Name: Hochauflösender Fluoreszenz In Situ Hybridisierung in Drosophila Embryos und Gewebe mit Tyramide Signalverstärkung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 21 s
Description: Erfahren Sie hochauflösende RNA-In-Situ-Hybridisierung mit Tyramid-Signalverstärkung in Drosophila-Embryonen und -Geweben. Diese kostengünstige Methode ermöglicht präzise räumliche RNA-Lokalisierung in der Entwicklungsbiologie.

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Finanzielle Unterstützung für dieses Projekt wurde durch einen Zuschuss HMK von Canadian Institutes of Health Research zur Verfügung gestellt (MOP 133473 gewähren).

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<li>Hughes, S. C., Krause, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+labeling+with+fluorescence+in+situ+hybridization+in+Drosophila+whole-mount+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Double labeling with fluorescence in situ hybridization in Drosophila whole-mount embryos.</a> Biotechniques. 24, 530-532 (1998).</li>
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<li>Lecuyer, E., Parthasarathy, N., Krause, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+in+situ+hybridization+protocols+in+Drosophila+embryos+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent in situ hybridization protocols in Drosophila embryos and tissues.</a> Methods Mol Biol. 420, 289-302 (2008).</li>
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<li>Holt, C. E., Bullock, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+mRNA+Localization+in+Animal+Cells+and+Why+It+Matters%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Subcellular mRNA Localization in Animal Cells and Why It Matters.</a> Science. 326, 1212-1216 (2009).</li>
<li>Martin, K. C., Ephrussi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA+Localization%3A+Gene+Expression+in+the+Spatial+Dimension%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">mRNA Localization: Gene Expression in the Spatial Dimension.</a> Cell. , 719-730 (2009).</li>
<li>Wilk, R., Hu, J., Blotsky, D., Krause, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+and+pervasive+subcellular+distributions+for+both+coding+and+long+noncoding+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Diverse and pervasive subcellular distributions for both coding and long noncoding RNAs.</a> Genes Dev. 30, 594-609 (2016).</li>
<li>Zhou, X. L., Vize, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proximo-distal+specialization+of+epithelial+transport+processes+within+the+Xenopus+pronephric+kidney+tubules%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Proximo-distal specialization of epithelial transport processes within the Xenopus pronephric kidney tubules.</a> Dev Biol. 271, 322-338 (2004).</li>
</ol>

Autoren haben keine finanziellen Interessenkonflikte.

Das beschriebene Protokoll sieht eine reproduzierbare, hochsensiblen und wirtschaftliche Methode zur Detektion von den meisten RNAs in festen Drosophila Embryos oder Gewebe. Obwohl etwas komplizierter, als die mehr traditionell alkalische Phosphatase Methode der Sonde Erkennung verwendet, die Auflösung durch die Fische ist weit größer und die Empfindlichkeit ist vergleichbar oder verbesserte 7,8. Durch die Verwendung von ganzen oder teilweisen Mikrotiter-Platten, können die Protokolle für groß angelegte oder begrenzte Analysen von Genen von Interesse verwendet werden. Es sei darauf hingewiesen, dass die Sonden generiert möglicherweise alle erkennen oder mehrere Transkript Spleiß bildet, es sei denn, Sonden mehr speziell (z.B. einzelne Exons). Obwohl wir Sonden so klein wie 200 Nukleotide mit einigem Erfolg getestet haben, kleinere Sonden tendenziell weniger wirksam und möglicherweise weniger spezifisch. Klar, dieses Protokoll eignet sich nicht für die Erkennung von kleinen Introns, Exons, oder Micro-RNAs verarbeitet.
Obwohl dieser Ansatz einen enzymatischen Schritt verwendet, um die Stärke der Signale zu steigern, erscheint Signalintensität proportional zur Ziel-gen-Expression in einer relativ linear und breite Strecke der Ausdruck Niveaus. Bei höherer Vergrößerung, das Signal wird als Puncta oder Flecken innerhalb von Zellen und Geweben. Für relativ selten Transkripte sind nur ein paar winzige Puncta gesehen. Mit zunehmender Transkript Fülle wachsen diese in Anzahl und Größe. Wie bei einzelnen Moleküls Fisch (SmFISH), einzelne kleine Puncta kann auch einzelne RNAs entsprechen und sollte auch leicht quantifiziert werden mittels Bildgebung und Informatik Software. Vergleiche der veröffentlichten Bilder, die die SmFISH mit Bildern, die wir kuratiert haben die gleichen Ziele vorschlagen, dass die insgesamt, Empfindlichkeit und Auflösung der beiden Methoden relativ ähnlich sind, obwohl dies durch eine strengere Vergleiche getestet werden sollte. Angesichts der viel höheren Kosten des SmFISH, sollte die Methode, die hier zur Verfügung gestellten ähnliche Ergebnisse zu einem Bruchteil der Kosten geben. Jedoch, wenn das Ziel ist es, kleine Abschriften oder Teile von Transkripten zu erkennen, empfiehlt sich SmFISH.
Aufgrund der geringeren Größe des einige Fisch-Sonden kann diese Methode auch eindringende Gewebe besser sein, die groß sind oder haben erhebliche Hindernisse. Jedoch unsere Nutzung der höheren Waschmittel und Gewebe Fixierung und Permeabilisierung zwickt scheinen dieses Problem gelöst haben. Schließlich sollte obwohl für Drosophila Gewebe entwickelt, die hohe Waschmittel Puffer für seziert Gewebe hier beschrieben auch für Drosophila Embryonen sowie die meisten anderen Organismen und Gewebe arbeiten.

