In Vivo Test zum Nachweis von Antigen-spezifischen T-Zell Zytolyse-Funktion mit einer Impfung-Modell

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, den Nachweis der in vivo antigenspezifischen Abtötung einer Zielzelle in einem Mausmodell zu ermöglichen. Diese Methode kann helfen, Fragen im Bereich der Immunologie zu beantworten, wie z.B. die Suffizienz und der Nachweis einer antigenspezifischen zytolytischen Abtötung von Zielzellen in einem angegriffenen Immunsystem und wie dies durch Manipulation der T-Zellen modifiziert werden könnte, um die Funktion in vivo zu verbessern. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie es dem Forscher ermöglicht, das antigenspezifische zytolytische Potenzial direkt und schnell zu beurteilen, da der Assay nicht vom Tumorwachstum oder der Infektion abhängig ist.

Diese Verfahren werden von Cara Haymaker und Yared Hailemichael vorgestellt, die uns von der Abteilung für medizinische Onkologie des Melanoms anleiten. Nach der Betäubung von Mäusen gemäß dem Textprotokoll verwenden Sie 70% Isopropylalkohol, um den Bereich der Schwanzbasis für die Injektion zu besprühen. Dringen Sie mit einer 27-Gauge-Nadel, die an einer Spritze befestigt ist, mit der abgeschrägten Seite nach oben vier bis fünf Millimeter in den Bereich der Schwanzbasis ein und injizieren Sie 100 Mikroliter der zuvor hergestellten Peptidlösung.

Injizieren Sie dann lateral der Impfstoffinjektionsstelle 100 Mikroliter Anti-CD4D-Antikörper. Tragen Sie vorsichtig 50 Milligramm Imiquimod-Creme pro Maus auf die Impfstellen auf. Reiben Sie die Creme in die Oberfläche ein, bis die Creme nicht mehr sichtbar ist und vollständig eingezogen ist.

Injizieren Sie dann 100 Mikroliter 100.000 IE pro Milliliter rekombinantes humanes rhIL-2-Protein intraperitoneal in den Unterbauchbereich. Nach der Isolierung von Splenozyten aus Mäusen und der Lyse der roten Blutkörperchen gemäß dem Textprotokoll wird ein Peptidpulsieren durchgeführt, indem zuerst Zellen in einer Höhe von 10 bis sechs Zellen pro Milliliter in vollständigem Medium resuspendiert werden. Teilen Sie die Zellen in zwei konische 15-Milliliter-Röhrchen auf und markieren Sie sie als gepulst oder ungepulst.

Für das Pulsieren von OVA 257 bis 264 geben Sie ein Mikrogramm pro Milliliter Peptid in das mit "gepulst" gekennzeichnete Röhrchen. Inkubieren Sie dann gepulste und ungepulste Zellen eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Geben Sie 10 Milliliter vollständiges Medium in die gepulsten und ungepulsten Röhrchen, um die Zielzellen zu waschen.

Dann werden die restlichen Zellen fünf Minuten lang bei 475 x g und Raumtemperatur gedreht, bevor der Überstand aspiriert wird. Bereiten Sie ein CSFE-High-Labeling-Medium vor, indem Sie 1 Mikroliter pro Milliliter CSFE zu RPMI 1640 mit 2 % FBS hinzufügen, um eine Endkonzentration von fünf Mikromolaren pro Millimeter zu erreichen. Bereiten Sie dann CSFE-Low-Labeling-Medium vor, indem Sie RPMI 1640 mit 2 % FBS einen Mikroliter pro Milliliter CSFE zusetzen, um eine Endkonzentration von 0,5 Mikromolar pro Milliliter zu erreichen.

