Targeting Cystein Thiole für in-vitro- standortspezifische Glykosylierung von rekombinanten Proteinen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Cysteinreste in Proteine durch ortsgerichtete Mutagenese an nativ glykosylierten Stellen zu integrieren und in-vitro-Glukosebindungs- und Bewertungsansätze zu verwenden, um die Effizienz und die strukturellen Effekte der Glykosylierung zu bewerten. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Strukturbiologie zu beantworten, wie z.B. was sind die strukturellen Konsequenzen der Proteinglykosylierung und wie beeinflussen diese Modifikationen die zugrunde liegenden Funktionsmechanismen? Die Hauptvorteile dieser Technik bestehen darin, dass sie leicht an die Untersuchung oder Handhabung der Glykosylierung angepasst werden kann.

Es ist hocheffizient und sowohl Strukturstörungen als auch Effizienz können schnell beurteilt werden. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auch auf die Therapie von Krankheiten, da veränderte Glykosylierungsmuster mit verschiedenen Krebsarten und neurodegenerativen Erkrankungen in Verbindung gebracht wurden. Obwohl diese Methode einen Einblick in die Auswirkungen von nativ glykosylierten Proteinen geben kann, könnte sie auch dringend benötigte Informationen darüber liefern, wie die Veränderung von Glykosylierungsmustern zu dieser Reihe von Krankheiten beitragen kann.

Um eine einzelne Cysteinmutation in den Expressionsvektor einzuführen, bereiten Sie zwei einzelne PCR-Reaktionsröhrchen vor. In die erste Tube den vorwärtsmutagenen Primer und in das zweite Röhrchen den umgekehrten mutagenen Primer geben. Geben Sie eine Endkonzentration von 1X PCR-Puffer in beide Röhrchen.

Richten Sie dann ein Fünf-Zyklus-Programm für die beiden separaten PCR-Reaktionsröhrchen ein. Fügen Sie am Ende des fünften Zyklus eine Verlängerungszeit von siebeneinhalb Minuten bei 72 Grad Celsius hinzu. Nachdem die fünf Zyklen abgeschlossen sind, mischen Sie die beiden separaten PCR-Reaktionen in einem einzigen Röhrchen, zentrifugieren Sie das Röhrchen etwa drei Sekunden lang und wiederholen Sie weitere 20 Zyklen unter denselben PCR-Bedingungen.

Lassen Sie anschließend 15 Mikroliter der Probe 40 Minuten lang auf einem 1%DNA-Agarosegel bei 120 Volt laufen. Tauchen Sie das Gel dann in Wasser mit 0,5 Milligramm Ethidiumbromid pro Milliliter und schütteln Sie es 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Bestätigen Sie dann die Amplifikation des Templates unter UV-Licht bei einer Wellenlänge von 302 Nanometern.

Fügen Sie danach 0,5 Mikroliter DPN1-Restriktionsenzym zu den restlichen 25 Mikrolitern PCR-Reaktionsmischung hinzu. Inkubieren Sie die Mischung zweieinhalb Stunden lang bei 37 Grad Celsius, um die methylierte Matrizen-DNA zu verdauen. Geben Sie dann etwa fünf bis 10 Mikroliter der verdauten Mischung zu 100 Mikrolitern Hitzeschock-kompetenten E.coli-Zellen und inkubieren Sie sie 60 Minuten lang auf Eis.

Dann schocken Sie das Zell-DNA-Gemisch 45 Sekunden lang bei 42 Grad Celsius auf einem trockenen Hitzeblock. Dann die Mischung sofort drei Minuten lang auf Eis inkubieren. Geben Sie anschließend 900 Mikroliter LB-Bouillon zu den Zellen und überführen Sie die Suspension in ein steriles 14-Milliliter-Röhrchen mit rundem Boden.

Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius unter ständigem Schütteln bei 190 U/min für 90 Minuten. Verteilen Sie dann das zentrifugierte Zellpellet auf mit Antibiotika ergänzten Agarplatten. Inkubieren Sie die Platten 16 Stunden lang bei 37 Grad Celsius.