Neue genomweiten RNA Nachweismethoden wie RNA-Seq haben unser Wissen wann und wo Gene exprimiert werden, und was1Ebenen stark ausgebaut. Allerdings bieten diese relativ geringe zeitlichen und räumlichen Auflösung. RNA in Situ Hybridisierung ermöglicht die räumliche Verteilung der Transkripte in festen Geweben, visuell beobachtet werden, so offenbart die Details von zellulärer und subzellulärer Lokalisierung2. Mit Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) können noch mehr räumlichen Auflösung, da es den Einsatz von leistungsfähigen Mikroskopiertechniken, wie konfokale und leichte Blatt Mikroskopie3erlaubt. Fluoreszierende Markierungen wie DAPI können auch verwendet werden, subzelluläre Beziehungen4herstellen. Fisch erleichtert auch die Beobachtung von mehreren RNAs und Proteine gleichzeitig mit klaren Angaben Überlappung auf der subzellulären Ebene. Einzigartige Reagenzien und für doppelte Kennzeichnung erforderlichen Schritte finden Sie in den folgenden Referenzen3,5.
Die hier beschriebenen Verfahren nutzen 96-Well-Mikrotiterplatten für alle Schritte, einschließlich cDNA Vorlage Produktion (Kolonie PCR), RNA-Sonde-Produktion (mit T7, T3 oder SP6 Polymerase-abhängige Run-off-Transkription), in Situ Hybridisierung und Fluoreszenzsignal Entwicklung. Ausreichende Zahl von Embryonen oder Gewebe werden hinzugefügt, um jedes gut von 96-Well-Platte Bewertung der Konsistenz und Variabilität zu ermöglichen. Jeder erhält also eine andere Sonde. Nach Signal Entwicklung sind auf einzelne Objektträger für die mikroskopische Analyse Embryonen oder Gewebe aus jedem Brunnen angeordnet.
Die Verwendung von Tyramide Signalverstärkung (TSA) für Sonde Erkennung produziert robuste Signale mit außergewöhnlichen subzelluläre Auflösung 5,6,7,8. Die subzelluläre Lokalisation des RNAs ist ein wichtiger Regulierungsmechanismus 9 , die angezeigt wird mit nahezu allen RNAs 4,10,11auftreten. Diese Analysen haben auch gezeigt, dass viele Transkripte, die nicht durch RNA-Seq erkannt werden durch Fisch 8leicht erkannt werden. Die Anpassung der RNA in Situ Hybridisierung, 96-Well Platten ermöglicht die Analyse von bis zu 96 Gene von Interesse zu einem Zeitpunkt (mehr, wenn zusätzliche Platten verwendet werden), die Analyse von großen Datenmengen ermöglicht. Durch Schneiden der Platten in kleinere Abschnitte, wird die Methode auch einfach nur ein paar Beispiele angepasst. Das Protokoll zur Verfügung gestellt eignet sich zur Analyse der RNA-Distributionen in den meisten Arten von Geweben. Obwohl nicht gezeigt, ist es an nicht-Drosophila Gewebe sowie anpassbar.

