Name: Methoden für Imaging intrazellulären pH der Follikel Stem Cell Linie in Live Drosophila Eierstockgewebe (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Erfahren Sie die Messung intrazellulären pH in Follikelzellen lebender Drosophila-Eierstöcke mittels quantitativer Fluoreszenzbildgebung. Diese Methode ermöglicht präzise pH-Bestimmungen in intaktem Gewebe und liefert Einblicke in Stammzellverhalten.

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Wir danken Bryne Ulmschneider für Beiträge zum Protokoll und Diane Barber für Anregungen zum Manuskript. Diese Arbeit wurde durch eine National Institute of Health Grant GM116384 T.G. Nystul und d.l. Barber finanziert.

Hinweis: um pHi in der FSC-Linie messen, wir berechnen Sie das Verhältnis der Fluoreszenz-Intensität von pHluorin auf mCherry in FSCs, PFC und Follikelzellen unter physiologischen Bedingungen, und konvertieren Sie die Verhältnisse in pHi-Werte mit Standard Kalibrierkurven für jede Zelle Typ 7. Zur Messung der Fluoreszenz-Intensität von pHluorin und mCherry in Germaria in einem Puffer mit Nahco3 3, die physiologischen Bedingungen 1 , imitiert zerlegt werden erste, live imaging Experimente durchgeführt 7. nächste, standard Kurven entstehen durch Messung von pHluorin und mCherry Fluoreszenz-Intensitäten in einem Na +-frei, K +-Puffer mit Ionophore Nigericin eingestellt auf zwei unterschiedliche pH-Werte, 6,5 und 7,5. In Anwesenheit von Nigericin pHi gestalten mit dem pH des Puffers in der Plasmamembran, pHi entsprechend den extrazellulären pH verursacht. Zu guter Letzt die Standardkurven werden verwendet, um pHluorin in mCherry Verhältnisse auf geschätzte pHi-Werte zu konvertieren.
 1. Pre-Trial: Vorbereitung vor der Messung pHi In Vivo Hinweis: pHi in Vivo zu messen, muss das mCherry::pHluorin Transgen in der Zelle Art von Interesse ausgedrückt werden. Im folgenden sind einige gemeinsame Wege zu transgenen pHluorin erzeugen in der FSC-Linie fliegt. Generierung von mCherry::pHluorin Klone eignet sich besonders zur Identifizierung FSCs, die am vorderen Rand des ein FSC-Klon befinden. Gewebe-spezifische mCherry::pHluorin-Ausdruck eignet sich zur Messung von pHi über das gesamte Gewebe und ist auch bequemer, wenn kombiniert mit Ausdruck einer RNAi oder Transgen.
<ol><li>Generation von transgenen pHluorin fliegt <ol><li>mCherry::pHluorin-Label FSC Klone <ol><li>mCherry::pHluorin FSC Klone zu überqueren UAS-mCherry::pHluorin- 1, ein Akt-Gal4 Flipout Lager oder andere Lager mit einem Flp/FRT induzierbaren Gal4.</li>
			<li>Um Heatshock induzierbaren Klone machen Heatshock Erwachsenen F1s für 2 Tage post Bewegungsapparate in leeren Fläschchen für 1 h bei 37 ° C Wasserbad, viermal ungefähr alle 12 h.</li>
			<li>Für normales Wachstum und Höchstsätze der Oogenese während dieses Zeitraums zu gewährleisten, halten fliegen durch die Bereitstellung von nassen Frischhefe (ungefähr gleiche Teile trocknen Bäcker &#39; s Hefe und Wasser) täglich für mindestens 6 Tage nach Klon Induktion.</li>
		</ol></li> <li>Gewebe spezifische mCherry::pHluorin Ausdruck</li> <li>Cross UAS-mCherry::pHluorin- 1 zu einem Follikel Zelle bestimmte Treiber, y 1 w *; P {GawB} 10930/CyO (Bloomington-ID: 7023).</li>
		<li>3 Tage nachdem fliegen umhüllenden, beginnen zu sammeln und legen Sie sie in Ampullen mit nassen Hefe für mindestens 24 h vor der Dissektion.</li>
	</ol></li> <li>Lösungen Hinweis: Es ist wichtig, die folgenden Puffer am Tag des Experiments vorzubereiten, weil der pH-Wert und gelösten Konzentrationen im Puffer im Laufe der Zeit ändern können.
