren. Vorsichtig 50 Milligramm pro Maus Imiquimod-Creme auf die Impfstellen auftragen. Die Creme so lange einreiben, bis sie nicht mehr sichtbar ist und vollständig absorbiert wurde.Dann injizieren Sie 100 Mikroliter einer Lösung mit 100.000 IE pro Milliliter rekombinantem humanen rhIL-2-Protein intraperitoneal in die untere Bauchregion. Nach der Isolierung von Milzzellen aus Mäusen und der Lyse der roten Blutkörperchen gemäß dem schriftlichen Protokoll wird die Peptid-Pulsenz durchgeführt, indem die Zellen zunächst in vollständigem Medium mit einer Dichte von 106 Zellen pro Milliliter resuspendiert werden. Teilen Sie die Zellen auf zwei kegelförmige 15-Milliliter-Röhrchen auf und beschriften Sie diese als „pulsiert“ oder „nicht pulsiert“.Für das Pulsieren mit OVA 257 bis 264 geben Sie ein Mikrogramm pro Milliliter Peptid in das als „gepulst“ gekennzeichnete Reagenzglas. Inkubieren Sie die gepulsten und ungepulsten Zellen anschließend eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Geben Sie 10 Milliliter komplettes Medium zu beiden Reagenzgläsern, den gepulsten und ungepulsten, hinzu, um die Zielzellen zu waschen.Danach die verbleibenden Zellen bei 475 × g und Raumtemperatur fünf Minuten lang zentrifugieren, bevor das Überstand entfernt wird. Bereiten Sie ein CSFE-Hochmarkierungsmedium vor, indem Sie 1 Mikroliter pro Milliliter CSFE zu RPMI 1640 mit 2 % FBS hinzufügen, um eine Endkonzentration von fünf Mikromolar pro Millimeter zu erreichen. Bereiten Sie anschließend das CSFE-Niedrigmarkierungsmedium vor, indem Sie ein Mikroliter pro Milliliter CSFE zu RPMI 1640 mit 2 % FBS hinzufügen, um eine Endkonzentration von 0,5 Mikromolar pro Milliliter zu erreichen.Zur Markierung der Ziel-Splenozyten resuspendieren Sie 106 Zellen pro Milliliter pulsierte Zellen in vorbereitetem CSFE-Hochmarkierungsmittel und 106 Zellen pro Milliliter unpulsierte Zellen in CSFE-Niedrigmarkierungsmittel. Mischen Sie die Zellsuspensionen durch vorsichtiges Umstülpen oder Schwenken. Inkubieren Sie die Zellen anschließend 15 Minuten bei 37 Grad Celsius, wobei die Zellen alle fünf Minuten erneut gemischt werden.Fügen Sie anschließend 10 Milliliter komplettes Medium jeder Zellsuspension hinzu und zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 475 × g und Raumtemperatur. Danach wird das Überstand entfernt, und die Zellen werden mit 10 Milliliter kalter PBS resuspendiert. Zentrifugieren Sie die Zellen erneut fünf Minuten bei 475 × g und 4 Grad Celsius, bevor Sie die PBS-Waschung wiederholen.Zählen Sie die Zellen und mischen Sie peptidbeladene, mit CSFE hochmarkierte Zellen mit unbehandelten, mit CSFE niedrigmarkierten Zellen im Verhältnis 1:1 für die Injektion in Empfängermäuse. Heben Sie eine Aliquotprobe von 1 × 10⁶ gemischten Zellen zur Verwendung als Baseline-Flusszytometrie-Analyse auf. Führen Sie nach Injektion und erneuter Isolierung der Zielzellen gemäß dem Textprotokoll die Beurteilung der CTL-Aktivität mittels eines standardisierten Flusszytometrie-Protokolls durch, wobei die Zellen im FITC-Kanal mit einem 488-Nanometer-Laser zur Anregung erfasst werden.Vor der Injektion der mit CSFE markierten Zielzellen wurde das Zellgemisch im Verhältnis 1:1 an einem Durchflusszytometer analysiert, um die Ausgangsfrequenzen sowohl der CSFE-hoch- als auch der CSFE-niedrig-Zielzellen zu bestimmen. Hier dargestellt ist die Torgate-Strategie zur Detektion von Veränderungen in den CSFE-Populationen. Ein erstes Tor wurde anhand der FSC- und SSC-Parameter definiert.Die gesamten CSFE-positiven Zellen wurden anschließend vor der Beurteilung von Häufigkeitsänderungen weiter unterteilt, da diese Population im Vergleich zu den nicht markierten endogenen Spenlocyten relativ klein ist. Ein Beispiel für die relative Häufigkeit der CSFE-Populationen vor der Injektion ist hier dargestellt und sollte nahezu im Verhältnis eins zu eins liegen. Die Notwendigkeit der Covex-Priming zeigt sich in diesem Panel, bei dem 24 Stunden nach der Injektion keine Zerstörung der Antigen-beladenen CSFE-high-Zielzellen beobachtet wurde.Diese Abbildung zeigt den effektiven Abtötungsprozess der Antigen-beladenen, CSFE hochmarkierten Zielzellen, da der vor der Injektion beobachtete Peak nahezu nicht mehr nachweisbar war und sich das Verhältnis dramatisch von 50 % auf 1 % Nachweis verschoben hatte. Schließlich veranschaulicht die Abbildung auch die Kinetik des Abtötens der Antigen-beladenen, CSFE hochmarkierten Zielzellen, indem der Verlust dieser Population sowohl 6 als auch 24 Stunden nach der Injektion bewertet wird. Sobald die Methode beherrscht ist, kann sie je nach Antigen und T-Zell-Funktion innerhalb von zwei bis drei Tagen durchgeführt werden.Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig zu beachten, dass die CSFE-Markierung einheitlich sein muss und die Kinetik der CTL-Antwort vor der Durchführung des Assays bewertet werden muss. Nach diesem Verfahren können auch andere Methoden wie ELISA, ELISPOT und intrazelluläre Durchflusszytometrie-Färbung durchgeführt werden, um Veränderungen in der Effektorfunktion zu untersuchen und weitere zusätzliche Fragestellungen zu beantworten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die CTL-Funktion in vivo in Abwesenheit einer Infektion oder eines Tumors beurteilt werden kann.

