In Vitro und In Vivo Nachweis von Mitophagy in menschlichen Zellen, C. Elegansund Mäuse

Das übergeordnete Ziel dieser Experimente ist es, den Grad der Mitophagie in menschlichen Zellen, C.elegans und Mäusen zu bewerten. Die Mitophagie ist zu einem sehr wichtigen Konzept an der Schnittstelle von Neurodegeneration, Stoffwechselerkrankungen und Altern geworden, und der Einblick in die hier vorgestellten Methoden und deren zukünftige Anwendung könnte dazu beitragen, Fortschritte in diesem wichtigen Bereich zu erzielen. Die Hauptvorteile dieser Technik bestehen darin, dass sie Mitophagie auf robuste und effiziente Weise nachweist und den Nachweis von Mitophagie sowohl in vitro als auch in vivo ermöglicht.

Diese hier vorgestellte Technik wird Forschern helfen, neue Erkenntnisse zu gewinnen und neue Strategien für die Therapie von neurogenerativen Erkrankungen wie Alzheimer und Parkinson zu entwickeln, bei denen wir wissen, dass es eine mitochondriale Dysfunktion gibt. Diese Methode bietet nicht nur Einblicke in die molekularen Mechanismen der Mitophagie, sondern kann auch zur Entdeckung neuartiger Wirkstoffkandidaten durch das Screening von Mitophagen-Induktoren führen. Die visuelle Demonstration dieser Methoden ist von entscheidender Bedeutung, da die Mitophagiewerte sehr empfindlich auf Veränderungen der experimentellen Bedingungen sowohl bei C.elegans als auch bei Mäusen reagieren.

Säen Sie 300.000 bis eine Million Zellen in einer 35-Millimeter-Mikrotiterschale mit Glasboden, 10-Millimeter-Mikrotiter, so dass die Zellen am nächsten Tag eine Konfluenz von 70 % erreichen. Bewahren Sie die Zellen in vollständigem Zellkulturmedium auf und inkubieren Sie sie in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Am nächsten Tag verdünnen Sie 15 Mikroliter des DNA-Transfektionsreagenzes mit 150 Mikrolitern freiem Serummedium gemäß dem Protokoll des Herstellers.

Verdünnen Sie außerdem zwei bis fünf Mikrogramm der Mito-Keima-Plasmid-DNA mit 150 Mikrolitern serumfreiem Medium. Geben Sie das verdünnte Mito-Keima-Plasmid in das verdünnte DNA-Transfektionsreagenz und wirbeln Sie die Mischung 10 Sekunden lang ein. Dann die Mischung 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.

Geben Sie dann die DNA-Transfektionsreagenzmischung tropfenweise zu den Zellen und schütteln Sie die Platten vorsichtig fünf bis 10 Sekunden lang, um die Lösung zu mischen. Zu diesem Zeitpunkt legen Sie die Zellen wieder in den Inkubator und inkubieren sie 24 Stunden lang. Wechseln Sie das Medium am nächsten Tag auf frisches vollständiges Zellkulturmedium und inkubieren Sie die transfizierten Zellen für weitere 24 Stunden.

Bilde die transfizierten Zellen mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie. Bilden Sie 20 Bereiche mit 40-facher Vergrößerung nach dem Zufallsprinzip ab, um insgesamt 100 bis 200 Zellen in jedem Well zu dokumentieren. Am ersten Tag werden L4-Larven von transgenen Tieren, die sowohl DCT-1 GFP als auch DSRed LGG-1 in Körperwandmuskelzellen exprimieren, entnommen und auf eine mit OP50 ausgesäte Nematoden-Wachstumsmedienplatte gelegt.

Platzieren Sie fünf bis 10 Würmer auf jeder 3,5 Zentimeter großen Platte, wobei Sie mindestens drei Platten verwenden. Wenn Sie fertig sind, inkubieren Sie die Nematoden bei 20 Grad Celsius. Synchronisieren Sie die Nematoden am fünften Tag, indem Sie 15 bis 20 L4-transgene Larven auswählen und auf frische, mit OP50 ausgesäte Platten übertragen.

Verwenden Sie mindestens fünf Platten für jede Versuchsbedingung. Bereiten Sie am siebten Tag einige der Fahrzeugplatten für die Mitophagie vor, die sich auf Arzneimittel von Interesse auswirkt, und andere, um sie als Positivkontrollen zu verwenden. Als nächstes setzen Sie die mit E.coli ausgesäten Platten 15 Minuten lang UV-Licht mit einer Intensität von 222 Mikrowatt pro Quadratzentimeter aus, um sicherzustellen, dass die Mitophagie-induzierenden Verbindungen auf den Platten nicht von Bakterien verstoffwechselt werden.