	<ol><li>Bikarbonat, Nigericin und Dissektion Puffer vorbereiten. Fügen Sie die Komponenten in der Reihenfolge aufgelistet, um Bildung von Ausscheidungen (siehe Tabelle 1, Tabelle 2 und Tabelle 3) zu vermeiden.</li>
	</ol></li></ol> 2. Studie: Messung von pHi in der FSC-Linie Hinweis: die Dissektion, Montage, und Schritte für die Bicarbonat-Puffer und die zwei Nigericin Pufferbedingungen live imaging können zweimal durchgeführt werden müssen: einmal auf das Mikroskop bestimmen Einstellungen und ein zweites Mal, experimentelle Daten zu sammeln. Finden Sie im Abschnitt 2.2 unten für weitere Informationen.
<ol><li>Zerlegung und Montage Hinweis: Materialien erforderlich, um diesen Schritt ausführen, finden Sie in Abbildung 1 und Tabelle der Materialien. Für 3D gedruckte Montage Kammern sind 3D-Drucker Dateien als zusätzliche Datei 1 und ergänzende Datei 2 vorgesehen.
	<ol><li>Dissektion: <ol><li>Prepare Montage Kammern, indem eine dünne Schicht des Vakuum Fett auf der flacheren Seite des 3D gedruckt Montage Kammer. Legen Sie diese Seite auf einem Deckgläschen 22 x 40 mM, das Deckglas an die Montage-Kammer zu versiegeln.</li>
		</ol></li> <li>Sezieren Eierstöcke von weiblichen Erwachsenen fliegen in 500 µL Dissektion Puffer (Bicarbonat oder Nigericin Puffer, Tabelle 3) <ol><li>3-4 fliegen mit CO 2-Gas zu betäuben und Transfer fliegt auf eine Fliege Pad durchströmt mit CO 2 Gas.</li>
			<li>Einem narkotisierten fliegen mit Zange und Ort in die Dissektion Medien abholen.</li>
			<li>Kneifen den Brustkorb der Fliege mit einem Forcep beim zerren an der Spitze der seinen Bauch, bis die Eierstöcke ausgesetzt sind.</li>
			<li>Nach Abnehmen der Eierstöcke aus den anderen Organen, necken auseinander die Ovariolen mit 22 1/2 Spritze Nadeln. Sorgfältig getrennt der Muskel Mantel aus den Eierstöcken und separate individuelle Ovariolen aus dem Cluster von Ovariolen. Eine effektive Technik, die Muskel-Hülle zu isolieren ist mit einer Spritzennadel halten die Ansammlung von Ovariolen an seinem vorderen Ende und Strich nach unten entlang der Länge der einzelnen Ovariolen.</li>
			<li>Seziert Eierstöcke in Dissektion Medien genau 10 min inkubieren, bevor Sie fortfahren mit dem Montage-Schritt, so dass genügend für die pHi der Zellen Zeit, um voll und ganz mit dem pH der Nigericin Dissektion Medien equilibrate. 
