Hochauflösender Fluoreszenz In Situ Hybridisierung in Drosophila Embryos und Gewebe mit Tyramide Signalverstärkung

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, RNA-Transkripte zu detektieren, die in Zellen und Geweben vorhanden sind. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen in der Zell- und Entwicklungsbiologie zu beantworten, z. B. wo sich in einer Zelle, einem Gewebe oder einem Embryo eine RNA befindet. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie räumliche RNA-Verteilungen sowohl mit hoher Auflösung und Empfindlichkeit als auch zu geringen Kosten im Vergleich zu anderen Methoden detektiert.

Wir haben dieses Protokoll ursprünglich entwickelt, um die subzellulären Verteilungen für so viele Drosophila-RNAs wie möglich zu untersuchen. Dies geschah, um das Ausmaß und die Diversität der subzellulären Verteilungen zu bestimmen. Wir begannen das Projekt mit Embryonen, passten aber später das Protokoll an und optimierten es, so dass wir im Hochdurchsatz mit Geweben arbeiten konnten, die von Larven und Fliegen präpariert wurden.

Der schwierigste Aspekt des Verfahrens ist die Anzahl der Schritte und das daraus resultierende Fehlerpotenzial sowie die Notwendigkeit, die Abwesenheit von RNAs während der Sondenherstellung sicherzustellen. Um den Durchsatz und die Kosteneffizienz zu verbessern, werden bei den in diesem Video gezeigten Verfahren 96-Well-Mikrotiterplatten für alle Schritte verwendet. Es ist auch einfach, diese Methode an kleinere Probenelemente anzupassen, indem die Platten in Acht- oder 12-Well-Streifen geschnitten werden.

Beginnen Sie damit, 10 Mikroliter einer Bakterienkultur über Nacht in 90 Mikrolitern autoklaviertem, doppelt destilliertem Wasser in jeder Vertiefung einer neuen 96-Well-PCR-Platte zu verdünnen. Denaturieren Sie die DNA bei 95 Grad Celsius in einem Thermocycler für fünf Minuten. Stellen Sie den Teller sofort für mindestens fünf Minuten auf Eis.

Richten Sie die PCR-Reaktionen in einer neuen 96-Well-PCR-Platte ein. Verwenden Sie die entsprechenden Universalprimer und aliquotieren Sie 48 Mikroliter des PCR-Mastermixes in jede Vertiefung. Fügen Sie zwei Mikroliter jeder denaturierten Plasmid-DNA-Vorlage pro Vertiefung hinzu.

Führen Sie die Amplifikation in einem 96-Well-PCR-Gerät durch. Wenn die Amplifikation abgeschlossen ist, fällen Sie das PCR-Produkt mit einer Ethanol-Natriumacetat-Mischung aus. Lagern Sie die Proben 30 Minuten lang bei minus 80 Grad Celsius.

Zentrifugieren Sie die 96-Well-Platte bei 2.250 g bei vier Grad Celsius für 45 bis 60 Minuten. Entfernen Sie mit einer Achtkanal-Vakuum-Verteilerpipette, die eine Struktur aufweist, die verhindert, dass die Spitzen beim Aufsaugen der Pellets auf den Boden der Vertiefungen gelangen, und entfernen Sie vorsichtig den Überstand. Einmal mit 160 Mikrolitern kaltem 70%igem Ethanol waschen.

Zentrifugieren Sie bei 2.250 mal g bei vier Grad Celsius für 10 Minuten. Drehen Sie die 96-Well-Platte vorsichtig auf einem Papiertuch um, um die letzten Tropfen Flüssigkeit aus jeder Vertiefung zu entfernen, und trocknen Sie die DNA-Pellets eine Stunde lang bei Raumtemperatur an der Luft. Resuspendieren Sie die gefällte DNA in 25 Mikrolitern RNase-freiem Wasser.

Überprüfen Sie die Größe und Ausbeute der PCR-Produkte durch Agarose-Gelelektrophorese. Richten Sie die In-vitro-Transkriptionsreaktionen ein, indem Sie die entsprechenden Komponenten in einer neuen 96-Well-PCR-Platte zu jeder Vertiefung hinzufügen. Geben Sie 7,5 Mikroliter DNA-Template in jede entsprechende Vertiefung

Decken Sie die Platte mit Dichtungsband ab. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius für 3-1/2 bis vier Stunden. Fügen Sie als Nächstes zu jeder Vertiefung einen Mastermix hinzu, der aus DEPC-behandeltem doppelt destilliertem Wasser, 100 % Ethanol und drei molaren Natriumacetat besteht.