<table><tbody><tr><td>15 ml konische Zentrifugenröhrchen aus Polypropylen</td><td>Frogga Bio</td><td>TB15-500</td><td>zertifizierte DNase- und RNase-freie</td></tr><tr><td>2x PCR Master Mix mit Farbstoff (Ambiogen)</td><td>Biomart (Kanada)</td><td>141106-1K</td><td>zertifizierte DNase- und RNase-freie</td></tr><tr><td>50 ml konische Zentrifugenröhrchen aus Polypropylen</td><td>Frogga Bio</td><td>TB50-500</td><td>zertifizierte DNase- und RNase-freie</td></tr><tr><td>96-Well-Filterplatte (1,2 μm, hydrophiles PVDF Membran</td><td>EMD MILLIPORE</td><td>MSBVS1210</td><td>Wird verwendet, um Liguid vom Boden der Platte mit flosenden Geweben</td></tr> zu entfernen <tr><td>96-Well-PCR-Platte (200 &mu; l)</td><td>Denville</td><td>C18096-10</td><td></td></tr><tr><td>Acrodisc Spritzenvorsatzfilter (0,2 u)</td><td>PALL</td><td>PN4612</td><td></td></tr><tr><td>Acrodisc Spritzenvorsatzfilter (0,45 u)</td><td>PALL</td><td>PN4614</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Bioshop</td><td>AGA002.500</td><td></td></tr><tr><td>AXYGEN 96-Well-Assay-Aufbewahrungsplatten</td><td>UltiDent Scientific</td><td>24-P96-450V-C</td><td>Zur Lagerung von bakteriellen Glycerinvorräten</td></tr><tr><td>AXYGEN Aluminium Plattendichtungen</td><td>UltiDent Scientific</td><td>24-PCR-AS-200</td><td>Zum Versiegeln von Platten</td></tr><tr><td>AXYGEN Spitzen mit breiter Bohrung (200 ul)</td><td>UltiDent Scientific</td><td>24-T205-WB-C</td><td>Zum Transfer von Proben</td></tr><tr><td>Biotin-SP (langer Spacer) IgG-Fraktion Monoklonale Maus Anti-Digoxin</td><td>Jackson ImmunoResearch Lab</td><td>200062156</td><td>Primärer Antikörper für in situ (Stamm konz. 1 mg/ml, Arbeitskonz. 2,5 &mu; g/ml oder 1/400 Verdünnung.</td></tr><tr><td>BRAND 8-Kanal-Verteiler (autoklavierbar)</td><td>BrandTech Scientific Inc.</td><td>704526</td><td>Zur Entfernung von Flüssigkeiten von der Oberseite von 96-Well-PCR-Platten</td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>Sigma-aldrich</td><td>C1919</td><td>Stammkonzentration 34 mg/ml gelöst und 0,2 μ; m filtriert in 100 % EtOH (als 1/1000 verwenden)</td></tr><tr><td>Cyanin-3-Tyramid (Cy3-TSA)</td><td>Hausgemacht</td><td></td><td>Kann bestellt werden bei Perkin-Elmer Cat# SAT704A001EA</td></tr><tr><td>DABCO (1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octan)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>D2522</td><td>Antifade-Reagenz in Eindeckmedien</td></tr><tr><td>Digoxigenin-11-uridin-5'-triphosphat</td><td>Roche</td><td>11-209-256-910</td><td></td></tr><tr><td>Käfig zur Entnahme von Embryonen</td><td>Home hergestellt</td><td>N/A</td><td>Größe: 75 cm x 75 cm x 75 cm hergestellt mit Polymethylmethacrylat</td></tr><tr><td>Eppendorf Zentrifuge 5804</td><td>Eppendorf</td><td>Modell 5804</td><td>Zentrifuge für 96-Well-Platten auf A-Z-DWP Rotor</td></tr><tr><td>Formamid</td><td>Bioshop</td><td>FOR001.500</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td></td><td>Bioshop GLY002.4</td><td></td></tr><tr><td>Glycin</td><td>Bioshop</td><td>GLN001.500</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4784-250MG</td><td>Lagerbestand: 50 mg/ml. Arbeitskonzentration 1 mg/ml in Hybridisierungslösung</td></tr><tr><td>Lab Armor Beads</td><td>DiaMed</td><td>LAA42370-001</td><td>Heizeinheit einfüllen</td></tr><tr><td>Labnet Gyro M Mini Nutating Mixer</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-998-347</td><td>Probenmischung</td></tr><tr><td>Mesh - 100 micons</td><td>FlyStuff</td><td>57-103</td><td>Zum Sammeln von Embryonen</td></tr><tr><td>Mesh - 800 Mikrometer</td><td>SEFAR - Nytex</td><td>06-780/53</td><td>Zum Auffangen von losem Gewebe / kann für Spezialschlauch in Abbildung 4 verwendet werden.