			Hinweis: Sicherstellen Sie, dass der Muskel-Mantel aus den Ovariolen entfernt wird. Die Muskel Scheide kann das Fluoreszenzsignal, das macht es schwierig, einzelne Zellen mit identifizieren dämpfen Concanavilin-A, und verursachen Ovariolen spontan während der live Aufnahme verschieben.</li>
		</ol></li> <li>Montage <ol><li>legen Sie einen kleinen Tropfen der Dissektion Medien auf die Glas-Deckglas im Inneren der Kammer Montage.</li>
			<li>Übertragung getrennt mit Pinzette Ovariolen.</li>
			<li>Germaria Zusammenhang mit früheren Stadium Ei Kammern späteren Stufe Ei Kammern trennen und versuchen sicherzustellen, dass der seziert Germaria befinden sich in der Mitte der Dissektion Medien Drop.</li>
			<li>Zwei kleine Tropfen Nagellack auf gegenüberliegenden Seiten des eine Runde 12-mm-Deckglas und lassen Sie es an der Luft trocknen für ca. 10 s.</li>
			<li>Ort die Runde Deckglas auf den Rückgang der Dissektion Medien mit getrennt Germaria, so dass dieser Seite mit Nagellack nach unten zeigt und die Dissektion Medien Kontakte. Drücken Sie auf die Teile des Randes mit Nagellack zu glätten und die Germaria in Position zu sichern. Wir empfehlen die Verwendung älterer Nagellack, weil es schmiert weniger über die Oberfläche des das Deckglas, da es im Ort gesichert ist.</li>
			<li>Füllen Sie die Montage-Kammer mit zusätzlichen Dissektion Medien. Zustand bestimmte Puffer, die keine Concanavalin-A Farbstoff enthält kann verwendet werden, um die Kammer füllen. 
			Hinweis: Die gesamte Zeit verbrachte sezieren und Montage sollte 15 Minuten nicht überschreiten. Dies ist wichtig, die Auswirkungen von Gewebeschäden und Zelltod.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Live Imaging: Hinweis: In diesem Schritt zuerst sammeln Bilder von Bicarbonat-Zustand und die zwei Nigericin um die richtige Mikroskop-Einstellungen bestimmen, die Mikroskop-Einstellungen nach Bedarf, und dann sammeln Bilder für den experimentellen Daten. Verwenden Sie ein confocal Mikroskop in der Lage Bildgebung in 3 Kanäle: GFP (475 Erregung/509 Emission), mCherry (575 Erregung/610 Emission) und dunkelrote (633 Erregung/647 Emission). 
	Hinweis: Set Mikroskop Einstellungen: die Pixelintensität Bilder gesammelt werden um die Schätzungen der pHi, zu bestimmen, so es wichtig ist, dass die Intensitätswerte des Signals in jedem Bild-Satz ist weder zu niedrig noch gesättigten quantifiziert werden. Das Spektrum der Intensitäten, die in einem Bild erfasst werden können wird durch die Bild-Bittiefe definiert. In vielen Fällen 8-Bit-Bilder werden standardmäßig generiert, aber wir empfehlen die Datenerfassung als 16-Bit-Bilder, die einen größeren Dynamikumfang haben. Es ist darauf zu achten, dass das Übersprechen zwischen den fluoreszierenden Kanälen wird minimiert, so dass die Einstellungen angepasst werden sollte, damit das Emissionsspektrum von gesammelt überlappt nicht jedes Fluorophor. Um diese Einstellungen zu testen, nehmen Sie ein Beispiel-Bild mit der Anregungsspektrums für GLP und sammeln in das Emissionsspektrum für mCherry und umgekehrt. Wenn die Einstellungen richtig eingestellt haben, sollte in jedem Fall kein Signal. Legen Sie die Mikroskop-Einstellungen (d.h., Spannungs-Einstellungen auf einem Laserscanning konfokale, Laser Power und Lochkamera Größe), so dass die Pixelintensität des Signals in allen drei Sätzen innerhalb des dynamischen Bereichs der Image-Datei. Für alle unsere Versuche haben wir einen weißen Licht Laser-scanning-confocal Mikroskop mit einem Objektiv 40 X 16-Bit-Bilder in 1.024 × 1.024 Format zu erwerben, während wir Spannungsverstärkung für jedes Experiment optimiert, je nach Bedarf verwendet. Zum Beispiel in einem Experiment setzen wir die Spannungsverstärkung für GLP, mCherry, und dunkelrote 37,8 %, sowie 72,9 % 260 %, beziehungsweise.