in-vivo-assay-for-detection-antigen-specific-t-cell-cytolytic

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Viele Infektionen auslösen eine starke CTL-Antwort, aber gelegentlich, die Menge der reagierenden Zellen nicht korrelieren mit der Bekämpfung von...

Antigen-spezifische In Vivo Killing-Assay mit CFSE markierten Zielzellen

Dieses Video zeigt einen von Monozyten abgeleiteten dendritischen Zelle, MoDC-basierten Assay zur Messung der Immunogenität von kommerziell erhältlichen Impfstoffen. MoDC-Assays untersuchen dendritische Zellreaktionen auf Antigene, Krankheitserreger oder Behandlungen und können Einblicke in Immunreaktionen, Impfstoffentwicklung und Immuntherapieforschung geben.

Ein impfstoffgepulster In-vitro-Assay auf Basis dendritischer Zellen zur Induktion der Lymphozytenproliferation

Das Video zeigt eine immunologische Methode zur Überwachung der in vivo adjuvansinduzierten zytotoxischen T-Lymphozyten- oder CTL-Produktion. Einer Maus werden gentechnisch veränderte, proliferative Farbstoff-gefärbte CD8+ T-Spender-Lymphozyten vorinjiziert. Die subkutane Injektion von Ovalbumin mit Adjuvantien erzeugt zytotoxische CD8+ T-Lymphozyten, die nach der Entnahme durch Immunfärbung und Durchflusszytometrie identifiziert werden.

Eine immunologische Technik zur Überwachung der adjuvansvermittelten zytotoxischen T-Lymphozytenbildung

Wir entwickelten ein in vitro Assay, um die Rolle von immunWege in der Regulation der Zytokin-Sekretion von HIV-spezifischen CD4 + T-Zellen zu untersuchen.

In vitro-Test, um die Auswirkungen von immun Pathways auf die HIV-spezifischen CD4 T-Zell-Effektor-Funktion auswerten

Die Fähigkeit, T-Zell-Antworten im Detail in vivo Überwachung ist wichtig für die Entwicklung des Verständnisses der Immunantwort. Hier beschreiben wir die Verwendung von fluoreszierenden Zielarrays (FHA) in einem in vivo-T-Zell-Assay,&gt; 250 Parameter beurteilt gleichzeitig mittels Durchflusszytometrie.