</td></tr><tr><td>Micro Cover Gläser</td><td>VWR</td><td>48366-067</td><td>Größe: 22 x 22 mm</td></tr><tr><td>Micro slides, frstd</td><td>VWR</td><td>48312-003</td><td>Größe: 25 x 75 mm</td></tr><tr><td>Multi-Well-Platten-Vakuumverteiler</td><td>Pall Corporation</td><td>P/N 5017</td><td>Flüssigkeit vom Boden der 96-Well-Filterplatte</td></tr><tr><td>entfernen Paraformaldehyd (PFA)</td><td>Bioshop</td><td>PAR070.500</td><td>Fixierungs-PCR-Maschine</td></tr><tr><td></td><td>Bio-Rad</td><td>Modell: DNA Engine PTC-200</td><td>96-Well-Platten-PCR und -Sonde zur Denaturierung</td></tr><tr><td>Pikrinsäurelösung</td><td>Sigma-aldrich</td><td>80456</td><td>Für die Gewebefixierung I-Lösung</td></tr><tr><td>Kaliumchlorid (KCL)</td><td>Bioshop</td><td>POC308</td><td></td></tr><tr><td>PP-Deckel für 96-Well-Platten, 100/Karton</td><td>UltiDent Scientific</td><td>24-P-DECKEL-PP</td><td>Deckel für die Aufbewahrung von Platten</td></tr><tr><td>Progene Einweg-Reagenzreservoire (50 ml, steril)</td><td>UltiDent Scientific</td><td>825-1-50-5S</td><td>Liquid Handling</td></tr><tr><td>Progene Durchstechbare Aluminiumfolie</td><td>UltiDent Scientific</td><td>87-CFILM-AL</td><td>Seal 96-Well-Platte, DNase und RNase frei</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Sigma-aldrich</td><td>P2308- 5MG</td><td>Permeabilisierung von Embryonen</td></tr><tr><td>RiboLock Ribonuklease-Inhibitor</td><td>Thermo Scientific</td><td>EO0381</td><td>40 Einheit/ul</td></tr><tr><td>Ribonukleosidtriphosphat (NTP) Set</td><td>Roche</td> 11277057001 <td>RNA-Sondensystem</td><td></td></tr><tr><td>RNase freies Wasser</td><td>GIBCO</td><td>10977015-500ml</td><td>RNA-Sondensystem</td></tr><tr><td>RNaseZap</td><td>Ambion</td><td>AM9780</td><td>RNase-Kontamination entfernen</td></tr><tr><td>Einzelsträngige DNA aus Lachshoden</td><td>Sigma-aldrich</td><td>D9156</td><td>Für Hybridisierungslösung</td></tr><tr><td>Magermilch (ohne Fettstärke)</td><td>Bioshop</td><td>SKI400.500</td><td>Die Arbeitskonzentration beträgt 1 % in 1 x PBT oder PBTT als Blockierungsreagenz</td></tr><tr><td>Natriumacetat (NaOAc) 3 M, pH = 5,2 (RNase-frei)</td><td>Bioshop</td><td>SAA333</td><td>Die Arbeitskonzentration beträgt 10 % (v/v) für DNA- oder RNA-Fällung</td></tr><tr><td>SP6 RNA-Polymerase</td><td>Thermo Scientific</td><td>EP0131</td><td>20 Einheit/ul</td></tr><tr><td>Edelstahlschrot für das Sandbad</td><td>VWR</td><td>13259-274.</td><td>Zum Befüllen der Heizeinheit</td></tr><tr><td>Stereomikroskop & Schwanenhals-Lichtquelle</td><td>Leica</td><td>Modell: MZ6</td><td>Gewebedissektion und -montage</td></tr><tr><td>Streptavidin, Meerrettichperoxidase (HRP) Konjugat</td><td>Molekulare Sonden</td><td>S911</td><td>Sekundärer Antikörperstamm: 1 mg/ml, 1/1000 Verdünnung verwenden (1 &mu; g/ml) für in situ.</td></tr><tr><td>T3 RNA Polymerase</td><td>Thermo Scientific</td><td>EP0101</td><td>20 Einheit/ul</td></tr><tr><td>T7 RNA Polymerase</td><td>Thermo Scientific</td><td>EP0111</td><td>20 Einheit/ul</td></tr><tr><td>Spitzenstation (10 ul)</td><td>Axygen</td><td>T-300-STK-S</td><td>Zertifiziert DNase und RNase frei</td></tr><tr><td>Spitzenstation (200 ul)</td><td>Sorbio</td><td>27770T</td><td>zertifiziert DNase und RNase frei</td></tr><tr><td>Spitzen ( 1ml)</td><td>Sorbio</td><td>10200</td><td>zertifiziert DNase- und RNase-freies</td></tr><tr><td>TRITON X-100</td><td>Bioshop</td><td>TRX506</td><td>Die Arbeitskonzentration beträgt 0,3 % in 1 x PBT für Gewebe in situ</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Bioshop</td><td>TWN510</td><td>Die Arbeitskonzentration beträgt 0,1 % in 1 x PBT für Embryonen in situ</td></tr><tr><td>Whatman qualitatives Filterpapier, Grade 3</td><td>Sigma-aldrich</td><td>WHA1003917</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company </td><td>Katalognummer</td><td>Kommentare</td></tr><tr><td>Solutions<</td><td></td><td></td><td>strong>Preparation</td></tr><tr><td>DABCO (1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octan) Glycerin Anti-Fade-Eindeckmittel</td><td></td><td></td><td>DABCO (1,25 g), Glycerin (35 ml oder v/v 70 %) und 1 X PBS (15 ml oder v/v 30 %). Dunkel halten und in einem kalten Raum rocken. Lagerung bei -20 °; C</td></tr><tr><td>1 X PBT (1L)</td><td></td><td></td><td>1 X PBS mit 1 ml Tween 20 (0,1 %)</td></tr><tr><td>1 X PBTT (1L)</td><td></td><td></td><td>1 X PBS mit 1 ml Tween 20 (0,1 %) und 3 ml Triton-X-100 (0,3 %)</td></tr><tr><td>1 X PBTB (1L)</td><td></td><td></td><td>1 % Magermilch in 1 X PBT</td></tr><tr><td>1 X PBTTB (1L)</td><td></td><td></td><td>1 % Magermilch in 1 X PBTT</td></tr></tbody></table>