	<ol><li>Bild Ovariolen in Nigericin Dissektion Puffer bei pH 6,5 und Einstellungen anpassen, so dass Pixelintensität der pHluorin und mCherry Bilder sind gering, aber nicht unter der Nachweisgrenze der Kamera.</li>
		<li>Bild einen anderen Satz von Ovariolen in Nigericin Dissektion Puffer bei pH 7,5 und passen Sie die Einstellungen so, dass die Pixel-Intensitäten der pHluorin und mCherry Bilder hoch, aber nicht gesättigt sind.</li>
		<li>Bild Eierstöcke in Bikarbonat Dissektion Puffern und sicherzustellen, dass die Pixel-Intensitäten der pHluorin und mCherry Bilder nicht mit den gewählten Einstellungen gesättigt sind. Wenn die Pixel gesättigt sind, passen Sie die Einstellungen nach Bedarf. 
		Hinweis: Mikroskop Einstellparameter abweichen können basierend auf den genauen Mikroskop-Einstellungen verwendet werden und muss für jedes Experiment optimiert werden. Nachdem Mikroskop Einstellungen eingestellt haben, ändern Sie sie nicht für den Rest des Experiments. Einstellungen sollten über Kontrolle und experimentellen Bedingungen übereinstimmen. In unseren ersten pHi-Experimenten wir 2 und 3 Punkt Nigericin Kalibrierungskurven generiert und fanden keinen signifikanten Unterschied zwischen berechneten pHi mit beiden Methoden. Jedoch in der Regel die Zugabe von mehr Punkte in der Eichkurve dürften um Genauigkeit zu verbessern. Wir empfehlen daher, generieren von Kurven mit einer unterschiedlichen Anzahl von Punkten zu bestimmen, wie viele für einen bestimmten Satz von experimentellen Bedingungen erforderlich sind.</li>
	</ol></li> <li>Datenerhebung: <ol><li>Dissektion, Montage und der Proben in Bikarbonat und Nigericin Pufferbedingungen imaging durchzuführen. Nach Präparation und Befestigung, die maximale Zeit verbrachte imaging eine Reihe von Proben sollte nicht mehr als 45 min um sicherzustellen, dass die Fluoreszenz-Intensität-Messungen in live, gesundes Gewebe hergestellt werden.</li>
		<li>Für jede Bedingung abrufen von Bildern für mindestens 5 Germaria.</li>
	</ol></li></ol> 3. Nach dem Prozess: Bildanalyse <ol><li>Maßnahme Fluoreszenz-Intensität im FSCs, PFC, und Follikelzellen <ol><li>Hintergrund Subtraktion: <ol><li>Open unverarbeitete Bilder in Fidschi mit jeden Kanal in einem separaten Fenster ( Abbildung 4).</li>
			<li>Verwenden Sie das Rechteck-Werkzeug eine Region of Interest (ROI) zu zeichnen in der pHluorin-Kanal-Fenster in einem Teil des Bildes ohne Signal.</li>
			<li>Optional Schritt: die untere Grenze der Schwelle so einstellen, dass Pixel mit Intensitätswerte unter Hintergrund sind ausgeschlossen und die obere Grenze der Schwelle auf Maximum festgelegt. Wenn die Schwelle auf diese Weise festgelegt ist, die Bereiche des Bildes ohne Signal sind meist blau und das Signal ist deutlich sichtbar ( Abb. 4A).</li>
			<li>Messen die mittlere Fluoreszenzintensität im ROI. Wenn die Schwelle in Schritt 3 festgelegt wurde, stellen Sie sicher, überprüfen die &#34; Grenze, Schwelle &#34; Feld im Dialogfeld legen Sie Messungen.</li>