Bei minus 80 Grad Celsius 30 Minuten lagern. Zentrifugieren Sie die Platte und waschen Sie die Vertiefungen wie zuvor gezeigt. Die gefällte Sonde wird in 25 Mikrolitern DEPC-behandeltem, doppelt destilliertem Wasser resuspendiert.

Neu synthetisierte Antisense-RNA-Sonden wurden auf ein 1%Agarose-Gel aufgebracht, um ihre Integrität und Ausbeute zu überprüfen. Basierend auf der Intensität des Bandes kann der Ertrag als niedriger Ertrag, typischer Ertrag oder hoher Ertrag charakterisiert werden. Nachdem Sie fünf Mikroliter jeder Sonde für die Agarose-Gelelektrophorese verwendet haben, mischen Sie die restlichen 20 Mikroliter mit 100 Mikrolitern Hybridisierungslösung und lagern Sie sie bis zur Verwendung bei minus 80 Grad Celsius.

Um dieses Verfahren zu starten, legen Sie 20 bis 30 Larven in eine Petrischale, die kaltes PBS in einer Fix-One-Lösung enthält, und kühlen Sie sie zwei Minuten lang auf Eis, um die Beweglichkeit der Larven zu verringern. Präparieren Sie die Larven unter dem Präparierfernrohr. Verwende eine scharfe Pinzette, um den Frontzahn vorsichtig zu öffnen und drücke das Gewebe von hinten nach vorne zusammen.

Nach maximal 15 Minuten wird das präparierte Gewebe zur Fixierung in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen überführt und auf Eis gelegt. Entfernen Sie PBS und fügen Sie 800 Mikroliter Fix-One-Lösung hinzu. Inkubieren Sie 30 Minuten lang auf einem Tischmischer zusammen mit anderen, die zuvor in Fixiertüchern gesammelt wurden.

Spülen Sie das Gewebe einmal mit 800 Mikrolitern PBTT aus und halten Sie das Röhrchen auf Eis, während zusätzliches Gewebe gesammelt und fixiert wird. Bündeln Sie alle präparierten Gewebe in einem einzigen 15-Milliliter-Kunststoffröhrchen, das ein Netz im Röhrchendeckel enthält. Überschüssige Flüssigkeit durch das Netz im Deckel ansaugen.

Mit 10 Millilitern PBTT waschen und mit 10 Millilitern PBS spülen. Um die endogene Meerrettichperoxidase-Aktivität zu stillen, fügen Sie fünf Milliliter 0,3%iges Wasserstoffperoxid in PBS hinzu und inkubieren Sie es 15 Minuten lang bei Raumtemperatur. Zweimal mit 10 Millilitern PBTT waschen.

Permeabilisieren Sie das Gewebe, indem Sie 10 Milliliter vorgekühltes 80%iges Aceton hinzufügen und 10 Minuten lang bei minus 20 Grad Celsius inkubieren. Waschen Sie zweimal mit 10 Millilitern PBTT, um das Gewebe zu rehydrieren. Nach dem Waschen des Gewebes, wie im Textprotokoll beschrieben, in Hybridisierungslösung bei minus 20 Grad Celsius lagern.

Wenn die Filterbaugruppe bis zum nächsten Tag nicht verwendet wird, sollte sie durch eine normale Kappe ersetzt werden. Aliquotieren Sie etwa 20 Mikroliter Gewebe pro Vertiefung in eine 96-Well-PCR-Platte auf Eis. Entfernen Sie mit einer Achtkanal-Verteilerpipette die Hybridisierungslösung aus dem Gewebe.

Geben Sie 100 Mikroliter frisch denaturierte Hybridisierungslösung in jede Vertiefung und decken Sie sie mit Dichtungsband ab. Hybridisieren Sie das Gewebe bei 56 Grad Celsius mit einer Trockenbadheizung mit Metallkügelchen für mindestens 2 1/2 bis drei Stunden. Denaturieren Sie 100 Mikroliter der vorbereiteten Sonde in einer 96-Well-PCR-Platte bei 80 Grad Celsius für fünf Minuten.

Sofort fünf Minuten auf Eis abkühlen lassen. Entfernen Sie die Prähybridisierungslösung aus dem Gewebe und fügen Sie jeder Probe denaturierte genspezifische Sonden hinzu. Mit Aluminium-Dichtband abdecken und bei 56 Grad Celsius unter Metallperlen in einer Trockenbadheizung für 16 bis 18 Stunden über Nacht hybridisieren.

