In Vivo Tracking der menschlichen Fettgewebe mesenchymalen Stammzellen in einem Rattenmodell Knie Arthrose mit fluoreszierenden lipophile Membran Farbstoff

Dieses Protokoll beschreibt eine effiziente Möglichkeit zur Überwachung der Zelle Persistenz und Bioverteilung des menschlichen Fettgewebe mesenchymalen Stammzellen (HaMSCs) durch dunkelrote Fluoreszenz Kennzeichnung in einem Rattenmodell Knie Arthrose (KOA) durch intraartikuläre Injektion (IA).

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Wirksamkeit der Zellpersistenz und Bioverteilung von mesenchymalen Stammzellen aus humanem Fettgewebe in einer Rattenknie-Ostearthritis oder einem KOA-Modell unter Verwendung von in vivo Fluoreszenzbildgebung zu bewerten. Die In-vivo-Stammzellverfolgung kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der regenerativen Mathematik über die Reizung und Verteilung von menschlichem Fett zu beantworten, das in mesenchymalen Stammzellen in KOA-Tiermodellen gewonnen wird. Der Hauptvorteil der Verwendung von DiD besteht darin, dass sein rattenverschobenes Emissionsspektrum eine tiefe Gewebebildgebung bei lebenden Tieren ohne zytotische Effekte oder funktionelle Schäden an den farbstoffmarkierten Zellen ermöglicht.

Beginnen Sie damit, eine betäubte, 250 bis 300 Gramm schwere, acht bis 12 Wochen alte männliche Sprague Dawley-Ratte in der linken Seitenlage auf ein beheiztes Kissen zu legen. Verwenden Sie einen Rasierer, um das rechte Knie gründlich zu rasieren, und desinfizieren Sie den Operationsbereich mit 10 % Povidon-Jodlösung und 70 % Ethanol. Decken Sie den nicht-chirurgischen Bereich mit einer chirurgischen Unterlage ab.

Und machen Sie mit einem Skalpell einen zwei Zentimeter langen Schnitt seitlich entlang der Patellasehne, um die Gelenkkapseln freizulegen. Als nächstes durchtrennen Sie mit einem chirurgischen Skalpell das mediale Seitenband, das den Meniskus in Richtung Femur reflektiert, und fassen Sie den medialen Meniskus mit einer Pinzette. Schneide mit einem Skalpell den Meniskus an der schmalsten Stelle des Tibia-Ansatzes durch.

Um einen sicheren und praktikablen KOA-Beginn zu erhalten, sollte bei jedem Versuchstier die Femurseite des Meniskus vollständig durchtrennt werden. Schließen Sie dann die Gelenkkapsel mit einer beobachtbaren Vier-Grad-Naht und überwachen Sie die Ratte, bis sie sich vollständig erholt hat. Acht Wochen nach der Operation werden aus humanem Fett gewonnene mesenchymale Zellen aus einer 80%igen konfluenten Kultur mit zwei Millilitern Trypsin plus EDTA für drei Minuten bei 37 Grad Celsius abgenommen.

Nach einigen Minuten neutralisieren Sie das Trypsin mit vier Millilitern vollständigem Kulturmedium und sammeln die Zellen durch Zentrifugation. Resuspendieren Sie das Pellet in einer Konzentration von eins mal 10 bis sechs Zellen pro Milliliter in fünf Millilitern serumfreiem Kulturmedium. Und markieren Sie die Zellen 50 Minuten lang bei 37 Grad Celsius mit 50 Mikrolitern DiD-Zellmarkierungslösung.

Am Ende der Inkubation sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation und waschen sie zweimal in fünf Millilitern PBS pro Waschgang. Nach der letzten Zentrifugation verdünnen Sie die Zellen auf 2,5 mal 10 bis sechs lebensfähige Zellen pro 100 Mikroliter PBS-Konzentration und laden Sie die Zellen in eine Ein-Milliliter-Spritze, die mit einer 26-Gauge-Nadel ausgestattet ist. Als nächstes wird das arthritische Knie des ersten Versuchstieres, das den Gelenkbereich freilegt, erneut rasiert und die freiliegende Haut mit 70 % Ethanol desinfiziert.

Injizieren Sie die markierten Zellen in die Mitte des Dreiecks, das von der medialen Seite des Patellabandes, dem medialen Femoralkondylus und dem medialen Tibialkondylus gebildet wird, und öffnen Sie die Bildgebungssoftware. Initialisieren Sie das in vivo Biolumineszenz-Bildgebungssystem und positionieren Sie die Tiere in Rückenlage innerhalb der zentralen Stufe des Bildgebungssystems. Aktivieren Sie bei geschlossener Kammertür das Kontrollkästchen für die Leuchtstoffröhre und wählen Sie die entsprechenden Anregungs- und Emissionsfluoreszenzfiltersätze aus.

Stellen Sie das Sichtfeld auf D, die Pixelbiegung auf acht, die Blende F auf zwei und die Belichtungszeit auf auto. Lassen Sie die Tiere nach Erhalt der Bilder auf einem Wärmekissen mit Überwachung bis zur vollständigen Genesung erholen. Wählen Sie dann in der entsprechenden Bildanalysesoftware die Einheiten der Strahlungseffizienz für die Messung der Fluoreszenz und die für die Analyse interessierenden Bereiche aus und quantifizieren Sie die Fluoreszenzsignale aus jedem Bild.

In diesem repräsentativen Experiment wurden serielle Schnitte des Kniegelenks einer durch Kniearthrose induzierten Ratte acht Wochen nach der Operation mittels H&E und Safranin O/Fast Green Färbung untersucht. Die Dicke des Gelenkknorpels ist in den arthritischen Knien dünner als in den kontralateralen Gelenken ohne Operation, wie in den H&E-gefärbten Abschnitten beobachtet wurde. Darüber hinaus ist das Proteoglykan vermindert und das flimmernde Kollagen im Arthritis-Gelenk erhöht, was durch die Safranin O/Fast Green-Färbung sichtbar gemacht wird, was auf das Fortschreiten des durch die Operation induzierten degenerativen Kniearthrose-Phänotyps hinweist.

Eine Stunde nach der Färbung zeigen DiD-markierte mesenchymale Zellen aus humanem Fett in vitro eine runde Form. Nach 24 Stunden zeigen kultivierte DiD-markierte mesenchymale Zellen eine lange Spindelform, was bestätigt, dass DiD die Adhärenzfähigkeit der Zellen nicht verändert. Die Bildgebung der Knie der osteoarthritischen Tiere acht Wochen nach der Operation zeigt das Vorhandensein der DiD-markierten Zellen vom Tag Null bis zum 70. Tag nach der Injektion.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Stammzelltherapie, um die optimale Routine und Dosierung für die sichere und durchführbare Injektion von mesenchymalen Stammzellen zur Behandlung von Kniearthrose bei Tieren zu bestimmen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie humane mesenchymale Stammzellen mit DiD für die Injektion und das In-vivo-Tracking im chirurgisch induzierten Ratten-KOA-Modell markiert werden.