			<li>Subtrahieren die gemessenen Hintergrundintensität von jedem Kanal und Slice des Bildes mithilfe der Subtract-Funktion, gefunden in den Prozess &#8594; Math-Menü.</li>
			Wiederholen Sie Schritte 3.1.1.2-6 <li>für das mCherry-Kanal-Fenster außer, dass in Schritt 3.1.1.2, statt ein neues Rechteck mit dem Rechteck-Werkzeug zeichnen, verwenden Sie die Wiederherstellungsfunktion Auswahl, gefunden in den Edit &#8594; Auswahl-Menü, fügen Sie ein Rechteck mit der gleichen Abmessungen und Position auf dem Bild.</li>
		</ol></li> <li>Identifizieren FSCs, PFC und Follikelzellen: <ol><li>identifizieren das FSCs, PFC und Follikelzellen von Morphologie und Standort mit Concanavalin-A Färbung, um Zellgrenzen ( Abbildung 2) zu finden.</li>
			<li>Sind FSCs dünne dreieckigen Zellen befindet sich am Rande des Germarium an der Region 2a/2 b Grenze. Wenn mCherry::pHluorin in einer FSC-Klon zum Ausdruck kommt, FSC kann auch identifiziert werden, wie die vorderen die meisten Zelle des Klons.</li>
			<li>PFC sind unregelmäßig geformten Zellen in Region 2 b, unmittelbar neben und hinter der FSCs.</li>
			<li>Follikel sind quadratisch oder säulenartige Zellen, die die Keimzelle Zyste in Region 3 umgeben.</li>
		</ol></li> <li>Erlangung Fluoreszenz Intensität Verhältnisse <ol><li>Wählen Sie eine oder mehrere Scheiben, in denen die Zelle von Interesse höchsten Fluoreszenzintensität in der mCherry-Kanal hat, und stellen sicher, dass das Concanavalin-A Färbung, gesehen in der dunkelrote Kanal in Foc uns in die ausgewählte Slice.</li>
			<li>Zeichnen ROI um jede FSC und Maßnahme der mittlere Fluoreszenzintensität von pHluorin und mCherry in allen Scheiben für Messungen gewählt.</li>
			<li>Teilen der mittleren Fluoreszenzintensität des pHluorin Kanals durch die mittlere Fluoreszenzintensität des mCherry Kanals, ein Verhältnis von pHluorin zu mCherry Fluoreszenz zu berechnen.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Derive pHi Werte und pseudocolored Bilder generieren <ol><li>Derive pHi Werte <ol><li>In allen Fällen, die lineare Regression-Kurve sollte erzeugt werden Eierstöcke von den Fliegen des gleichen Genotyps für beide experimentelle und Bedingungen zu steuern. Generieren Sie eine lineare Regression-Kurve für jeden Zelltyp mit den Daten aus zwei Nigericin Pufferbedingungen ( Abbildung 3). In Excel kann dies durch die Daten in einem Diagramm Plotten und eine lineare Trendlinie hinzufügen. Alternativ finden Sie unter:</li> <li>Gebrauch die Steigung und y-Achsenabschnitt der linearen Regression Kurve berechnet sich aus den Nigericin Bedingungen und die Gleichung einer geraden (y = Mx + b) berechnet aus den Proben in das Bikarbonat, die pHluorin in mCherry Verhältniswerte zu konvertieren Bedingung, die pH-Werte. In dieser Gleichung b Hang Form (y-Achsenabschnitt) ersetzen, setzen die Ratio-Wert in x und lösen für y.</li>
		</ol></li> <li>Erzeugen ein pseudocolored Bild spiegelt die Ratio-Werte in Fidschi.