hochauflösender fluoreszenz in situ hybridisierung in drosophila embryos und gewebe mit tyramide signalverstärkung

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

In unseren Bemühungen, die Muster des Ausdrucks und subzelluläre Lokalisation der Drosophila RNAs auf einer genomweiten Basis zu bestimmen und in einer Vielzahl von Geweben haben wir zahlreiche Änderungen und Verbesserungen zu unserer ursprünglichen fluoreszierende in-situ entwickelt Hybridisierung (FISH)-Protokoll. Um Durchsatz und Wirtschaftlichkeit zu erleichtern, werden alle Schritte, von der Sonde Generation zur Signalerfassung, mit Exon 96-Well-Mikrotiterplatten durchgeführt. Digoxygenin (DIG)-gekennzeichneten Antisense RNA-Sonden entstehen mit cDNA Klonen oder genomischer DNA als Vorlage. Nach Gewebe Fixierung und Permeabilisierung Sonden sind hybridisiert, Abschriften von Interesse und dann erkannten mit einer Reihe von Anti-DIG-Antikörper konjugiert, Biotin, Streptavidin konjugiert, Meerrettich-Peroxidase (HRP) und Gewebekulturen konjugiert Tyramide, die in Anwesenheit von HRP, hochreaktive Intermediate produziert, das Elektron Dichte Regionen unmittelbar neben Proteine bindet. Verstärkung und Lokalisierung folgendermaßen erzeugen eine robust und stark lokalisierte Signal, die beide zellulärer und subzellulärer Transkript Lokalisierung erleichtert. Die Protokolle zur Verfügung gestellt wurden optimiert, um hochspezifische Signale in einer Vielzahl von Geweben und Entwicklungsstufen zu produzieren. Referenzen sind ebenfalls zusätzliche Variationen geboten, die es die simultane Detektion von mehreren Abschriften, oder Abschriften und Proteine, zur gleichen Zeit ermöglichen.