Um die Ziel-Splenolyten zu markieren, resuspendieren Sie 10 bis sechs Zellen pro Milliliter gepulster Zellen mit vorbereitetem CSFE-Medium mit hoher Markierungsflüssigkeit und 10 bis sechs Zellen pro Milliliter ungepulster Zellen mit CSFE-Medium mit niedriger Markierungsflüssigkeit. Mischen Sie die Zellsuspensionen durch sanfte Umkehrung oder Verwirbelung. Inkubieren Sie die Zellen dann 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius und mischen Sie die Zellen alle fünf Minuten neu.

Geben Sie anschließend 10 Milliliter vollständiges Medium zu jeder Zellsuspension und zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 475 x g und Raumtemperatur. Aspirieren Sie dann das Supernatent und verwenden Sie 10 Milliliter kaltes PBS, um die Zellen zu resuspendieren. Schleudern Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 475 x g und 4 Grad Celsius, bevor Sie die PBS-Wäsche wiederholen.

Zählen Sie die Zellen und mischen Sie peptidgepulste CSFE-hochmarkierte mit nicht gepulsten CSFE-Zellen im Verhältnis 1:1 für die Injektion in Empfängermäuse. Bewahren Sie ein Aliquot von eins mal 10 bis zur sechsten gemischten Zelle auf, um es für eine durchflusszytometrische Beurteilung zu Beginn zu verwenden. Nach der Injektion und Reisolierung von Zielzellen gemäß dem Textprotokoll ist die Bewertung der CTL-Aktivität unter Verwendung eines Standard-Durchflusszytometrieprotokolls durchzuführen und die Zellen unter Verwendung des FITC-Kanals mit einem 488-Nanometer-Laser zur Anregung zu erfassen.

Vor der Injektion von CSFE-markierten Zielzellen wurde die 1:1-Zellmischung auf einem Durchflusszytometer durchgeführt, um die Ausgangsfrequenzen sowohl der CSFE-High- als auch der CSFE-Low-Zielzellen zu bestimmen. Hier ist die Gating-Strategie zur Erkennung von Veränderungen in den CSFE-Populationen dargestellt. Ein erstes Tor wurde unter Verwendung von FSC- und SSC-Parametern erstellt.

Die Gesamtzahl der CSFE-positiven Zellen wurde dann subgiert, bevor Änderungen in der Häufigkeit bewertet wurden, da diese Population im Vergleich zu den unmarkierten endogenen Spenlocyten relativ klein ist. Ein Beispiel für die relative Häufigkeit der CSFE-Populationen vor der Injektion ist hier dargestellt und sollte nahe eins zu eins liegen. Die Notwendigkeit des Covex-Primings wird in diesem Panel gesehen, wo 24 Stunden nach der Injektion keine Abtötung der antigengepulsten CSFE-High-Target-Zellen beobachtet wurde.

Diese Abbildung zeigt die effektive Abtötung der antigengepulsten CSFE-Zielzellen mit hoher Markierung, da der vor der Injektion beobachtete Peak fast unentdeckt blieb und das Verhältnis drastisch von 50 % auf 1 % Detektion verschoben wurde. Schließlich zeigt die Abbildung auch die Kinetik der antigengepulsten CSFE-High-Label-Zielzellabtötung, indem der Verlust dieser Population sowohl 6 als auch 24 Stunden nach der Injektion bewertet wird. Sobald diese Technik gemeistert ist, kann sie je nach Antigen- und T-Zell-Funktion in zwei bis drei Tagen durchgeführt werden.

Bei diesem Verfahren ist zu beachten, dass die CSFE-Markierung einheitlich sein muss und die Kinetik der CTL-Reaktion vor der Durchführung des Assays beurteilt werden muss. Im Anschluss an dieses Verfahren können auch andere Methoden wie ELISA, ELISPOT und intrazelluläre Durchflusszytometrie-Färbung durchgeführt werden, um Veränderungen der Effektorfunktion zu beurteilen und andere zusätzliche Fragen zu beantworten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie in der Lage sein, ein gutes Verständnis dafür zu haben, wie die In-vivo-CTL-Funktion ohne Infektion oder Tumor beurteilt werden kann.