Mikroinjektion CRISPR/Cas9 Protein in Channel Catfish, Ictalurus Punctatus, Embryonen für Gene Editing

Mikroinjektion von CRISPR/Cas9-Protein in Kanalwels-Embryonen von Ictalurus punctatus für die Geneditierung. Die Entwicklung eines zuverlässigen und effizienten Protokolls für die gezielte Gen-Editierung bei Kanalwelse ist entscheidend für die Erforschung der funktionellen Genomik. Vor allem, nachdem die genomischen Ressourcen durch die Sequenzierung des Genoms des Kanalwelses angereichert wurden.

Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll für die CRISPR/Cas9-Genomeditierung bei Kanalwelsen vor. Dieses Protokoll wurde entwickelt und validiert, indem es auf zwei immunverwandte Gene von Kanalwelsen abzielt. Das Toll/Interleukin-1-Rezeptordomäne, das das Adaptermolekül oder TICAM1-Gen enthält, und das Rhamnose-bindende Lektin oder RBL-Gen.

Alle Verfahren wurden in der Forschungsabteilung für Fischgenetik des EW Shell Fisheries Research Center an der Auburn University in Alabama durchgeführt. Auswahl des Brutbestandes und Laichen. Wählen Sie einen gesunden Kanalwelsbrut aus einem Stamm oder einer genetischen Linie, die Sie bearbeiten möchten.

Kanalwels-Männchen und -Weibchen sollten gute sekundäre Geschlechtsmerkmale aufweisen. Wählen Sie Rüden aus, die einen breiten, muskulösen Kopf haben, der breiter ist als der Rest ihres Körpers, mit einer gut entwickelten Genitalpapilla. Dunkle Farbe und vernarbte Wunden von Revierkämpfen sind ebenfalls Zeichen sexueller Bereitschaft.

Wählen Sie Weibchen aus, deren Köpfe schmaler sind als der Rest ihres Körpers und die einen weichen, tastbaren, gut abgerundeten Hinterleib haben. Aus Gründen der Genauigkeit und um zu vermeiden, dass die Fische beim ersten Umgang gestresst werden, hören Sie zwei bis drei Tage vor der Untersuchung ihrer Laichbereitschaft mit der Fütterung der Weibchen auf. Der Umgang mit den Fischen sollte schnell, aber vorsichtig erfolgen, um den Handhabungsstress zu reduzieren.

Alle Eingriffe, die den Umgang mit den Weibchen erfordern, sollten durchgeführt werden, während die Fische in Laichsäcken gehalten werden. Ermitteln Sie kurz vor der Hormoninjektion das Körpergewicht der Weibchen. Laichsäcke mit Weibchen können dann in einem Durchflussbecken mit kontinuierlichem Wasserfluss und ausreichender Belüftung aufgehängt werden.

Belasten Sie den Implantator mit einer 14-Gauge-Nadel aseptisch mit 85 Mikrogramm pro Kilogramm luteinisierendem Hormon, das das Hormon freisetzt. LHRHA. Spülen Sie die Injektionsstelle und die Rückenmuskulatur vor der Injektion mit 0,9%iger steriler Kochsalzlösung. Setzen Sie den Implantator in einem Winkel von 45 Grad ein und lösen Sie das Implantat.

Ziehen Sie die Nadel zurück und wischen Sie die Injektionsstelle mit einer Watte ab, die zuvor mit 70 % Ethanol getränkt war. Legen Sie den Ablaichsack so in das Fäkalienbecken, dass der Fisch 15 bis 20 Zentimeter unter der Wasseroberfläche vollständig in Wasser getaucht ist. Eine ausreichende Belüftung mit fünf oder mehr Teilen pro Million gelöstem Sauerstoff und eine gute Wasserqualität sind wichtig für den Eisprung von qualitativ hochwertigen Eizellen.

Prognostizieren Sie die Ovulationszeit basierend auf der Wassertemperatur unter Verwendung der Grad-Stunden-Beziehung. In der Regel erfolgt die erste Kontrolle auf Eizellen etwa 36 Stunden nach der Hormoninjektion und dann im Abstand von vier Stunden. Um den Eisprung zu überprüfen, hebe den Laichsack vorsichtig über die Wasseroberfläche, während du nach den Eiern suchst, die an der Innenseite des Beutels befestigt sind.