Am nächsten Tag inokulieren Sie eine einzelne Kolonie von der Platte aseptisch in fünf Milliliter mit Antibiotika angereichertes LB-Medium. Lassen Sie die Kultur dann über Nacht bei 37 Grad Celsius unter ständigem Schütteln wachsen. Wandeln Sie das durch Cysteinreste mutierte Plasmid durch Hitzeschockbehandlung in E.coli-Zellen um, gefolgt von der Züchtung der Kultur über Nacht in mit Antibiotika angereichertem LB-Medium.

Verteilen Sie am nächsten Tag direkt 150 Mikroliter Zellsuspension auf Kanamycin-supplementierte LB-Agar-Platten und halten Sie die Platten für die Inkubation über Nacht bei 37 Grad Celsius. Am nächsten Tag wird eine einzelne Kolonie in 20 Millilitern LB-Medium aseptisch in einen Erlenmeyerkolben überführt und über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubiert. Am nächsten Tag überführen Sie die Übernachtkultur in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen.

Pelletieren Sie dann die Zellen, indem Sie die Flüssigkultur über Nacht 15 Minuten lang bei 2.400 G zentrifugieren. Als nächstes fügen Sie dem Zellpellet 10 Milliliter M9-Minimalmedium hinzu und suspendieren Sie dann das Zellgemisch in einem Liter M9-Medium, das Kanamycin enthält. Wachsen Sie die M9-Flüssigkultur bei 37 Grad Celsius mit ständigem Schütteln bei etwa 190 U/min, bis die optische Dichte bei 600 Nanometern etwa 0,6 bis 0,8 erreicht.

Geben Sie dann 200 Mikromolar IPTG in die M9-Kultur, um die Proteinexpression zu induzieren, und lassen Sie die Kultur über Nacht wachsen. Am nächsten Tag pelletieren Sie die Bakterienzellen aus der Nachtkultur, indem Sie sie 30 Minuten lang bei etwa 10.000 Mal G bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Mit einer motorisierten 10-Milliliter-Transferpipette wird das gefrorene Bakterienzellpellet in etwa 40 Millilitern Homogenisierungspuffer homogenisiert.

Anschließend wird das Homogenat 90 Minuten lang in einem Hybridisierungsofen mit konstanter Rotation inkubiert. Zentrifugieren Sie das Gemisch bei etwa 15.000 mal G bei acht Grad Celsius für 40 Minuten, um die lösliche Proteinfraktion von dem unlöslichen Pellet zu trennen. Geben Sie dann 50 Vol.-% Nickelnitrilotriaessigsäure Agarose-Bead-Aufschlämmung in den Überstand und inkubieren Sie durch Inversion im Hybridisierungsofen für 90 Minuten bei Raumtemperatur.

Verwenden Sie als Nächstes eine Schwerkraftfluss-Proteinreinigungssäule, um die Agarosekügelchen mit Hexahistidin-markiertem Protein zu sammeln, das an das Nickel gebunden ist. Zum Schluss die gesammelten Agaroseperlen dreimal waschen. Eluieren Sie die Proteine in einer Reihe von zwei Milliliterfraktionen.

Bestätigen Sie als Nächstes das gereinigte Hexahistidin-markierte Protein in den eluierten Fraktionen, indem Sie ein Coomassie-Blau-gefärbtes SDS-PAGE-Gel laufen lassen. Die eluierten Proteinfraktionen werden in eine Dialysemembran mit einem Molekulargewichtsgrenzwert von 3.500 Dalton gepoolt und über Nacht unter magnetischem Rühren in einem Umfaltungspuffer bei vier Grad Celsius inkubiert. Fügen Sie dann etwa eine Einheit Thrombin pro Milligramm Protein zu dem gepoolten Protein in der Dialysemembran hinzu und inkubieren Sie erneut einen Tag lang bei vier Grad Celsius.

Am nächsten Tag nehmen Sie das Protein aus dem Dialysebeutel und konzentrieren es mit einem Ultrafiltrations-Zentrifugalkonzentrator mit einem Molekulargewichtsgrenzwert von 10.000 Dalton etwa um das Zehnfache. Anschließend wird das Proteinkonzentrat in natriumchloridfreiem Rückfaltungspuffer ca. 20-fach wieder verdünnt. Um das Protein zu reinigen, laden Sie es auf eine vorgepackte Anionenaustauschersäule, die mit demselben natriumchloridfreien Puffer äquilibriert ist.

