Konstruktion und Evaluation eines murinen Calvarial Osteolyse-Modells durch die Einwirkung von CoCrMo Partikel in aseptischen Lockerung
17. Februar 2018
Dieses Manuskript beschreibt einen murinen calvarial Osteolyse Modell durch die Einwirkung von CoCrMo Partikel, die ideale Tiermodell für die Beurteilung der Wechselwirkungen zwischen Abriebpartikeln und verschiedenen Zellen in aseptischen Lockerung darstellt.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, das murine Calvarial Osteolysis Model durch Exposition gegenüber Kobalt-Chrom-Molybdän-Nanopartikeln zu konstruieren und zu bewerten. Die durch Verschleißpartikel induzierte Osteolyse ist eine der Hauptursachen für die aseptische Lockerung beim Versagen der Endoprothetik, aber die zugrunde liegende Mechanik ist unklar. Aufgrund der langen Nachbeobachtungszeit und des sporadischen Auftretens ist es schwierig, die parthogenese der aseptischen Lockerung in klinischen Fällen zu erforschen.
Daher ist ein Verschleißtiermodell für weitere Studien erforderlich. In unserem Labor ist ein muriales Schädeldach-Osteolysemodell, das aus Kobaltlegierungspartikeln konstruiert wurde, ein effektives Modell zur Untersuchung der Parthogenese der aseptischen Lockerung. Dies wird erreicht, indem zunächst nanoskalige Kobalt-Chrom-Molybdän-Partikel aus einer Kobaltlegierungsprothese erzeugt und in Phosphatpuffersalzlösung in einer Konzentration von 15 Milligramm pro Milliliter wieder suspendiert werden.
Der nächste Schritt besteht darin, die Schnittposition an einer Linie zwischen den beiden Mittelpunkten zwischen zwei Augen bzw. Ohren zu identifizieren. Entfernen Sie dann das kraniale Periost durch Schockdissektion aus dem Schädeldach. Nehmen Sie als Nächstes 50 Mikroliter Nanopartikel aus Kobaltlegierungen und betten Sie sie in die mittlere Naht der Schädeldecke ein.
Nach zwei Wochen der Pflege opfern Sie einige Mäuse und sammeln Sie die Schädeldecke für die Osteolyse-Untersuchung. Osteolyse ist bei Mäusen, die mit Kobaltlegierungen als Nanopartikel behandelt wurden, sowohl in Mikro-CT als auch in H- und E-Färbebildern offensichtlich. Erhalten Sie eine Kobalt-Chrom-Molybdän-Legierung aus einer Kobaltlegierungsprothese, erhalten Sie Kobalt-Chrom-Molybdän-Partikel aus einer Kobalt-Chrom-Molybdän-Legierung durch hergestellten Hochvakuum-Gleichstrom mit drei Elektroden.
Um den mittleren Durchmesser der Kobalt-Chrom-Molybdän-Partikel zu quantifizieren, wird ein Milligramm Partikel in 1,5 Milliliter wasserfreies Ethanol gegeben und durch Ultraschallschütteln suspendiert. Tragen Sie einen Tropfen, etwa 20 Mikroliter, der Suspension auf den Objektivtisch der Transmissionselektronenmikroskopie auf und nehmen Sie eine Reihe von Bildern auf. Verwenden Sie die bereitgestellte Software, um den mittleren Durchmesser und die Partikelgrößenverteilung in TEM-Bildern zu berechnen.
Hier sind repräsentative TEM-Bilder auf der linken Seite, das rechte zeigt die Verteilung der Nanopartikelgröße der Kobalt-Chrom-Molybdän-Legierung, die von unserer kommerziellen Software berechnet wurde. Der mittlere Durchmesser liegt bei etwa 50 Nanometern. Autoklavieren Sie die Partikel 15 Minuten lang, um Endotoxine zu entfernen.
Anschließend werden sie in phosphatgepufferter Kochsalzlösung in einer Konzentration von 15 Milligramm pro Milliliter als Stammlösung wieder suspendiert. Als nächstes folgt die Konstruktion des Schädelbade-Osteolysemodells. Sechs Wochen alte Mäuse auswählen und betäuben: sechs Mäuse pro Gruppe.