Wenn Sie mindestens 10 Eier oder so sehen, hat dieses Weibchen einen Eisprung und ist bereit zum Ausziehen von Hand. Vorbereitung von Sperma. Die Spermien können einige Stunden vor dem erwarteten Eisprung aufbereitet werden.

Die männlichen Fische werden eingeschläfert und die Hoden in einer kleinen Waagschale gesammelt. Bestimme das Gewicht der Hoden. Entfernen Sie jegliches Taschentuch und waschen Sie die Hoden mit einer 0,9%igen Kochsalzlösung, um bei Bedarf Blut zu entfernen.

Die gut entwickelten Hoden sind weiß mit vielen zottenförmigen Vorsprüngen. Zerkleinern Sie die Hoden und filtern Sie das Sperma mit einem 100-Mikron-Netz. Verwenden Sie 0,9%ige Kochsalzlösung, um das Sperma aus dem Netz in ein 50-Milliliter-Röhrchen zu waschen.

Kochsalzlösung kann bis zu 10 Milliliter pro Gramm Hoden zugegeben werden. Bestimmen Sie die Konzentration der Spermien. Überprüfen Sie die Beweglichkeit und Lebensfähigkeit.

Für diese Eingriffe ist dies jedoch nicht notwendig, wenn die Hoden gut entwickelt sind. Das Sperma kann dann bei vier Grad C gelagert werden und sollte innerhalb von 24 Stunden nach der Aufbereitung verwendet werden. Eizellentnahme und Befruchtung.

Tragen Sie eine sehr dünne Schicht Gemüsefett auf eine saubere, trockene Laichschale mit einem Durchmesser von 20 Zentimetern auf. Legen Sie das Weibchen in eine Narkoselösung, die 100 ppm gepuffertes Tricainmethansulfonat mit Natriumbicarbonat enthält, bis der Fisch vollständig betäubt ist. Nehmen Sie den Fisch vorsichtig aus dem Laichsack und tauchen Sie ihn in 0,9 % Kochsalzlösung, um das Betäubungsmittel abzuwaschen.

Trocknen Sie den Fisch mit einem sauberen Handtuch vollständig ab, um die Entfernung der Schleimschicht auf der Oberfläche des Fischkörpers zu vermeiden. Tragen Sie pflanzliches Backfett auf den Bereich um die Entlüftung einschließlich der Bauchflossen auf, um die Anhaftung der Eier während des Abstreifens von Hand zu ermöglichen. Die Eier mit der Hand in die gefettete Laichschale abstreifen, indem man leichten Druck auf die Eierstöcke ausübt.

Gute Eier sollten frei fließen, goldgelb gefärbt sein und nur minimale oder keine Klumpen oder Blutgerinnsel aufweisen. Vermeiden Sie vor der Befruchtung den Kontakt zwischen den Eiern und dem Wasser, da Wasser den Mikropylenverschluss stimulieren kann. Um die Eier für die Mikroinjektion zu befruchten, auf 200-300 Eier in eine gefettete Laichschale umfüllen.

Geben Sie ein bis zwei Milliliter der Samenlösung zu den Eizellen und mischen Sie sie vorsichtig. Geben Sie frisches Wasser zu den Eizellen, um die Spermien und Eizellen zu aktivieren. Es sollte so viel Wasser hinzugefügt werden, dass die Eier leicht bedeckt sind.

Die Eier 30 Sekunden lang vorsichtig schwenken. Die Befruchtung sollte in ein bis zwei Minuten erfolgen. Es ist wichtig, die Eier in einer einzigen Schicht zu befruchten.

Welseier haften aneinander, was es schwierig macht, mehrere Schichten von Embryonen zu injizieren. Gib mehr frisches Wasser zu den befruchteten Eiern und lass die Eier 10 bis 15 Minuten aushärten. Die restlichen unbefruchteten Eizellen können mit einem feuchten Handtuch abgedeckt werden, um ein Austrocknen zu verhindern, und können über einige Stunden befruchtet werden.

Die Befruchtung kann gestaffelt erfolgen. Alle 30 bis 60 Minuten kann eine Charge von zwei bis 300 Eizellen befruchtet werden, um die kontinuierliche Versorgung mit Embryonen im One-Cell-Stadium für die Mikroinjektion zu gewährleisten und nicht injizierte Embryonen zu kontrollieren. Nadelziehen und Laden.

