Mapping genomweite zugänglich Chromatin in primären menschlichen T-Lymphozyten durch ATAC-Seq

Das übergeordnete Ziel dieser Hochdurchsatzmethode mit Transposase ist es, zugängliche Chromatinregionen im menschlichen Genom zu identifizieren. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen in den epigenomischen Bereichen zu beantworten, wie z. B. die genomweite Position regulatorischer Elemente. Die Hauptvorteile dieser Technik bestehen darin, dass sie robust und relativ kurz ist und im Vergleich zu anderen Methoden zur Messung der Chromatinzugänglichkeit wie DNase-seq oder FAIRE-seq weniger Ausgangsmaterial benötigt.

Obwohl diese Methode einen Einblick in die regulatorische Landschaft menschlicher T-Lymphozyten geben kann, kann sie auch auf andere Systeme wie andere menschliche Primärzellen, Krebszellen, menschliche klinische Proben, Zellen anderer Säugetiere und Organismen angewendet werden. Tauen Sie ein Ein-Milliliter-Aliquot von 10 Millionen menschlichen PBMCs auf und übertragen Sie es in ein 50-Milliliter-Röhrchen mit 10 Millilitern supplementiertem RPMI-Medium. Sie zentrifugieren die Zellen bei 500 G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius.

Entfernen Sie anschließend den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 15 Millilitern supplementiertem RPMI-Medium. Dann werden die Zellen in einen T-75-Kulturkolben überführt und über Nacht mit Befeuchtung inkubiert. Am nächsten Tag überführen Sie die schwimmenden Zellen mit einer sterilen 25-Milliliter-Pipette in ein 50-Milliliter-Röhrchen.

Zählen Sie dann die lebenden Zellen mit dem Trypanblau-Ausschluss. Isolieren Sie als Nächstes die CD4-positiven Zellen von 10 Millionen lebenden, nicht adhärenten PBMCs mit einer Mikrokügelchen-Trennsäule. Sobald die Zellen isoliert sind, plattieren und aktivieren Sie die T-Zellen unter Th1- und Th2-Polarisationsbedingungen gemäß dem Textprotokoll und isolieren Sie dann ihre Kerne.

Bereiten Sie frischen Lysepuffer vor und bewahren Sie ihn auf Eis gekühlt auf. Zur Vorbereitung der Transpositionsreaktion wird außerdem ein thermischer Schüttler auf 37 Grad Celsius erwärmt. Laden Sie als Nächstes eine halbe Million T-Zellen in 1,5-Milliliter-Mikroröhrchen und schleudern Sie sie fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius bei 500 g herunter.

Waschen Sie anschließend die Zellen mit einem Milliliter kaltem PBS und wiederholen Sie den Schleudergang, aber suspendieren Sie die Zellen nun in einem Milliliter kaltem Lysepuffer. Mischen Sie die Zellen durch sanftes Pipettieren, um zu verhindern, dass die Zellkerne zu stark gestört werden. Nehmen Sie dann schnell 10-Mikroliter-Aliquots, um den Anteil der Zelllyse zu beobachten.

Achten Sie darauf, die Zellen kalt zu halten und schnell zu arbeiten. Fahren Sie innerhalb von fünf Minuten mit der Transpositionsreaktion fort. Übertragen Sie zunächst 100.000 Kerne in ein 1,5-Milliliter-Mikroröhrchen und schleudern Sie die Probe 10 Minuten lang bei 500 g in einer kalten Zentrifuge.

Entfernen Sie dann vorsichtig den Überstand. Als nächstes fügen Sie die Komponenten der Transpositionsreaktion zu den Kernen hinzu. Anschließend werden die Zellkerne durch sanftes Pipettieren resuspendiert und 30 Minuten lang auf dem thermischen Schüttler bei 500 U/min inkubiert, um die Transpositionsreaktion abzuschließen.

Führen Sie als Nächstes einen DNA-Aufreinigungsschritt durch und eluieren Sie die DNA-Fragmente in 20 Mikrolitern Trishydrochlorid. Verwenden Sie dann eine PCR, um eine erste Amplifikation der ATAC-Sequenzierungsbibliotheken vorzunehmen. Bewerten Sie als Nächstes die optimale Anzahl zusätzlicher Zyklen, die für die endgültige Amplifikation durch quantitative PCR erforderlich sind.