Bevor Sie mit der Sondendetektion beginnen, erwärmen Sie alle erforderlichen Lösungen in der 56 Grad Celsius heißen Heizeinheit. Übertragen Sie hybridisierte Gewebe vorsichtig in eine 96-Well-Platte, die in einen Multi-Well-Platten-Vakuumverteiler passt. Die Vertiefungen dieser Platten haben Membranböden, die eine Entnahme des Inhalts unter Vakuum ermöglichen.

Entfernen Sie die Sonden von der 96-Well-Platte und waschen Sie die Proben mit Mischungen aus Hybridisierungslösung und PBTT gemäß den in dieser Tabelle angegebenen Schritten in der 56-Grad-Celsius-Heizeinheit. Entfernen Sie nach dem dritten Waschen mit PBTT die 96-Well-Platte aus der Heizeinheit, entfernen Sie die PBTT-Lösung und blockieren Sie das Gewebe mit PBTTB auf einem Tischmixer bei Raumtemperatur für 20 Minuten. Geben Sie 100 Mikroliter Antikörperlösung pro Vertiefung hinzu und inkubieren Sie sie zwei Stunden lang auf dem Labor-Probenmischer.

Nach dem Spülen mit PBTTB, wie im Textprotokoll beschrieben, 100 Mikroliter Streptavidin Meerrettichperoxidase-Lösung pro Vertiefung hinzufügen und 1-1/2 Stunden bei Raumtemperatur inkubieren. Waschen Sie zweimal pro Waschgang fünf Minuten lang mit PBTTB. Danach inkubieren Sie das Gewebe mit DAPI-Lösung, wie im Textprotokoll beschrieben.

Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie die Proben mit Tyramidlösung inkubieren und die Proben zwei Stunden lang im Dunkeln auf dem Tischmischer inkubieren. Entfernen Sie die Tyramidlösung aus dem Gewebe, sobald die Inkubation abgeschlossen ist. Nach dem Waschen mit PBT und PBS, wie im Textprotokoll beschrieben, fügen Sie 150 Mikroliter Antifading-Eindeckmittel pro Vertiefung hinzu.

Bewahren Sie die Proben über Nacht bei vier Grad Celsius auf, damit das Gewebe auf den Boden der Vertiefung oder des Rohrs sinken kann. Am nächsten Tag montieren Sie die Proben auf einen Objektträger und verschließen sie mit einem Deckglas. Zum Schluss bilden Sie die Proben mit einem Fluoreszenzmikroskop ab.

Gezeigt werden Beispiele für Ergebnisse, die mit diesem Verfahren für frühe Drosophila-Embryonen und späte Drosophila-Embryonen mit Signalen in der Amnioserosa, den Muskeln und dem Zentralnervensystem erzielt wurden. Der Name des Gens, mit dem die Sonde hybridisiert wurde, wird in jedem Panel angezeigt. Es folgen Beispiele aus dem Larvengewebe des dritten Stadiums, den malpighischen Tubuli, dem Mitteldarm, der Speicheldrüse und den Muskeln.

Zuletzt werden repräsentative Bilder des Eierstocks und der Hoden von Erwachsenen gezeigt. Einmal gemeistert und effizient ausgeführt, kann diese Technik in nur zwei Tagen durchgeführt werden. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, auf einer RNase-freien Bank mit RNase-freien Spitzen, Röhrchen, Platten und Lösungen zu arbeiten und Handschuhe zu verwenden.

Wenn Sie mit einer großen Anzahl von Proben oder Sonden arbeiten, sollten Sie das Verfahren nicht überstürzen. Und es ist auch eine gute Idee, sich Tricks einfallen zu lassen, damit du nicht vergisst, wo du bist. Wenn Sie dieses Verfahren befolgen, können Sie es auch mit anderen Methoden kombinieren, z. B. dem Nachweis mehrerer Sonden, Sonden mit Proteinen oder zellulären Markern.

Mit diesen können Sie zusätzliche Fragen beantworten, wie z.B. relative Expressionsmuster, Zell- und subzelluläre Kompartimentidentitäten und Auswirkungen bei unterschiedlichen genetischen Hintergründen oder Krankheiten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die meisten Arten von In-situ-Hybridisierungen in jeder Art von Gewebe oder Embryo durchgeführt werden können. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Reagenzien wie Formaldehyd, Wasserstoffperoxid und Formamid extrem gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung des Eingriffs immer Vorsichtsmaßnahmen wie ordnungsgemäße Handhabung und Entsorgung getroffen werden sollten.