Ziehen Sie eine Kapillare aus Borosilikatglas mit einem Außendurchmesser von einem Millimeter in zwei Nadeln. Bewahren Sie die Nadeln in einer Pappschachtel mit einem Stück Schwamm auf, in dem mehrere Schnitte gemacht wurden. Um ein Brechen der Nadel zu vermeiden, sollte der Durchmesser des Schwamms kleiner sein als die Länge des Nadelstiels.

Die Nadelspitze kann dann geöffnet werden, indem ein kleines Stück der Nadel im feinsten Bereich mit einem scharfen Gegenstand gebrochen wird. Alternativ kann die Nadel geöffnet werden, indem der dünnste Bereich der Spitze mit einer Pinzette unter dem Mikroskop abgekniffen wird. Bereiten Sie die Injektionslösung vor, indem Sie Leit-RNAs mit Cas9-Protein mischen.

Phenolrot kann hinzugefügt werden, um den Guide-RNA-Cas9-Proteinmix zu färben, wobei Phenolrot bis zu einem Drittel des Gesamtvolumens ausmacht. Die Mischung wird dann vor der Verwendung 10 Minuten lang auf Eis inkubiert. Laden Sie mit einem Mikrolader 5-10 Mikroliter des Guide-RNA-Cas9-Gemisches in die Injektionsnadel.

Indem Sie den Mikrolader in den Nadelstiel einführen und die Mischung langsam ausstoßen, während Sie die Spitze des Mikroladers zurückziehen. Vermeiden Sie es, Luftblasen im Inneren einzuschließen. Befestigen Sie die Nadel an der Mikropipettenhalterung und sorgen Sie für eine feste Verbindung.

Und dann befestigen Sie die Halterung am Mikromanipulator. Sorgen Sie für freie und stabile Bewegung. Üben Sie Druck für die Mikroinjektion aus, indem Sie die Stickstoffflasche öffnen und den Druckregler einstellen.

Das Injektionsvolumen kann durch den Druck, den Durchmesser der Nadelöffnung und die Dauer der Injektion beeinflusst werden. Um das Volumen zu bestimmen, das Sie injizieren möchten, injizieren Sie es in einen Tropfen Mineralöl, der auf ein Hämozytometer gegeben wird. Bei Bedarf können der Druck und der Nadeldurchmesser angepasst werden, um das Volumen der Injektion zu erhöhen oder zu verringern.

Mehrmals in das Mineralöl injizieren, um ein gleichmäßiges Volumen zu gewährleisten. Mikroinjektion von Welsembryonen. Tragen Sie eine sehr dünne Schicht pflanzliches Backfett auf eine 100 Millimeter saubere Petrischale auf.

Übertragen Sie 50 bis 100 Eier aus der Befruchtungsschale in die Petrischale und bedecken Sie sie mit Holtfreter-Lösung. Die Eier sollten in einer einzigen Schicht gegeneinander ausgerichtet werden. Diese Ausrichtung sollte die Eier während des Mikroinjektionsprozesses an Ort und Stelle halten.

Stellen Sie die Petrischale mit den Eiern auf den Tisch des Mikroskops und halten Sie sie mit einer Hand fest. Senke die Nadel mit der anderen Hand ab, bis sie das Chorion und das Eigelb in einer einzigen, gleichmäßigen Bewegung durchsticht. Die Spitze der Nadel sollte sich so nah wie möglich an der Blastoscheibe befinden, bevor das Injektionsmaterial abgegeben wird.

Treten Sie auf das Pedal und geben Sie das Injektionsmaterial in das Eigelb. Wenn die Blastoscheibe nicht deutlich sichtbar ist, kann das Injektionsmaterial an verschiedenen Stellen im Eigelb verteilt werden. Dazu wird die Nadel an das hintere Ende des Eigelbs eingeführt.

Drücken Sie dann das Pedal und ziehen Sie gleichzeitig die Nadel zurück. Dadurch wird das Injektionsmaterial an verschiedenen Stellen im Eigelb verteilt. 50 Nanoliter mit 2,5 Nanogramm Guide-RNA und 7,5 Nanogramm Cas9-Protein können problemlos in das Eigelb injiziert werden.