Abbildung 6 zeigt Beispiele für Ergebnisse, die mit diesem Verfahren. Die Top 3 Tafeln zeigen Beispiele der frühen Drosophila Embryos (Abbildung 6, Paneele A-C), die nächsten 3 Platten Beispiele der späten Drosophila Embryos mit Signalen in verschiedenen Geweben (Amnioserosa, Muskeln und des Zentralnervensystems, zeigen bzw. (Abbildung 6, Platten D-F). Als nächstes sind Beispiele aus 3. Instar Larven Gewebe (Abbildung 6, Paneele G-J). Platten, K und L zeigen repräsentative Bilder von Erwachsenen Gonaden (Eierstöcke und Hoden, beziehungsweise). Hunderte von Bildern wurden hochgeladen und kommentiert in unsere durchsuchbare "Fluoreszenz in Situ -Fruchtfliege-Datenbank" (FlyFISH (http://fly-fish.ccbr.utoronto.ca)).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig1.jpg"> 
Abbildung 1. Gliederung der Fluoreszenz in Situ Hybridisierung (FISH) Protokoll und Schlüssel Ausrüstung. (A) PCR-Amplifikation der cDNA. (B) In-vitro- Transkription, Gen-spezifischen antisense DIG - generieren beschriftet RNA-Sonden in einer 96-Well-Platte (Foto von der Platte in b gezeigt). (C) und (D): Erwachsene (weiblich: männlich Verhältnis 2:1. 300-400 fliegen/Flasche) fliegen dürfen für 3-4 Tage zu Paaren. Embryonen aus einer Nacht Sammlung auf standard Maismehl Essen bei 25 ° C sind an einer gut belüfteten Kunststoff-Box übertragen (1 L Maismehl Essen in einem Container Größe: 8 "X 8" X 3" LWH) oder zu neuen Flaschen halten eine ordnungsgemäße Larven Dichte. Für Gewebe Sammlung sollte aktive Hefe Pulver auf das Essen in 24, 48 h nach der Eiablage (AEL) gestreut werden. (E bis H): Fluoreszenz in Situ Hybridisierung Experimente durchgeführt über 3 aufeinander folgenden Tagen. Verwenden Sie für Embryonen oder Geweben, die nicht schwimmen eine 96-Well-PCR-Platte wie in Foto b mit 8-Kanal-Sauger (Foto c) gezeigt. Verwenden Sie für Gewebe, die schweben, wie die meisten Larven Gewebe einen Filter-Talsohle Teller (Foto d) und entfernen Sie Flüssigkeit von unten mit einem vielfältigen Absauganlage mit niedrigem Druck (Foto e). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig2.jpg"> 
Abbildung 2: Bestimmung der RNA-Sonde Ausbeute. Neu synthetisiert Antisense RNA-Sonden auf einem 1 % Agarose-Gel (5 µL/Bahn) beobachtet. Die Rendite kann (basierend auf der Intensität der Band) kategorisiert werden als "niedrige Rendite" in Bahnen 3 und 10, "typische Rendite" in Gassen 1, 4, 5, 6 und 8 oder "high-Yield" in Bahnen 2, 7, 9, 11 und 12. Verwenden Sie für Proben mit einem "typischen Renditen" 10-15 µL der Sonde in 100 µL für jedes Experiment in Situ Hybridisierung Lösung verdünnt. Proben mit hohen Erträgen der Sonde mit zusätzlichen Hybridisierung Lösung entsprechend der Band Intensität im Vergleich zu einer "typischen Probe" Intensität zu verdünnen. Sollen Sie etwa gleich letzte Sonde Konzentrationen in jede Vertiefung. Der Pfeil zeigt auf eine der "RNA-Sonden", ist das höhere Band auf jeder Bahn die ursprüngliche DNA-Vorlage. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig3.jpg"> 
Abbildung 3. Wichtige Schritte für eine groß angelegte Embryo Sammlung und Fixierung. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig4.jpg"> 
Abbildung 4. Hausgemachte Rohr zum Entfernen von Flüssigkeit aus den Larven oder schwimmenden Geweben. Einige Larven und adulten Geweben schweben in Lösung während der Fixierung. Dieses einfache Werkzeug besteht aus einem Nylon-Gewebe im Besitz einer 200 µL Schneiden Spitze, gefolgt von einer 1 mL-Tipp als einen Adapter zum Verbinden mit einer Absauganlage. Flüssigkeit kann sicher entfernt werden, ohne dass jedes Gewebe. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig5.jpg"> 
Abbildung 5. Tyramide Signalverstärkung. (1) DIG-markierten antisense RNA-Sonde hybridisiert mit endogenen Sinn RNA. (2) Immuno-Affinität Bindung zwischen Biotin konjugiert Primärantikörper und DIG-UTP. (3) HRP konjugiert Streptavidin bindet Biotin. (4) HRP katalysiert die Cyanin 3-Tyramide und Wasserstoffperoxid Reaktion um kurzlebige Cyanin-3-Tyramide-radikale bilden. (5) Cyanin-3-Tyramide-radikalen binden an Tyrosin Rückstände auf nahe gelegenen Proteine. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig6.jpg"> 
Abbildung 6. Vertreter in Situ Hybridisierung Bilder. Jedes Panel zeigt ein Beispiel für eine unterschiedliche RNA (siehe Cyan) und Kerne gebeizt mit DAPI (rot dargestellt). (A-C) Beispiele der frühen Drosophila Embryos. (D, F) Beispiele der späten Drosophila Embryos. (G-J) Beispiele für 3. instar Drosophila Larven Gewebe (Malphigian Tubuli, Mitteldarm, Speicheldrüse und Muskel beziehungsweise). (K) Erwachsenen Eierstock. (L) Erwachsenen Hoden. Jedes Panel zeigt den Namen der das Gen, dem die Sonde zu züchten ist. Skalieren von Balken = 10 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