		<ol><li>Folgen die Einzelheiten über Hintergrundabzug (Schritt 3.1.1 und Bild 4).</li>
			<li>Teilen den pHluorin Kanal aus dem mCherry-Kanal mit der Bildrechner-Funktion im Menü "Vorgang" zu finden. Achten Sie darauf die &#34; erstellen neues Fenster &#34; und &#34; 32-Bit (Float) Ergebnis &#34; Checkboxen werden beide überprüft. Ändern der Lookup-Tabelle (LUT), finden Sie unter dem Menü "Bild" thermische oder LUT Wahl. Siehe Abbildung 4 für andere geeignetsten Optionen.</li>
			<li>Stellen Sie Helligkeit und Kontrast im Dialogfeld (Bild &#8594; Adjust &#8594; Helligkeit/Kontrast), klicken Sie auf die &#34; gesetzt &#34; Taste. Satz das Minimum Wert auf 0 und das Maximum angezeigt Wert zu einem Verhältnis, die Aufnahmen am besten die Daten in der Regel 1,0-2,0 ( Abbildung 5).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Grillo-Hill, B. K., Choi, C., Jimenez-Vidal, M., Barber, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+H%2B+efflux+is+sufficient+to+induce+dysplasia+and+necessary+for+viability+with+oncogene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Increased H+ efflux is sufficient to induce dysplasia and necessary for viability with oncogene expression.</a> eLife. 03270, (2015).</li>
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<li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+%28MARCM%29+for+Drosophila+neural+development%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+neuro%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development.</a> Trends in neuro. 24 (5), 251-254 (2001).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Hier beschreiben wir eine Methode zur Messung der pHi der Zellen in der FSC-Linie in Wildtyp-Gewebe. Dieses Protokoll wurde entwickelt und verfeinert in den vergangenen fünf Jahren seit Beginn der pHi in Drosophila Eierstockgewebe zu studieren. Während dieser Zeit wird das Protokoll durch mehrere Untersucher in unserem Labor und auf mindestens vier verschiedenen Spinning Disc und Laser-scanning-Mikroskope erfolgreich eingesetzt. Die Reproduzierbarkeit unserer ursprünglichen Beobachtung, dass pHi erhöht wie Zelle...

Neuere Studien gezeigt eine Rolle für Änderungen in pHi während zelluläre Differenzierung und Dysplasie in Vivo1,2. Diese Studien herausgefunden, dass pHi bemerkenswert konsistent in den Zellen des gleichen Typs auf der gleichen Stufe der Differenzierung, ist aber, dass es ändert als Übergang von einer Stufe zur anderen Zellen. In einigen Fällen stört die Änderungen in pHi teilweise Sperrung Differenzierung, was darauf hindeutet, dass die Veränderung der pHi nicht nur eine Folge von Veränderungen der Zelle Schicksal ist aber stattdessen hilft, die Veränderung der Zelle Schicksal, vielleicht durch Einfluß auf pH-Sensitive regulatorischen zu fördern Proteine oder chemische Reaktionen zur Differenzierung erforderlich. Zukünftige Studien haben das Potenzial, einen tieferen Einblick in die vielen verschiedenen Rollen der pHi Dynamik in Vivozu offenbaren. Jedoch ist eine der Herausforderungen des Studiums pHi während der Differenzierung in Vivo genaue Messungen der pHi erhalten. Im Gegensatz zu anderen Funktionen der Differenzierung, wie Veränderungen in der zellulären Morphologie und Genexpression ist pHi eine labile chemische Eigenschaft der Zelle, die nicht in den Zellen, die wurden behoben, und permeabilized mit Standardmethoden bewahrt wird. Darüber hinaus möglicherweise pHi nicht stabil in Zellen, die gestresst sind oder sterben durch experimentelle Manipulation. Daher ist es wichtig, die Zellen lebendig und so gesund wie möglich zu halten, bei der Messung von pHi. Mehrere wichtige Farbstoffe zur Verfügung, die funktionieren gut für Messung der pHi der Zellen in Kultur3, aber in vielen Fällen sie eignen sich nicht für in Vivo Studien, weil sie das Gewebe nicht tief oder gleichmäßig eindringen, genaue Messungen zu machen .
