Optische Überprüfung der neuartige Bakterien-spezifischen Sonden auf Ex Vivo menschlichen Lungengewebe durch konfokale Laser Endomikroskopie

Dieses Verfahren beschreibt ein effizientes Screening-Verfahren für die Bewertung der Bakterien-spezifische optische Bildgebung Agents in ex Vivo menschlichen Lungengewebe durch geädert konfokale Fluoreszenzmikroskopie für die schnelle Identifizierung von chemischen kleines Molekül Sonde-Kandidaten mit Potenzial übersetzbar.

Das übergeordnete Ziel dieses optischen Bildgebungsverfahrens ist es, ein Mittel für das schnelle Screening neuartiger bakterienspezifischer optischer Sonden bereitzustellen, die möglicherweise klinisch für die Bildgebung von Infektionen in der menschlichen Lunge geeignet sind. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen im Bereich der molekularen Bildgebung zu beantworten, z. B. ob neuartige optische Verbindungen spezifisch für ihr Ziel sind und ob sie nachweisbar sind. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie übersetzbar ist.

Die Auswahl vielversprechender bildgebender Sonden mit den in der Klinik verfügbaren Geräten gibt Ihnen die Gewissheit, dass die Sonden in dieser Umgebung funktionieren. Nehmen Sie unmittelbar vor der Bildgebung die menschliche Lungengewebeprobe auf Trockeneis aus dem Gefrierschrank. Lassen Sie das Gewebe bei Raumtemperatur leicht auftauen, damit es mit einem Skalpell in ein mal vier Millimeter große Schnitt geschnitten werden kann.

Legen Sie das geschnittene menschliche Lungengewebe mit einer Pinzette in Vertiefungen mit einer 96-Well-Kulturplatte mit klarem Flachboden. Nicht verwendetes menschliches Lungengewebe sofort in den Vorratsbehälter zurückgeben und für den Transport zurück in den minus 80 Grad Celsius Gefrierschrank auf Trockeneis legen. Geben Sie anschließend mit einer Pipette 100 Mikroliter PBS zu jeder Lungengewebeprobe, um das Blut aus der Probe zu waschen.

Verwenden Sie die Pipettenspitze, um sicherzustellen, dass das gesamte Gewebe mit dem PBS bedeckt ist und nicht an den Wänden der Vertiefung klebt. Entfernen und entsorgen Sie das PBS. Pipettieren Sie dann 100 Mikroliter ungefärbte, mit Calcein AM markierte oder mit Testsonden markierte Bakterien in jede Vertiefung, die Lungengewebe enthält.

Richten Sie außerdem Kontrollen mit Lungengewebe in 100 Mikrolitern PBS ein. Reinigen Sie zunächst die faserkonfokale Fluoreszenzmikroskopie-Bildgebungsfaser-Verbindungseinheit mit einem Faserreiniger. Reiben Sie den Stecker am Reinigungsband in einer Vorwärtsbewegung, um Staub und Schmutz zu entfernen.

Entfernen Sie die gelbe Schutzkappe von der Vorderseite des Laserscanning-Geräts. Bereiten Sie die LSU-Nabe vor, indem Sie die silberne Nabe vorsichtig gegen den Uhrzeigersinn drehen, bis sie anhält. Stecken Sie den FCFM-Imaging-Faserstecker nach oben.

Halten Sie die Faser an Ort und Stelle und drehen Sie die silberne Nabe im Uhrzeigersinn, bis sie zweimal einrastet. Schließen Sie die Verbindung ab, indem Sie die silberne Nabe um weitere 45 Grad im Uhrzeigersinn drehen. Befolgen Sie als Nächstes die Anweisungen, die angezeigt werden, um die FCFM-Bildgebungsfaserkalibrierung abzuschließen.

Führen Sie zunächst den FCFM-Bildgebungsfasertest durch, indem Sie die Start-Lasertaste auf dem Bildschirm drücken. Der Laser zentriert sich. Wählen Sie frische Fläschchen aus dem Kalibrierkit aus und befolgen Sie die Anweisungen auf dem Bildschirm.