Die Verwendung von fluoreszierenden Ziel Arrays zur Beurteilung der T-Zell-Antworten<em&gt; In-vivo-</em

Wir beschreiben Ganztier-Bildgebung und Durchflusszytometrie-basierte Techniken zur Überwachung der Expansion von antigenspezifischen CD8+ T-Zellen als Reaktion auf die Immunisierung mit Nanopartikeln in einem Mausmodell der Impfung.

Whole-Tier Imaging und Fließzytometrieverfahren zur Analyse von Antigen-spezifischen CD8 + T-Zellantworten nach der Nanopartikel-Impfung

Wir stellen Ihnen hier einen Antrag auf eine immunologische Standardtechnik (CFSE gebeizt OT-ich Verbreitung) schnell Adjuvans-vermittelten zytotoxischen T-Lymphozyten (CTL) Generation überwachen sollen in-vivo. Diese schnelle Abschätzung der CTL-Kapazitäten ist nützlich für die Entwicklung der prophylaktische Impfstoffe gegen intrazelluläre Erreger sowie therapeutische krebsimpfstoffe.

Schnelle In-Vivo Beurteilung des Adjuvans der zytotoxischen T-Lymphozyten Generation Fähigkeiten für die Impfstoffentwicklung

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Ex Vivo qualitativen Nachweis von Antigen-spezifischen CD8+ T Zellen. Analyse ist möglich mit einzelnen Zellsuspensionen von Organen oder geringe Mengen von Blut. Ein breites Spektrum an Studiengängen erfordert die Analyse der zytotoxischen T-Zell-Antworten (Impfung und Krebs-Immuntherapie-Studien).

Gleichzeitige Quantifizierung von Anti-Vektor- und Anti-Transgen-spezifische CD8+ T Zellen über MHC Tetramer Färbung nach der Impfung mit viralen Vektoren

Wir beschreiben hier einen in vivo tötenden Assay basierenden Strömungszysam, der die Untersuchung der Immunodominanz in zytotoxischen T-Lymphozyten (CTL) auf ein Modell-Tumor-Antigen ermöglicht. Wir stellen Beispiele dafür zur Verfügung, wie dieser elegante Test für mechanistische Studien und für die Wirksamkeit von Medikamenten eingesetzt werden kann.

Schneider In Vivo Cytotoxicity Assays zur Untersuchung von Immunodominanz in modularspezifischen CD8+ T Cell-Reaktionen

Dieses Protokoll beschreibt die chirurgische Entstehung von orthotopischen Bauchspeicheldrüsentumoren und die schnelle Verdauung von frisch isolierten murinen Bauchspeicheldrüsentumoren. Nach der Verdauung können lebensfähige Immunzellpopulationen für weitere nachgelagerte Analysen verwendet werden, einschließlich der Ex-vivo-Stimulation von T-Zellen zur intrazellulären Zytokindetektion durch Durchflusszytometrie.

Generierung von orthotopischen Pankreastumoren und Ex-vivo-Charakterisierung der tumorinfiltrierenden T-Zell-Zytotoxizität

Dieses Manuskript beschreibt, wie die In-vivo-Immunogenität von extrazellulären Vesikeln (EVs) aus Tumorzellen mittels Durchflusszytometrie beurteilt werden kann. EVs, die von Tumoren stammen, die einem behandlungsinduzierten immunogenen Zelltod unterzogen werden, scheinen in der Tumorimmunüberwachung besonders relevant zu sein. Dieses Protokoll veranschaulicht die Beurteilung von Oxaliplatin-induzierten immunstimulierenden Tumor-EVs, kann aber an verschiedene Einstellungen angepasst werden.

Im lebenden Organismus Immunogenitätsscreening von tumorabgeleiteten extrazellulären Vesikeln durch Durchflusszytometrie von Milz-T-Zellen

Erfahren Sie die in vivo Detektion antigen-spezifischer T-Zell-Zytolyse in einem murinen Modell. Diese Methode ermöglicht die direkte und schnelle Bewertung zytolytischer Potenziale für immunologische Forschung.

In Vivo Test zum Nachweis von Antigen-spezifischen T-Zell Zytolyse-Funktion mit einer Impfung-Modell

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