Platzieren Sie die Tiere in der besten Position. Entfernen Sie das Fell und desinfizieren Sie die Haut am Schädel mit 75 Prozent Ethanol. Identifizieren Sie für den Schnitt die beiden Mittelpunkte zwischen den beiden Augen bzw. Ohren und schneiden Sie die Haut entlang der Verbindungslinie ein.
Entfernen Sie vorsichtig und vollständig das kraniale Periost durch Schockdissektion aus dem Schädeldach. Eine deutliche Dissektion des Periosts verstärkt die Wechselwirkungen zwischen den Partikeln im Schädeldach. Die Naht wird an beiden Enden des Schnittes vorsichtig in einer einfachen unterbrochenen Naht durchgeführt.
In der Regel werden drei Stiche für eine vollständige Naht benötigt. Führen Sie im letzten Schritt die Nahtlinie ohne Verknoten durch den Schnitt und halten Sie beide Enden der Nahtlinie. Nehmen Sie 15 Mikroliter Nanopartikel aus der Stammlösung aus einer Kobaltlegierung und betten Sie sie in die mittlere Naht des Schädeldachs ein.
Verknoten Sie den letzten Stich in einer einfachen, unterbrochenen Naht. Pflegen Sie die Mäuse für weitere zwei Wochen. Zwei Wochen später opferst du das Tier und entfernst den Schädeldach
.Entfernen Sie vorsichtig das gesamte Weichgewebe auf Schädeldachproben mit einer Pinzette und fixieren Sie das Gewebe mit vier Prozent Paraformaldehyd bei vier Grad Celsius. Für die Osteolysebewertung im Kobalt-Chrom-Molybdän-Nanopartikel-induzierten Modell führen Sie 24 Stunden vor der Mikro-CT-Untersuchung eine hochauflösende Mikro-CT durch. Übertragen Sie Proben aus der Kalvaria in phosphatgepufferte Kochsalzlösung aus Paraformaldehyd.
Entnehmen Sie am Tag der Mikro-CT-Untersuchung Schädeldachproben aus phosphatgepufferter Kochsalzlösung und befestigen Sie sie auf einem Halter, der mit einem Instrument verbunden ist. Scannen Sie die Schädeldecke auf einem Mikro-CT-Instrument. Führen Sie eine dreidimensionale Rekonstruktion mit verschiedener Software durch.
Die H- und E-Färbung ist ein weiteres Werkzeug für die Osteolysebewertung in einem Nanopartikel-induzierten Modell. Entkalken Sie Schädeldachproben in der phosphatgepufferten Kochsalzlösung, die 15 Prozent Ehylendiaminetetraessigsäure enthält, drei Wochen lang bei vier Grad Celsius. Betten Sie die entkalkten Schädelflächen in Paraffin ein und schneiden Sie sie im Bereich der Partikelabscheidung in zwei Mikrometerabschnitte.
Färben Sie die Abschnitte mit Hämatoxylin und Eosin. Beobachten Sie den gesamten Durchgangsmorphismus und die Lichtmikroskopie und machen Sie Mikroskopaufnahmen. Hier finden Sie repräsentative Mikro-CT-Bilder.
Dreidimensionale Rekonstruktionsbilder von Mikro-CT-Daten werden im linken Bereich angezeigt. Im rechten Bereich sind Schnittbilder von Mäusen mit Kontrolle, Scheinbetrieb und Nanopartikeln zu sehen. Die Osteolyse ist in der Nanopartikel-Behandlungsgruppe naheliegend.
Hier ist eine quantitative Analyse von Mikro-CT-Fotos mit der zugehörigen Software des Instruments. Zu den Messungen gehören die Knochenmineraldichte, das Knochenvolumen oder das Gesamtvolumenverhältnis, der Prozentsatz der Gesamtporosität, die Trabekelzahl, die Trabekeldicke und der Trabekelabstand oder -abstand. Mäuse, die mit Nanopartikeln aus Kobaltlegierungen behandelt wurden, weisen im Vergleich zu Kontrolltieren eine signifikant geringere Knochenmineraldichte und ein geringeres Knochenvolumen auf, wobei der Anteil der Gesamtporosität höher ist.
Hier sind repräsentative H- und E-Färbebilder für Kalvarienbergproben von Kontroll-, Scheinoperations- und Nanopartikel-behandelten Mäusen. Auch die Osteolyse ist in der Nanopartikel-Behandlungsgruppe naheliegend. Maus-Schädeldach-Osteolysemodelle, die aus Nanopartikeln aus Kobaltlegierungen konstruiert wurden, haben eine hohe Erfolgsquote bei der Modellierung der durch Verschleißpartikel induzierten Osteolyse.