Legen Sie das distale Ende der FCFM-Bildgebungsfaser in das gelbe Fläschchen und beobachten Sie die Zunahme der Fluoreszenz auf dem Monitor. Legen Sie dann die Faserspitze ohne Rühren in das rote Fläschchen. Warten Sie, bis die Fluoreszenz verschwunden ist.

Spülen Sie zum Schluss die Faserspitze in das blaue Fläschchen. Führen Sie als Nächstes eine Hintergrundaufnahme durch, indem Sie die FCFM-Bildgebungsfaser in das blaue Fläschchen einsetzen. Drücken Sie auf Start Laser und dann auf Berechnen, wenn dies zu einer Option wird.

Führen Sie abschließend eine Fasererkennung durch, indem Sie die FCFM-Bildgebungsfaser in das gelbe Fläschchen einlegen. Drücken Sie erneut auf Start Laser und anschließend auf Berechnen. Reinigen Sie während der automatischen Kalibrierung das distale Ende der FCFM-Bildgebungsfaser, indem Sie es länger als 10 Sekunden in das rote Fläschchen legen, gefolgt von dem blauen Fläschchen für mindestens vier Sekunden, wie von der Software angezeigt.

Um die Datenerfassung zu starten, klicken Sie auf Bildschirm starten oder drücken Sie das linke Fußpedal, um den Laser einzuschalten. Stellen Sie als Nächstes jede der bakteriellen Suspensionsproben ab. Führen Sie das distale Ende der FCFM-Bildgebungsfaser ein und bewegen Sie die Faser langsam durch die Suspension, um die Probe abzufragen.

Nehmen Sie Videos beliebiger Länge auf, indem Sie das rechte Fußpedal drücken oder die Aufnahmesteuerung auf dem Bildschirm auswählen, während sich die Faser langsam um das Sample bewegt. Reinigen Sie das distale Ende der FCFM-Bildgebungsfaser mit 8 % Wasserstoffperoxid und Linsenreinigungstüchern zwischen den Proben. Um jede der Lungengewebeproben abzubilden, führen Sie das distale Ende der FCFM-Bildgebungsfaser in die Probe ein und stellen Sie sicher, dass ein direkter Kontakt zwischen dem Ende der Faser und dem Gewebe hergestellt wird.

Bewegen Sie dann vorsichtig das Ende der Bildgebungsfaser, um die Probe abzufragen. Wenn Sie das Ende der Faser vom Gewebe wegheben, wird das Gewebe aus der Brennebene entfernt. Dies kann jedoch verwendet werden, um markierte Bakterien abzubilden, die nicht am Gewebe haften.

Nehmen Sie Videos beliebiger Länge auf, indem Sie das rechte Fußpedal drücken oder die Aufnahmesteuerung auf dem Bildschirm auswählen, während sich die Faser langsam um das Sample bewegt. Reinigen Sie das distale Ende der FCFM-Bildgebungsfaser mit Linsenreinigungstüchern und 8 % Wasserstoffperoxid zwischen den Proben. Um das System auszuschalten, schalten Sie den Laser aus, indem Sie das linke Fußpedal drücken oder auf die Bildschirmtaste klicken.

Trennen Sie als Nächstes die FCFM-Bildgebungsfaser vom CLE-Gerät, indem Sie den silbernen LSU-Hub bis zum Anschlag gegen den Uhrzeigersinn drehen. Entfernen Sie dann die FCFM-Bildgebungsfaser vom LSU-Hub, indem Sie den Glasfaserstecker vorsichtig aus der LSU ziehen. Bringen Sie die Schutzkappen wieder an das proximale Ende der FCFM-Bildgebungsfaser an der Vorderseite der LSU-Einheit an.

Reinigen und desinfizieren Sie die FCFM-Bildgebungsfaser mit 8 % Wasserstoffperoxid und Linsenreinigungstüchern. Zum Schluss legst du die Faser vorsichtig in die Aufbewahrungsbox. Öffnen Sie die Software und importieren Sie die Dateien für die Analyse, indem Sie das entsprechende Verzeichnis auf dem Computer über das Symbol "Gehe zu" auf dem Software-Dashboard auswählen.