Fügen Sie nun die interessierende Verbindung in 10 Mikrolitern auf die Oberseite der gesäten Platten hinzu und fügen Sie den Fahrzeugplatten eine entsprechende Menge zusammengesetztes Vehikel als Negativkontrolle hinzu. Für eine positive Kontrolle der Mitophagie-Induktion fügen Sie Paraquat hinzu, ein mitochondriales Gift. Schwenken Sie die Platten vorsichtig, bis die Lösung die gesamte Oberfläche bedeckt, und lassen Sie die Platten bei geschlossenen Deckeln mindestens eine Stunde lang bei Raumtemperatur trocknen.

Nach dem Trocknen werden 10 bis 20 zwei Tage alte erwachsene transgene Tiere auf die Platten gegeben. Inkubieren Sie sie zwei Tage lang bei 20 Grad Celsius. Bereiten Sie am neunten Tag 2%ige Agarose-Pads vor und fügen Sie pro Pad einen Tropfen 20 millimolare Levamisol in M9 hinzu.

Immobilisieren Sie die transgenen Tiere für die Bildgebung, indem Sie sie in den M9-Levamisol-Tropfen legen. Legen Sie dann vorsichtig einen Deckzettel auf die Oberseite des Tropfens. Legen Sie die Probe auf einen konfokalen Mikroskoptisch und bilden Sie die Muskelzellen an der einzelnen Körperwand ab, indem Sie Z-Stapel-Bilder mit 63-facher Vergrößerung aufnehmen.

Legen Sie eine frische, isolierte Mito-Keima-Mausleber auf eine gekühlte Metallplatte auf Eis, um das Gewebe schnell abzukühlen. Bewahren Sie es dort auf, während Sie das Gewebe so schnell wie möglich verarbeiten, da das Signal des Mito-Keima-Proteins auf dem Eis bis zu einer Stunde lang stabil bleibt. Als nächstes heben Sie die Leberprobe mit einer gebogenen Pinzette an und spülen sie mit fünf Millilitern eiskaltem PBS ab.

Zum Schluss bilden Sie die Gewebeschnitte mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie mit zwei aufeinanderfolgenden Anregungen ab. Mit dem hier vorgestellten Verfahren wurden humane HeLa-Zellen mit dem Mito-Keima-Plasmid transfiziert. Gesunde Zellen zeigten ein gut organisiertes mitochondriales Netzwerk mit wenigen Vorkommen von Mitophagie.

Zellen, die mit einem mitochondrialen Entkoppler FCCP vorbehandelt waren, zeigten jedoch einen tiefgreifenden Anstieg der Mitophagie-Inzidenz. Die Mitophagie wurde auch anhand der Kolokalisation von LAMP2 und COXII gemessen. Für den in vivo Nachweis der Mitophagie in C. elegans wurden transgene Nematoden, die MT rosella in Körperwandmuskelzellen exprimieren, mit acht Millimolaren Paraquat behandelt.

Es wurde festgestellt, dass das Ausmaß der Mitophagie-Induktion, das durch eine Abnahme des pH-sensitiven Fluoreszenzverhältnisses angezeigt wurde, bei den mit Paraquat behandelten Nematoden signifikant verringert war. Darüber hinaus deutet die erhöhte Anzahl von Kolokalisationsereignissen zwischen DCT-1-fusioniertem GPF und DSRed-fusioniertem LGG-1 auf eine Mitophagie-Stimulation als Reaktion auf oxidativen Stress hin. Schließlich zeigen diese Bilder Mito-Keima-Signale aus der Leber und dem Kleinhirn einer Mito-Keima-Maus.

Das Gewebe muss so schnell wie möglich kalt gehalten und abgebildet werden, aber wenn es richtig vorbereitet ist, kann es verwendet werden, um Einblicke in die Mitophagie unter normalen und pathophysiologischen Bedingungen zu geben. Der Einsatz dieser Technik hat Forschern auf dem weiten Feld der Neurodegeneration und der Mitochondrienbiologie den Weg geebnet, mitochondriale Funktionen in verschiedenen Modellsystemen zu erforschen, darunter kultivierte Zellen, Würmer oder C. elegans und Mausmodelle. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein Verständnis für mehrere Methoden haben, die Sie bei der quantitativen Bewertung der Mitophagiespiegel sowohl bei C.elegans als auch bei Mäusen verwenden können.