Bestimmen Sie aus den Messergebnissen die Anzahl der Zyklen, die für die endgültige PCR-Amplifikation der ATAC-Sequenzierungsbibliotheken benötigt werden. Führen Sie dann die letzte Verstärkung durch. Die Einrichtung einer optimalen Größe von DNA-Bibliotheksfragmenten kann die Sequenzierung der nächsten Generation verbessern.

Erwärmen Sie zunächst die magnetischen Kügelchen auf Raumtemperatur und bereiten Sie frisches 70%iges Ethanol in nukleasefreiem Wasser vor. Als nächstes fügen Sie den ATAC-Sequenzierungsbibliotheken nukleasefreies Wasser bis zu einem Volumen von 100 Mikrolitern hinzu. Fügen Sie dann 50 Mikroliter resuspendierte DNA-bindende Magnetbeads hinzu.

Pipettieren Sie die Kügelchen mindestens 10 Mal in die DNA und warten Sie fünf Minuten. Wenn Tropfen Perlen an der Tubenwand oder dem Deckel hängen bleiben, drehen Sie die Tube kurz. Legen Sie nun die Probe zwei Minuten lang neben den Magneten und übertragen Sie dann den Überstand in ein neues Mikroröhrchen.

Messen Sie das Volumen der Sammlung und fügen Sie eine Magnetbead-Suspension von 70 % hinzu. Die Kügelchen wie zuvor untermischen und fünf Minuten inkubieren lassen, bevor es weitergeht. Trennen Sie dann die Kügelchen mit dem Magneten für zwei Minuten und entsorgen Sie nun den Überstand.

Während Sie noch gegen den Magneten anliegen, fügen Sie den Kügelchen 200 Mikroliter 70%iges Ethanol hinzu. Warten Sie 30 Sekunden, entsorgen Sie dann das Ethanol und wiederholen Sie die Ethanolwäsche erneut. Beenden Sie die Wäschen, indem Sie das restliche Ethanol vollständig entfernen und die Kügelchen fünf Minuten lang auf dem Magneten an der Luft trocknen lassen.

Falls erforderlich, das Röhrchen kurz drehen und sichtbares Ethanol mit einer 10-Mikroliter-Pipette absaugen. Entfernen Sie nun das Röhrchen vom Magneten und fügen Sie 22 Mikroliter Trishydrochlorid hinzu. Stellen Sie das Röhrchen nach zwei Minuten wieder auf den Magnetständer und lassen Sie die Lösung klar.

Sammeln Sie dann 20 Mikroliter Eluat, das die vorbereitete Bibliothek enthält, und lagern Sie es bei minus 20 Grad Celsius. Dieses Protokoll erzeugt ATAC-Sequenzierungsbibliotheken, die typischerweise drei bis 20 Nanogramm pro Mikroliter umfassen. Wenn sie auf einem System zur DNA-Integritätsanalyse ausgeführt werden, haben sie ein leiterartiges Aussehen.

Eine weitere wichtige Qualitätskontrolle ist unter anderem die Anreicherung der Positivkontrollen. Bezogen auf die Negativkontrollen sollte das Primerpaar drei mindestens 25-fach und das Primerpaar vier mindestens 75-fach angereichert sein. Wenn die Stichprobe nach anfänglichen 10 Millionen Lesevorgängen alle wichtigen Parameter in der FastQC-Berichtsdatei erfüllt und 1.000 bis 2.000 Spitzen aus dem Spitzenaufruf erhalten werden, kann die Bibliothek für mehr als 30 Millionen Lesevorgänge tiefer sequenziert werden.

Von Bibliotheken, die die Qualitätsstandards erfüllen, werden nur sechs bis 20 % der Reads dem mitochondrialen Genom zugeordnet. Die verbleibenden Unique Reads werden dem menschlichen Referenzgenom zugeordnet und sieben bis 12 % liegen innerhalb der ATAC-Sequenzierungspeaks. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie ATAC-seq-Bibliotheken erstellen, Rationssequenzen einreichen und bereitstellen und die erhaltenen Daten analysieren.

Nach der Beherrschung kann die Vorbereitung der ATAC-seq-Bibliothek in ein bis zwei Arbeitstagen durchgeführt werden. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, dass Sie möglicherweise zuerst einige Schritte wie die Anzahl der Zellen und die Zusammensetzung des Lysepuffers in einem Zellkernisolationsschritt optimieren müssen. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie die Chromatin-Immunpräzipitation durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. welcher Transkriptionsfaktor an die offenen Chromatinregionen in den untersuchten Proben bindet?