Schnelle, gezielte Differenzierung der retinalen Pigment epithelialen Zellen aus menschlichen embryonalen oder induzierte pluripotente Stammzellen

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, die Differenzierung von pluripotenten Stammzellen in retinale Pigmentepithelzellen in einer homogenen Schicht effektiv zu steuern. Diese Methode hilft bei der Beantwortung von Fragen im Bereich der Netzhaut- und Augenforschung, z. B. wie sich die Netzhaut entwickelt und wie man ein Stammzell-Krankheitsmodell etabliert. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie schneller und effizienter ist als spontane Methoden.

Bei dieser Methode wird eine Kombination aus Wachstumsfaktoren und kleinen Molekülen verwendet, um die Differenzierung von Stammzellen so zu steuern, dass sie innerhalb von 14 Tagen zu unreifem RPE und nach drei Monaten zu reifem funktionellem RPE werden. Teile des Verfahrens werden von Cassidy Arnold, der stellvertretenden Direktorin des Labors für Stammzellbiologie und -technik an der UC Santa Barbara, demonstriert. Um dieses Verfahren zu beginnen, züchten Sie Stammzellkolonien unter Feeder- und Serum-freien Bedingungen auf ca. 80 % Konfluenz, bevor Sie sie passieren.

Beschichten Sie dann eine 12-Well-Platte gemäß den Empfehlungen des Herstellers mit Hydrogel auf Basis extrazellulärer Matrix und lassen Sie es eine Stunde lang bei Raumtemperatur oder über Nacht bei vier Grad Celsius aushärten. Danach aliquotiert man das Volumen der retinalen Differenzierungsmedien und PBS ohne Kalzium oder Magnesium, die für den Tag Null benötigt werden, und erwärmt sie in einem Wasserbad auf 37 Grad Celsius. Fügen Sie dann die Wachstumsfaktoren zum erwärmten RDM hinzu und bringen Sie EDTA auf Raumtemperatur.

Entfernen Sie bei Bedarf alle differenzierten Kolonien mit einer P10-Pipettenspitze, die auf der Morphologie basiert, aus den Stammzellen, die zur Differenzierung passageiert werden. Sowohl fibroblastische Zellen zwischen den Kolonien als auch die undurchsichtigen Zellen innerhalb der Kolonien weisen auf die differenzierten Zellen hin, die entnommen werden sollen. Die manuelle Entnahme von Zellen ist einer der kritischsten Schritte des Protokolls, da die Aufnahme einer völlig undifferenzierten Stammzellpopulation eine effizientere Anreicherung ermöglicht.

Als nächstes wird eine einzelne Vertiefung einer Sechs-Well-Platte in vier Wells einer 12-Well-Platte geleitet, indem das Medium aus den Stammzellen aspiriert und die Wells einmal mit zwei Millilitern vorgewärmtem PBS gewaschen werden. Aspirieren Sie anschließend das PBS und spülen Sie jede Vertiefung dreimal mit einem Milliliter EDTA pro Vertiefung. Kippen Sie dann die Platte vorsichtig und saugen Sie das EDTA an.

Bewegen Sie die Platte in keiner Weise, um ein vorzeitiges Anheben der Zellen zu vermeiden. Nach der dritten Wäsche wieder einen Milliliter EDTA hinzugeben und die Platte bei Raumtemperatur in der Haube drei bis fünf Minuten inkubieren. Stören Sie die Platte während dieser Inkubation nicht.

Aspirieren Sie anschließend das EDTA und fügen Sie einen Milliliter RDM pro Vertiefung hinzu, die sitzt, plus 0,5 Milliliter zusätzliches Medium. Waschen Sie z. B. eine Vertiefung einer Sechs-Well-Platte mit 4,5 Millilitern RDM, um sie auf vier Vertiefungen einer 12-Well-Platte zu plädieren. Verwenden Sie dann einen Zellschaber, um die Zellen vorsichtig zu lösen.

Zerreiben Sie die Zellen in RDM, indem Sie fünfmal in der Vertiefung auf und ab pipettieren und diesen Schritt schnell abschließen, um ein erneutes Anheften an die Platte zu verhindern. In eine konische Röhre geben. Dissoziieren Sie große Zellklumpen, verzerren Sie jedoch nicht zu einer einzelligen Suspension.

Verteilen Sie die Zellen gleichmäßig in der Pipette und führen Sie diesen Schritt schnell aus, um ein erneutes Anheften an die Platte zu verhindern. Falls gewünscht, verwenden Sie ein Lichtmikroskop, um die Größe der Zellklumpen zu beobachten. Anschließend säen Sie die Zellen auf EZM-beschichteten 12-Well-Platten.

Kippen Sie die Platte hin und her, um die Zellen gleichmäßig in den Wells zu verteilen und legen Sie sie bis zum nächsten Mediumwechsel bei 37 Grad Celsius und 5%CO2 in einen Zellkultur-Inkubator. Bei diesem Verfahren wird eine Sechs-Well-Platte gemäß den Empfehlungen des Herstellers mit wachstumsfaktorreduzierter ECM beschichtet. Eine Stunde bei Raumtemperatur über Nacht bei vier Grad Celsius aushärten lassen.