Im Folgenden sind einige Schlüsselfaktoren aufgeführt. Erstens verbessern die Nanopartikel aus Kobaltlegierungen die Wechselwirkung zwischen Verschleißpartikeln und Schädeldach. Zweitens intensiviert eine adäquate Freilegung der Schädeldecke und eine klare Dissektion des Periosts die Wechselwirkung zwischen Partikeln und Schädelbad.
Drittens erleichtern quantitative Messungen des Knochenverlusts mittels Mikro-CT den Zugang zu den Unterschieden im Knochenverlust zwischen verschiedenen Behandlungen und liefern uns einen soliden Beweis für die Osteolyse im Vergleich zur traditionellen Knochenhistomorphometrie. Das Verschleiß-Calvaria-Osteolysemodell, das aus Kobaltlegierungspartikeln konstruiert ist, ist ein ideales Modell, um die Wechselwirkung zwischen Verschleißpartikeln und verschiedenen Zellen bei der aseptischen Lockerung zu untersuchen. Wie Mikrophagen, Fibroblasten, Osteoklasten und Osteoblasten.
Wir hoffen, dass unser Modell in Zukunft für die Studie zur aseptischen Lockerung hilfreich sein wird.
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Übersicht
Dieser Artikel beschreibt ein murines Kalotten-Osteolyse-Modell durch Exposition gegenüber Kobalt-Chrom-Molybdän-Nanopartikeln, das ein ideales Tiermodell zur Beurteilung der Wechselwirkungen zwischen Abriebpartikeln und verschiedenen Zellen bei aseptischer Lockerung darstellt. Dieses Modell ist entscheidend für das Verständnis der Pathogenese der mit dem Versagen einer Arthroplastik assoziierten Osteolyse.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Biologie
- Orthopädie
Hintergrund
- Partikelinduzierte Osteolyse ist eine wesentliche Ursache für die aseptische Lockerung von Gelenkendoprothesen.
- Die Mechanismen, die diesem Prozess zugrunde liegen, sind noch nicht vollständig geklärt.
- Klinische Studien stoßen aufgrund langer Nachbeobachtungszeiten und seltener Auftretenshäufigkeit auf Schwierigkeiten.
- Ein zuverlässiges Tiermodell ist für weitere Untersuchungen unerlässlich.
Zweck der Studie
- Aufbau und Evaluierung eines murinen Kalotten-Osteolysemodells.
- Untersuchung der Interaktionen zwischen Kobalt-Chrom-Molybdän-Partikeln und verschiedenen Zellen.
- Verbesserung des Verständnisses der Pathogenese der aseptischen Lockerung.
Verwendete Methoden
- Erzeugung von nanoskaligen Kobalt-Chrom-Molybdän-Partikeln aus einer Kobaltlegierungsprothese.
- Re-Suspension der Partikel in phosphatgepufferter Kochsalzlösung bei einer Konzentration von 15 mg/mL.
- Aussetzung von murinem Schädeldachgewebe den Partikeln gegenüber.
- Beurteilung der zellulären Wechselwirkungen und osteolytischen Reaktionen.
Hauptergebnisse
- Das murine Modell bildet die durch Abriebpartikel induzierte Osteolyse effektiv ab.
- Die Wechselwirkungen zwischen Partikeln und Zellen wurden erfolgreich bewertet.
- Die Ergebnisse tragen zum Verständnis der Mechanismen der aseptischen Lockerung bei.
- Dieses Modell kann für zukünftige Studien zur Arthroplastieversagen verwendet werden.
Schlussfolgerungen
- Das murine Kalotten-Osteolysemodell ist ein wertvolles Werkzeug für die Forschung.
- Es liefert Einblicke in die Pathogenese der Osteolyse.