Die beschriebenen RNA in Situ Hybridisierung Protokoll ermöglicht die Erkennung von RNA in ganze Drosophila Embryos oder seziert Gewebe. Mit 96-Well-Mikrotiterplatten und Tyramide Signalverstärkung, können Protokolle mit hoher Auflösung, Empfindlichkeit und Durchsatz und bei relativ geringen Kosten erkannt werden.

Hochauflösender Fluoreszenz In Situ Hybridisierung in Drosophila Embryos und Gewebe mit Tyramide Signalverstärkung

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, RNA-Transkripte direkt innerhalb von Zellen und Geweben nachzuweisen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in den Bereichen Zell- und Entwicklungsbiologie zu beantworten, beispielsweise wo sich eine RNA innerhalb einer Zelle, eines Gewebes oder eines Embryos befindet. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie räumliche RNA-Verteilungen mit hoher Auflösung und Empfindlichkeit sowie zu geringen Kosten im Vergleich zu anderen Methoden detektiert.Wir haben dieses Protokoll ursprünglich entwickelt, um die subzellulären Verteilungen so vieler Drosophila-RNAs wie möglich zu untersuchen. Dies geschah, um Umfang und Vielfalt der subzellulären Verteilungen zu bestimmen. Wir begannen das Projekt mit Embryonen, passten und optimierten das Protokoll jedoch später, sodass wir hochdurchsatzfähig mit aus Larven und Fliegen präparierten Geweben arbeiten konnten.Der schwierigste Aspekt des Verfahrens liegt in der hohen Anzahl von Arbeitsschritten und dem damit verbundenen Risiko von Fehlern sowie in der Notwendigkeit, die Abwesenheit von RNAs während der Sondenherstellung sicherzustellen. Um die Durchsatzkapazität und Kosteneffizienz zu verbessern, werden in diesem Video alle Schritte unter Verwendung von 96-Loch-Mikrotiterplatten durchgeführt. Die Methode lässt sich leicht an eine geringere Probenanzahl anpassen, indem die Platten in Streifen mit acht oder zwölf Löchern zugeschnitten werden.Beginnen Sie damit, 10&nbsp;Mikroliter einer über Nacht gezüchteten Bakterienkultur in jedem Brunnen einer neuen 96-Loch-PCR-Platte mit 90&nbsp;Mikrolitern autoklaviertem, doppelt destilliertem Wasser zu verdünnen. Denaturieren Sie die DNA fünf Minuten lang bei 95&nbsp;°C in einem Thermocycler. Stellen Sie die Platte anschließend unverzüglich für mindestens fünf Minuten auf Eis.Richten Sie die PCR-Ansätze in einer neuen 96-Loch-PCR-Platte ein. Verwenden Sie die geeigneten universellen Primer und pipettieren Sie 48 Mikroliter der PCR-Master-Mix-Lösung in jedes Loch. Geben Sie zwei Mikroliter jeder denaturierten plasmidischen DNA-Vorlage pro Loch hinzu.Führen Sie die Amplifikation in einer 96-Loch-PCR-Maschine durch. Nach Abschluss der Amplifikation fällen Sie das PCR-Produkt mit einer Ethanol-Natriumacetat-Mischung. Lagern Sie die Proben 30 Minuten bei minus 80 Grad Celsius.Zentrifugieren Sie die 96-Well-Platte bei 2.250 × g und vier Grad Celsius für 45 bis 60 Minuten. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand mit einer Acht-Kanal-Vakuummanifold-Pipette, die so konstruiert ist, dass die Spitzen beim Absaugen der Pellets nicht bis zum Boden der Wells gelangen. Waschen Sie einmal mit 160 µL kaltem 70 %igem Ethanol.Zentrifugieren Sie bei 2.250 × g und vier Grad Celsius für 10 Minuten. Drehen Sie die 96-Well-Platte vorsichtig auf ein Papiertuch, um die letzten Flüssigkeitstropfen aus jedem Well zu entfernen, und lassen Sie die DNA-Pellets eine Stunde lang bei Raumtemperatur trocknen. Lösen Sie die präzipitierte DNA in 25 µL RNase-freiem Wasser wieder auf.Überprüfen Sie Größe und Ausbeute der PCR-Produkte mittels Agarose-Gelelektrophorese. Richten Sie die *in-vitro*-Transkriptionsreaktionen ein, indem Sie die entsprechenden Komponenten zu jeder Vertiefung in einer neuen 96-Loch-PCR-Platte hinzufügen. Geben Sie 7,5&nbsp;Mikroliter DNA-Vorlage in die entsprechende Vertiefung.Decken Sie die Platte mit Versiegelungsfolie ab. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius für 3½ bis vier Stunden. Geben Sie anschließend jedem Well ein Master-Mix zu, der aus DEPC-behandeltem doppelt destilliertem Wasser, 100 % Ethanol und dreifach molarer Natriumacetat-Lösung besteht.Bei minus 80 Grad Celsius 30 Minuten lang lagern. Die Platte zentrifugieren und die Vertiefungen wie zuvor gezeigt waschen. Den ausgefällten Probekörper in 25 Mikroliter mit DEPC behandeltem doppelt destilliertem Wasser resuspendieren.Neu synthetisierte Antisense-RNA-Sonden wurden in einem 1 %igen Agarosegel auf Integrität und Ausbeute überprüft. Anhand der Intensität des Bands kann die Ausbeute als geringe, typische oder hohe Ausbeute charakterisiert werden. Nachdem fünf Mikroliter jeder Sonde für die Agarosegelelektrophorese verwendet wurden, werden die verbleibenden 20 Mikroliter mit 100 Mikrolitern Hybridisierungslösung gemischt und bei minus 80 Grad Celsius aufbewahrt, bis sie benötigt werden.Um dieses Verfahren zu beginnen, geben Sie 20 bis 30 Larven in eine Petrischale, die kalte PBS in Fixierlösung enthält, und kühlen Sie die Schale zwei Minuten lang auf Eis, um die Larvenbeweglichkeit zu verringern. Dissezieren Sie die Larven unter dem Stereomikroskop. Verwenden Sie ein Paar scharfer Pinzetten, um den vorderen Bereich vorsichtig zu öffnen, und drücken Sie die Gewebe von posterior nach anterior heraus.Nach maximal 15 Minuten überführen Sie die dissezierten Gewebe in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen zur Fixierung und stellen es auf Eis. Entfernen Sie das PBS und geben Sie 800 Mikroliter Fix-One-Lösung hinzu. Inkubieren Sie die Probe gemeinsam mit zuvor gesammelten fixierten Geweben 30 Minuten lang auf einem Tischmischer.Spülen Sie die Gewebe einmal mit 800 Mikrolitern PBTT und stellen Sie das Röhrchen auf Eis, während zusätzliche Gewebe gesammelt und fixiert werden. Sammeln Sie alle dissezierten Gewebe in einem einzigen 15-Milliliter-Kunststoffröhrchen, das ein Netz im Deckel enthält. Absaugen Sie die überschüssige Flüssigkeit durch das Netz im Deckel. Spülen Sie mit 10 Milliliter PBTT und waschen Sie mit 10 Milliliter PBS. Um die endogene Peroxidase-Aktivität von Rettich zu