Aliquotieren Sie dann die benötigte Menge an DPBS und einen Milliliter RDM pro Vertiefung der Anreicherung und erwärmen Sie sie in einem Wasserbad auf 37 Grad Celsius. Bringen Sie das trypsinähnliche Enzym auf Raumtemperatur und erwärmen Sie die erforderliche Menge an RPE-Stützmedium auf 37 Grad Celsius. Fügen Sie danach dem RSM ein antimikrobielles Reagenz und einen ROCK-Inhibitor hinzu, um eine Endkonzentration von 0,5x antimikrobiell und 10 mikromolaren ROCK-Inhibitoren zu erreichen.

Verwenden Sie dieses Medium in den ersten vier bis sieben Tagen, um die Bindung zu verbessern. Als nächstes aspirieren Sie das verbrauchte Medium aus allen Vertiefungen und fügen Sie pro Vertiefung einen Milliliter vorgewärmtes RDM ohne Wachstumsfaktoren hinzu. Falls erforderlich, präparieren und kratzen Sie alle Nicht-RPE-Zellen mit einer P10-Pipettenspitze unter einem Präpariermikroskop ab.

Nach der Dissektion aspirieren Sie RDM und alle Zelltrümmer und waschen sie zweimal mit einem Milliliter vorgewärmtem DPBS pro Well. Fügen Sie anschließend 0,5 Milliliter TDE pro Vertiefung einer 12-Well-Platte hinzu und inkubieren Sie fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Verwenden Sie anschließend einen Zellschaber, um die Zellen vorsichtig von der Platte zu entfernen.

Zerreiben Sie die Zellenzymsuspension vorsichtig, indem Sie drei- bis viermal auf und ab pipettieren, um eine gleichmäßige Suspension zu erhalten. Als nächstes verdünnen Sie die Zellenzymsuspension im Verhältnis eins zu 10 im vorgewärmten RSM ohne ROCK-Inhibitor. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 173 g fünf Minuten lang bei Raumtemperatur.

Nach fünf Minuten aspirieren Sie das Medium aus dem Zellpellet und resuspendieren die Zellen in RSM mit 10 mikromolaren ROCK-Inhibitoren. Als nächstes seihen Sie die Zellen mit einem Nylonnetz-Zellsieb mit 40 Mikrometer Poren ab. Zählen Sie die Anzahl der Zellen mit einem Hämozytometer und berechnen Sie die Konzentration der Zellen in der abgeseihten Lösung.

Anschließend säen die Zellen auf den Wachstumsfaktor-reduzierten, EZM-beschichteten Platten einmal 10 auf die fünf Zellen pro Quadratzentimeter in vier Millilitern RSM mit 10 mikromolaren ROCK-Inhibitoren. Ersetzen Sie das RSM 48 Stunden nach der Zellaussaat durch einen 10-mikromolaren ROCK-Inhibitor und ersetzen Sie das Medium weiterhin alle drei bis vier Tage. Beenden Sie die Zugabe von ROCK-Inhibitoren zum RSM nach vier bis sieben Tagen.

Lassen Sie die Zellen 28 bis 35 Tage bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2 reifen und ersetzen Sie das RSM weiterhin alle drei bis vier Tage. Hier sind die induzierten pluripotenten Stammzellen unmittelbar vor dem Passagieren zur Differenzierung dargestellt. Die Stammzellen sind klein und dicht gepackt in den Kolonien, die keine differenzierten Zellen wie Fibroblasten zwischen den Kolonien oder undurchsichtige Passagen innerhalb der Kolonien zu enthalten scheinen.

Hier sind die unreifen RPE-Zellen am zweiten Tag. Die Zellen sollten in diesem Stadium noch subkonfluent sein und Projektionen in die leeren Räume zwischen den Zellen ausdehnen. Diese Zellen werden am 14. Tag vor der Entnahme genommen, um die Anreicherung zu entfernen.

Zellen ohne RPE werden als Patches oder undurchsichtige Farbbänder angezeigt. Das runde Pflaster enthält Zellen mit einer fibroblastischen Morphologie, während man annimmt, dass es sich bei den undurchsichtigen Pflastern um die neuronale Netzhaut handelt. Diese Bilder zeigen RPE bei Passage Null, eins und drei an Tag 30.

Bei jeder Passage sollten die Zellen konfluent sein und die Merkmale einer retinalen pigmentierten Epithelmorphologie aufweisen, einschließlich phasenheller Ränder und einer polygonalen Form. Einmal gemeistert, können die Passaging- und Anreicherungstechniken je nach Größe der Zellkultur in ein bis zwei Stunden abgeschlossen werden. Im Anschluss an dieses Verfahren können Techniken wie die Gen- oder Proteinquantifizierung und funktionelle Assays verwendet werden, um Fragen zur Fähigkeit von RPE zur Sekretion von Wachstumsfaktoren oder zur Phagozytose äußerer Segmente zu beantworten.

Die von Dave Buchholz im Jahr 2013 und Lindsay Leach im Jahr 2015 veröffentlichten Arbeiten beschreiben die Entwicklung und Optimierung dieser Methode. Wir haben jeden Schritt des Verfahrens detailliert und gründlich demonstriert, um es den Forschern vor Ort leicht zugänglich zu machen. Viel Spaß beim Experimentieren.