Um das Problem der schlechten Farbstoff Penetration zu umgehen, haben wir u.a. eine genetisch codierte Sonde, mCherry::pHluorin4,5,6,7, verwendet, die speziell in der Zelle ausgedrückt werden kann Arten von Interesse und abgebildeten in lebender Gewebe. pHluorin ist eine Variante der GFP mit einer höheren pKa (~ 7,0 vs. ~ 4.0), die Falten leichter bei höheren pH-Werten; so steigt der gesamten Fluoreszenzintensität emittiert bei einer Bevölkerung von pHluorin Moleküle in der Zelle mit zunehmender pHi8. Fluoreszenz ist linear innerhalb der normalen cytosolischen Wertebereich pHi. Im Gegensatz dazu die Fluoreszenz des mCherry (pKa ~ 4.5) ist unempfindlich gegen pH-Veränderungen innerhalb der cytosolischen. Diese zwei Reporter sind kovalent miteinander als ein chimäres Protein, durch einen einzigen offenen Leserahmen codiert, so dass sie immer in gleichen Mengen vorhanden sind. Daher stellt das Verhältnis von pHluorin zu mCherry Fluoreszenzintensität eine Messung des pHi, die auf die Sonde Konzentration in jeder Zelle normalisiert ist. Die Verhältnisse können dann Schätzungen von pHi-Werten mit einer Standardkurve, die generiert wird, durch den Erwerb der pHluorin mCherry-Verhältnisse von Geweben, die auf bekannten pH-Werte equilibriert wurde umgewandelt werden.
Hier beschreiben wir die Methoden für die Verwendung von mCherry::pHluorin, um die pHi der epithelialen FSC-Linie im Drosophila Eierstock zu messen. Dieses gut charakterisierten Gewebe wurde verwendet, um viele verschiedene Aspekte der epithelialen Biologie, wie z. B. Stammzell-Selbsterneuerung und Differenzierung9,10,11, kollektive Zellmigration12 Modell , Entwicklung und Wartung von Zelle Polarität13,14. Die Follikel Epithel wird durch zwei FSCs produziert, die am vorderen Rand des Gewebes in einer Struktur namens Germarium15,16befinden. Diese Zellen teilen sich regelmäßig im Erwachsenenalter selbst zu erneuern und produzieren nachkommen, genannt prefollicle Zellen (PFC), die entweder geben Sie die Nische und ein FSC werden oder in eine der drei verschiedenen Follikel Zelltypen differenzieren: polare Zellen, Stiel Zellen oder Hauptkörper Follikelzellen. Wir zeigten, dass zuvor in Wildtyp-Gewebe, die pHi steigt stetig in den frühen Phasen der Differenzierung von pHi von ca. 6,8 in FSCs 7.0 im PFC, auf 7,3 im Follikel Zellen2. Blockieren diese Erhöhung durch RNAi Knockdown von ein ubiquitär ausgedrückt Natrium/Proton-Wärmetauscher, DNhe2, stark beeinträchtigt pFC Differenzierung, während pHi steigt durch Überexpression des DNhe2 bewirkt eine milde überschüssige Differenzierung Phänotyp. Diese Ergebnisse belegen, dass pHi bleibt stabil in der frühen FSC-Linie, dass es experimentell kann erhöht oder verringert in Vivo. Die hier beschriebenen Methoden können verwendet werden, um pHi in Wildtyp-Gewebe oder verschiedene Formen der mutierte Gewebe, einschließlich der RNAi-Zuschlag oder Überexpression mit einer Gal4 von Interesse und mitotischen Klone zu messen.