- Dieses Modell kann helfen, Strategien zur Minderung der aseptischen Lockerung zu entwickeln.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die durch Verschleißpartikel verursachte Osteolyse bleibt eine Hauptursache für die aseptische Lockerung bei Gelenkersatzversagen, doch das mechanistische Verständnis ist durch Einschränkungen klinischer Studien begrenzt. Das murine Kalottenmodell bietet ein schnelles, quantifizierbares System zur Bewertung der Wechselwirkungen zwischen Partikeln und Zellen und ermöglicht die präklinische Risikominderung von Biomaterialien und Implantatdesigns. Dies unterstützt die Zielvalidierung und schafft Vorhersagesicherheit in frühen orthopädischen F&E-Pipelines.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen bezüglich der Wechselwirkungen von Abriebpartikeln mit Makrophagen, Fibroblasten, Osteoblasten und Osteoklasten.
- Operativer Wert: Erleichtert die biologische Risikominimierung durch quantitative Beurteilung des Knochenverlusts mittels Mikro-CT und histomorphometrischer Analyse.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die Priorisierung von Entwicklungsprojekten, indem osteolytische Reaktionen modelliert werden, um die Auswahl von Implantatmaterialien zu informieren.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Erzeugt standardisierte biologische Endpunkte (Knochendichte, trabekuläre Parameter) zur Bewertung von Verbindungen oder Beschichtungen.
- Reproduzierbarkeit: Hohe Erfolgsrate und geringe Variabilität ermöglichen eine skalierbare Untersuchung von Partikelmodifikationen.
- Plattformnutzen: Kompatibel mit transgenen bzw. Knockout-Modellen, um mechanistische Signalwege der Osteolyse zu untersuchen.
Translationale und präklinische Forschung
- Klinische Relevanz: Modelliert die Pathogenese einer aseptischen Lockerung, um Entdeckung und präklinische Validierung zu verbinden.
- Mechanistische Entwicklungsrisikoreduktion: Klärt die zellulären und molekularen Signalwege, die die Osteolyse antreiben, zur Priorisierung von Wirkstoffzielen.
- Translationale Kontinuität: Bietet quantitative Endpunkte (Knochenvolumen, Porosität), die die In-vivo-Leistung von Implantaten vorhersagen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Das Modell fügt sich in die Kontinuum von der Entdeckung bis zur präklinischen Phase ein und ermöglicht die Hypothesenprüfung in der frühen Entdeckungsphase, die Assay-Entwicklung für das Screening sowie die mechanistische Bewertung vor der Identifizierung von Leitstrukturen.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung hinsichtlich partikelinduzierter entzündlicher und osteolytischer Signalwege.
- Screening: Liefert quantitative, standardisierte Messgrößen (Mikro-CT-Knochenparameter) für eine zuverlässige Beurteilung von Substanzen oder Biomaterialien.
- Analytik: Erzeugt messbare Ergebnisse (Knochendichte, trabekuläre Dicke, Porosität), um experimentelle Bedingungen zu vergleichen.
- Translationale Forschung: Verbindet die Exposition gegenüber Partikeln mit osteolytischen Ergebnissen und unterstützt damit Entscheidungen über die präklinische Weiterentwicklung.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform zur Bewertung unterschiedlicher Abriebpartikel und Implantatbeschichtungen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Zielvalidierung, indem mechanistische Unklarheiten bei partikelinduzierter Osteolyse reduziert werden.
- Operativer Wert: Gewährleistet Standardisierung und Reproduzierbarkeit durch definierte Partikelexposition und quantitative Evaluierungsprotokolle.
- Strategischer Wert: Verbessert Go/No-Go-Entscheidungen, indem frühzeitige biologische Risikobewertungen von Implantatmaterialien bereitgestellt werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Biomaterialien basierend auf ihrem osteolytischen Potenzial.
Umsetzungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der chirurgischen Versorgung von Nagern, der Handhabung von Partikeln und der Mikro-CT-Bildgebung.
- Abhängig von der Instrumentierung zur Partikelerzeugung (Hochvakuum-DC-Elektrode), zur Herstellung der Suspension und zur Quantifizierung der Osteolyse.
- Setzt eine standardisierte Vorgehensweise über mehrere Arbeitsgruppen hinweg für die Partikeldosierung, chirurgische Technik und Analyseabläufe voraus.
- Zu berücksichtigende Anpassungsaspekte sind die Eignung des Modells zur Beurteilung der Chronizität und für Studien zur mechanischen Belastung.
- Praktische Einschränkung: Es können keine Effekte mechanischer Kräfte oder langfristiger chronischer Partikelexposition gemäß dem Ausgangsmaterial bewertet werden.