Doppelklicken Sie auf jede Videodatei, um sie zu öffnen. Die Videos werden automatisch mit der optimierten Farbnachschlagetabelle abgespielt und die Farbtabelle angepasst. Deaktivieren Sie die automatische Intensitätsskalierung, indem Sie auf die Schaltfläche "Zauberstab" über der Intensitätsskala klicken.

Die Funktion ist deaktiviert, wenn keine schwarzen Schatten um die Schaltfläche herum vorhanden sind. Wählen Sie die gewünschte Intensitätsskalierung aus, indem Sie die minimalen und maximalen Balken verschieben, um den besten Kontrast zu erzielen. Verwenden Sie das Histogramm-Werkzeug, wenn Sie die Intensitätsskalierung auswählen, um sicherzustellen, dass der größtmögliche Dynamikbereich erfasst wird.

Sobald die gewünschte Skalierung erreicht ist, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Dropdown-Menüschaltfläche, die standardmäßig grün angezeigt wird. Wählen Sie die Option zum Speichern der Nachschlagetabelle aus. Speichern Sie die Nachschlagetabelle an einem gewünschten Speicherort.

Wenden Sie für jedes andere Video innerhalb des Datensatzes dieselbe Nachschlagetabelle an, indem Sie mit der rechten Maustaste auf das standardmäßige grüne Dropdown-Menü klicken und Nachschlagetabelle laden auswählen. Wählen Sie die entsprechende Datei aus, um eine konsistente Intensitätsskalierung auf alle Videos innerhalb des Datensatzes anzuwenden. Exportieren Sie die verarbeiteten Videos, indem Sie auf die Schaltfläche "Filmrolle" klicken.

Wählen Sie das gewünschte Videoformat aus, um eine MPG-Datei zu erstellen. Drücken Sie dann auf Exportieren und wählen Sie den Dateispeicherort aus, um die Videodatei zu speichern. Markierte Bakterien werden im Video als grün blinkende Punkte visualisiert.

Die Struktur des Lungengewebes ist als geordnete Fluoreszenzstränge erkennbar, wobei der Alveolarraum schwarz erscheint. Unmarkierte Staphylokokken-Aureus-Bakterien fluoreszieren nicht, wenn sie mit FCFM abgebildet werden, was den Bedarf an optischen Bildgebungsverbindungen zeigt. Staphylokokken aureus, die erfolgreich von fluoreszierenden Verbindungen markiert wurden, die einem Screening unterzogen werden, sind sichtbar, wenn sie mit FCFM abgebildet werden.

Die Abbildung zeigt einen erfolgreich markierten Staphylokokken aureus. Menschliches Lungengewebe fluoresziert bei 488 Nanometern selbstfluoreszierend. Das Video zeigt menschliches Lungengewebe, das mit FCFM abgebildet wurde.

Dem Gewebe wurden unmarkierte Staphylokokken aureus zugesetzt. Sie sind nicht zu sehen. Erfolgreich markierte Bakterien können jedoch vor dem Hintergrund eines menschlichen Lungengewebes durch FCFM-Bildgebung als kleine funkelnde punktförmige Punkte gesehen werden.

Einmal gemeistert, kann diese Technik je nach Probenanzahl in 10 Minuten durchgeführt werden. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Faser gründlich zu reinigen, wenn Sie Setup-Kalibrierungen durchführen und zwischen den Probenbildern. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie das FCFM-Gerät für die Bildgebung biologischer Proben einrichten und wie Sie die erfassten Daten verarbeiten.

Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie die CFU-Beschichtung durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie die Bestimmung der bakteriellen Zellzahl und der Lebensfähigkeit nach der Markierung zu beantworten. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit menschlichem Gewebe und pathogenen Bakterien gefährlich sein kann und bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie die Verwendung von persönlicher Schutzausrüstung getroffen werden sollten.