Ziehen Sie die Nadel sanft zurück, um das Ei nicht zu beschädigen. Bewegen Sie dann die Petrischale, um ein weiteres Ei mit dem gleichen Verfahren zu injizieren. Vermeiden Sie Bewegungen der Petrischale während des Injektionsvorgangs, da dies das Ei beschädigen oder die Nadel brechen kann.

Entferne die Eizellen, die durch die Mikroinjektion geplatzt oder beschädigt wurden. Die Injektion kann 15 bis 20 Minuten nach der Befruchtung begonnen werden und so lange fortgesetzt werden, wie sich die Embryonen noch im Einzelzellstadium befinden. Die injizierten Embryonen werden wieder in die Holtfreter-Lösung mit 10 ppm Doxycyclin gelegt und sechs bis sieben Tage lang kontinuierlich belüftet, bis sie schlüpfen.

Die Lösung wird täglich gewechselt und tote Embryonen werden entfernt. Befund. Diese Abbildung zeigt die CRISPR/Cas9-induzierten Mutationen im TICAM1-Gen von Kanalwelsen. Die blaue Sequenz repräsentiert das Protospacer-benachbarte Motiv oder PAM, während die grüne Sequenz das Ziel für die geführte RNA darstellt.

Es wurde erwartet, dass ein durch das Cas9-Protein induzierter Doppelstrangbruch an der Stelle der beiden roten Dreiecke auftritt. Deletionsmutationen werden durch eine Strichlinie dargestellt, in der jeder Strich einem Nukleotid entspricht, das deletiert wurde. Rote Sequenzen sind Insertionen, während violette Sequenzen die Substitutionsmutation darstellen.

Fraktionen von 78 stellen die Anzahl der mutierten Allele in 78 Sequenzierungsreaktionen dar. Zum Beispiel bedeutet 3/78, dass ein Allel in drei Sequenzierungsreaktionen von insgesamt 78 Reaktionen nachgewiesen wurde. Die Mutationsrate betrug 79,2 % bei 24 analysierten Personen.

Mutationen führten dazu, dass einige zu viele Aminosäuren aus dem Protein entfernt wurden, was den nachgeschalteten Leserahmen veränderte und die Translation vorzeitig beendete. Bei den meisten Mutationen waren mehr als 80 % der von TICAM1 vorhergesagten Proteinsequenz aufgrund eines vorzeitigen Stoppcodons verkürzt. Diese Abbildung zeigt CRISPR/Cas9-induzierte Mutationen im RBL-Gen von Kanalwelsen.

Exonische Sequenzen werden groß geschrieben, während intronische Sequenzen Kleinbuchstaben sind. Blaue Sequenzen stellen das an den Protospacer angrenzende Motiv dar, während die grüne Sequenz das Ziel für die geführte RNA darstellt. Es wurde erwartet, dass ein durch das Cas9-Protein induzierter Doppelstrangbruch an der Stelle der beiden roten Dreiecke auftritt.

Deletionsmutationen werden durch eine Strichlinie dargestellt, in der jeder Bindestrich einem Nukleotid entspricht, das deletiert wurde. Rote Sequenzen sind Einfügungen. Fraktionen von 40 stellen die Anzahl der mutierten Allele in 40 Sequenzierungsreaktionen dar.

2/40 bedeutet beispielsweise, dass ein Allel in zwei Sequenzierungsreaktionen von insgesamt 40 Reaktionen nachgewiesen wurde. Die Mutationsrate betrug 87,5 % bei 40 analysierten Personen. Die Deletionen reichen von fünf Basenpaaren bis zu 183 Basenpaaren, wobei bis zu 20 Basenpaare eingefügt wurden.

Mehr als 70 % der Indels führten zu einem verkürzten Protein, das 10 % oder weniger als die Länge des Wildtyp-Proteins betrug. In diesem Video haben wir gezeigt, wie man CRISPR/Cas9-Protein in einen Zellkanal von Welsembryonen injiziert. Die beschriebenen Verfahren sind einfach, schnell und effizient.

Und es gelang ihm, einen Gen-Knockout in zwei Kanalwels-Genen zu erreichen. TICAM1 und RBL. Je nachdem, was injiziert wird, kann das Protokoll geändert werden, um andere biologisch aktive Substanzen einzubeziehen.

Es kann auch modifiziert werden, um andere Welsarten oder andere Fischarten mit ähnlicher Eistruktur und -zusammensetzung zu mikroinjizieren.