hemmen, geben Sie fünf Milliliter 0,3 % Wasserstoffperoxid in PBS hinzu und inkubieren Sie 15 Minuten bei Raumtemperatur. Waschen Sie zweimal mit jeweils 10 Milliliter PBTT.Permeabilisieren Sie die Gewebe, indem Sie 10 Milliliter vorgekühltes 80 % Aceton hinzufügen und 10 Minuten bei minus 20 Grad Celsius inkubieren. Waschen Sie zweimal mit jeweils 10 Milliliter PBTT, um die Gewebe erneut mit Feuchtigkeit zu versorgen. Nach dem Waschen der Gewebe gemäß dem schriftlichen Protokoll in Hybridisierungslösung bei minus 20 Grad Celsius lagern.Falls die Filteranordnung nicht am nächsten Tag verwendet wird, sollte sie durch eine normale Kappe ersetzt werden. Portionieren Sie etwa 20 Mikroliter pro Vertiefung Gewebe in eine 96-Loch-PCR-Platte auf Eis. Entfernen Sie mit einer achtkanaligen Manifold-Pipette die Hybridisierungslösung von den Geweben.Gegeben Sie 100 µL frisch denaturierte Hybridisierungslösung in jede Vertiefung und bedecken Sie diese mit Siegelband. Prähybridisieren Sie die Gewebe bei 56 °C unter Verwendung einer Trockenbad-Heizvorrichtung mit Metallkügelchen für mindestens zweieinhalb bis drei Stunden. Denaturieren Sie 100 µL der hergestellten Sonde in einer 96-Loch-PCR-Platte bei 80 °C für fünf Minuten.Unmittelbar fünf Minuten lang auf Eis abkühlen. Die Prähybridisierungslösung von den Geweben entfernen und denaturierte, genspezifische Sonden zu jeder Probe hinzufügen. Mit Aluminiumverschlussfolie abdecken und über Nacht 16 bis 18 Stunden bei 56 Grad Celsius unter Metallkügelchen in einem Trockenheizblock hybridisieren.Bevor mit der Sonden-Nachweismethode begonnen wird, alle erforderlichen Lösungen im Heizgerät auf 56 Grad Celsius vorwärmen. Hybridisierte Gewebe vorsichtig in eine 96-Loch-Platte überführen, die auf ein Vakuum-Mehrfachplatten-Manifold passt. Die Vertiefungen dieser Platten verfügen über Membranböden, die das Entfernen des Inhalts unter Vakuum ermöglichen.Entfernen Sie die Sonden aus der 96-Loch-Platte und waschen Sie die Proben mit Mischungen aus Hybridisierungslösung und PBTT gemäß den in dieser Tabelle angegebenen Schritten in der Heizvorrichtung bei 56 Grad Celsius. Nach der dritten Wäsche mit PBTT nehmen Sie die 96-Loch-Platte aus der Heizvorrichtung, entfernen die PBTT-Lösung und blockieren die Gewebe mit PBTTB auf einem Tischmixer bei Raumtemperatur für 20 Minuten. Geben Sie je Loch 100 Mikroliter Antikörperlösung hinzu und inkubieren Sie zwei Stunden auf dem Tischmixer für Proben.Nach der Spülung mit PBTTB gemäß dem schriftlichen Protokoll 100 µL Streptavidin-Peroxydase-Lösung pro Gut hinzufügen und 1½ Stunden bei Raumtemperatur inkubieren. Zweimal mit PBTTB waschen, wobei jede Wäsche fünf Minuten dauert. Danach die Gewebe gemäß dem schriftlichen Protokoll mit DAPI-Lösung inkubieren.Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie die Proben mit Tyramid-Lösung versetzen und zwei Stunden lang auf dem Rührgerät bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren. Entfernen Sie die Tyramid-Lösung von den Geweben, sobald die Inkubation abgeschlossen ist. Nach dem Waschen mit PBT und PBS gemäß der schriftlichen Anleitung geben Sie 150 Mikroliter Antifade-Mounting-Medium pro Vertiefung hinzu.Die Proben über Nacht bei vier Grad Celsius lagern, um das Absinken des Gewebes auf den Boden der Vertiefung oder des Reaktionsgefäßes zu ermöglichen. Am folgenden Tag die Proben auf einem Objektträger montieren und mit einem Deckglas verschließen. Zuletzt die Proben mithilfe eines Fluoreszenzmikroskops abbilden.Abgebildet sind Beispiele für Ergebnisse, die mit dieser Methode an frühen Drosophila-Embryonen und späten Drosophila-Embryonen erzielt wurden, wobei Signale in Amnioserosa, Muskulatur und zentralem Nervensystem nachgewiesen wurden. Der Name des Gens, mit dem die Sonde hybridisierte, ist in jeder Abbildung angegeben. Danach folgen Beispiele aus Geweben der dritten Larvenstadien, darunter Malpighianische Tubuli, Mitteldarm, Speicheldrüse und Muskulatur.Als Letztes werden repräsentative Bilder von adulten Eierstöcken und adulten Hoden gezeigt. Wenn die Methode einmal beherrscht ist und effizient durchgeführt wird, kann sie in nur zwei Tagen abgeschlossen werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, auf einer RNase-freien Arbeitsfläche mit RNase-freien Pipettenspitzen, Röhrchen, Platten und Lösungen zu arbeiten und Handschuhe zu tragen.Wenn Sie mit einer großen Anzahl von Proben oder Sonden arbeiten, sollten Sie das Verfahren nicht überstürzen. Es ist außerdem ratsam, sich Hilfsmittel zu überlegen, um nicht den Überblick zu verlieren. Während Sie diesem Verfahren folgen, können Sie es auch mit anderen Methoden kombinieren, wie beispielsweise der Detektion mehrerer Sonden, Sonden mit Proteinen oder zellulären Markern.Mit diesen können Sie zusätzliche Fragen beantworten, wie zum Beispiel relative Expressionsmuster, Identitäten von Zellen und subzellulären Kompartimenten sowie Effekte in unterschiedlichen genetischen Hintergründen oder bei Krankheiten. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die meisten Arten der In-situ-Hybridisierung in jedem Gewebetyp oder Embryo durchgeführt werden. Vergessen Sie nicht, dass das Arbeiten mit Reagenzien wie Formaldehyd, Wasserstoffperoxid und Formamid äußerst gefährlich sein kann, und dass stets Vorsichtsmaßnahmen wie eine sachgemäße Handhabung und Entsorgung während des Verfahrens getroffen werden müssen.

high-resolution-fluorescent-situ-hybridization-drosophila-embryos

Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

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Zebrafisch Whole Mount High-Resolution Doppel Fluorescent In-situ Hybridisierung

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Mesoscopic Fluoreszenz-Tomographie für In-vivo Imaging der Entwicklungsländer Drosophila</em

Whole Berg RNA Fluorescent<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryonen

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Hybridisierungskettenreaktion FISH im sich entwickelnden Drosophila-Optikuslappen

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