Beginnen Sie mit der Eluierung der Proteine in einem Gradienten von null bis 60 % eines molaren Natriumchlorids, das Refaltungspuffer enthält. Übertragen Sie die gepoolten Proteinfraktionen in einen Dialysebeutel. Führen Sie über Nacht einen Dialyseschritt bei vier Grad Celsius durch, um das Protein in den experimentellen Rückfaltungspuffer mit der optimalen molaren Konzentration von Natriumchlorid auszutauschen.

Zuerst werden 1,5 Milliliter von etwa 60 mikromolaren Proteinen in einen Liter Modifikationspuffer für die Glykosylierung des Proteins dialysiert. Nach 24 Stunden bei vier Grad Celsius wird das modifizierte Protein in ein Mikrozentrifugenröhrchen überführt und DMSO-gelöste Glukose-5-MTS bis zu einer Endkonzentration von zwei Millimolaren hinzugefügt. Klopfen Sie alle 10 Minuten vorsichtig auf das Mikrozentrifugenröhrchen, während Sie die Probe eine Stunde lang im Dunkeln bei Umgebungstemperatur inkubieren.

Nach der Inkubation wird eine Dialyse bei vier Grad Celsius durchgeführt, um das Protein wieder in den endgültigen experimentellen Puffer zu ersetzen. Messen Sie die genaue Masse des Proteins mit Hilfe der Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie. Verwenden Sie schließlich die Lösungs-NMR, um die Modifikationseffizienz zu berechnen und die strukturellen Veränderungen von glykosylierten Cys-Resten im Protein zu identifizieren.

Eine erfolgreiche Mutations-PCR-amplifizierte Matrizen-DNA wird in diesem repräsentativen 1%DNA-Agarose-Gel gezeigt. Die DNA-Leiter und eine äquivalente Menge an Matrizen-DNA, die nicht durch PCR amplifiziert wurde, werden als Kontrollen im Gel verwendet. Die oberste Bande mit hochintensiver Ethidiumbromid-Färbung zeigt das amplifizierte Template in der gewünschten Größe.

Anschließend wurde das Protein mit einer Anionenaustauschsäule aufgereinigt. Das Chromatogramm zeigt ein Elutionsprofil, das bei 280 Nanometern in Blau beobachtet wurde und drei Peaks aufweist, die gegen einen Natriumchloridgradienten eluieren, der mit zunehmender Konzentration bis zu 0,6 molar rot dargestellt ist. Das untere Bild zeigt ein Coomassie-blau gefärbtes SDS-PAGE-Gel der Proteinfraktionen.

Die Glykosylierung der Cysteinreste wurde mittels Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie bestimmt. Das Chromatogramm zeigt die Massen des unmodifizierten und modifizierten Proteins vor und nach der Glykosylierung des Cysteinrests. Zur Bestätigung wurde eine Lösungs-NMR durchgeführt, die die spektrale HSQC-Überlagerung der restspezifischen chemischen Amidverschiebungen zeigte, was sowohl auf Modifikationen als auch auf strukturelle Störungen des glykosylierten Proteins hinweist.

Wenn es gemeistert ist, können alle Phasen von der Mutagenese bis zur NMR-Bewertung in etwa 12 Tagen abgeschlossen werden, ohne die Wartezeit für die Primersynthese, die DNA-Sequenzierung und die Massenspektroskopie. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die strukturellen und biophysikalischen Auswirkungen der Cysteinmutationen in Abwesenheit der Thiolmodifikation als Basiskontrollmessungen zu bewerten. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie Stabilität, Sekundärstruktur, Ionenbindung und Protein-Protein-Interaktionsbewertungen durchgeführt werden, um aufzuzeigen, wie die biophysikalischen Eigenschaften der zugrunde liegenden Proteinfunktionen durch die Glykosylierung beeinflusst werden.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Kalziumsignalisierung, um die Rolle von Asparagin 131 und Asparagin 171 sowie die Glykosylierung in der stromalen Wechselwirkung mit dem Molekül ein Kalziumsignal, das mit dem speicherbetriebenen Kalziumeintritt verbunden ist, individuell und kumulativ zu bewerten.