<table><tbody><tr><td>Fly Stocks</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UAS-mCherry::p Hluorin[1]</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>y1 w*; P{GawB}10930/CyO</td><td>Bloomington Stock Center</td><td>7023</td><td></td></tr><tr><td>Act-Gal4 Flipout Stock</td><td>Center Bloomington Stock Center</td><td>4409</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td><>Katalognummer<</td><td>strong>Comments</td></tr><tr><td>Chemikalien für die Puffervorbereitung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P-3911</td><td></td></tr><tr><td>Glukose</td><td>Mallinckrodt</td><td>4912</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP310</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>M63</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C-5080</td><td></td></tr><tr><td>HCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S-5761</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M-9272</td><td></td></tr><tr><td>NMDG+</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M-2004</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Mallinckrodt</td><td>7088</td><td>Zur Herstellung von KHPO4 pH 7,4</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP362</td><td>Zur Herstellung von KHPO4 pH 7,4</td></tr><tr><td>Concanavalin A, Alexa Fluor 647 Konjugat</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C21421</td><td>0,25 mg/ml Verdünnung</td></tr><tr><td>Nigericin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N1495</td><td></td></tr><tr><td>Name<</td><td>strong>Company</td><td>Katalognummer</td><td>><Kommentare</td></tr><tr><td>Dissektions- und Montagewerkzeuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 Dumont Inox-Pinzette (Größe 5)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NC9473431</td><td></td></tr><tr><td>23-Gauge-Spritzennadeln</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z192457</td><td></td></tr><tr><td>9-Well-Glas-Präparierschale</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-748B</td><td></td></tr><tr><td>Vakuumfett</td><td>Dow Corning</td><td>1018817</td><td></td></tr><tr><td>22 x 40 mM Glasdeckgläser</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12545C</td><td></td></tr><tr><td>Runde Glas-Deckgläser, 12 mm Durchmesser, 0,13-0,16 mm Dicke</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>26023</td><td></td></tr><tr><td>3D-Montagekammer</td><td>kundenspezifisch gefertigte</td><td></td> <td>.stl- und .ipt-Dateien für 3D-Drucker als ergänzende Dateien enthalten</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company<</td><td>strong>Katalognummer</td><td>Kommentare</td></tr><tr><td>Sonstige Ausrüstung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH-Messgerät</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-620-183A</td><td>Modell: Accumet AB15</td></tr><tr><td>Dissektionsmikroskop</td><td>Olympus Corporation</td><td>0H11436</td><td>Modell: SZ2-ST</td></tr><tr><td>Konfokales Mikroskop</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td>SP5 oder SP8 Konfokales Laser-Scanning-Mikroskop mit einem 40-fachen Objektiv und einer numerischen Apertur von 1,3</td></tr></tbody></table>

methoden für imaging intrazellulären ph der follikel stem cell linie in live drosophila eierstockgewebe

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Änderungen im intrazellulären pH (pHi) spielen eine wichtige Rolle bei der Regulierung der viele zelluläre Funktionen, einschließlich Stoffwechsel, Proliferation und Differenzierung. In der Regel sind pHi Dynamik in kultivierten Zellen bestimmt, die Mess- und experimentell manipuliert pHi zugänglich sind. Allerdings machte es die jüngste Entwicklung von neuen Instrumenten und Methoden möglich, pHi Dynamiken intakt, live Gewebe zu studieren. Für die Drosophila -Forschung, eine wichtige Entwicklung war die Erzeugung einer transgenen Linie tragen eines Biosensors pHi mCherry::pHluorin. Hier beschreiben wir eine Protokoll, mit denen wir routinemäßig für bildgebende live Drosophila Ovariolen pHi in der epithelialen Follikel Stammzellen (FSC) Linie in mCherry::pHluorin transgenen Wildtyp-Linien zu messen; die hier beschriebenen Methoden kann jedoch für andere Gewebe, einschließlich der Flügel Scheiben und Auge Epithel leicht angepasst. Wir beschreiben Techniken für den Ausdruck von mCherry::pHluorin in der FSC-Linie die Aufrechterhaltung Eierstockgewebe während live imaging und Erwerb und Analyse von Bildern um pHi Werte zu erhalten.

Hier haben wir den Prozess der Messung pHi in die Follikel Epithel, beinhaltet mehrere Schritte beschrieben. Erstens werden die Eierstöcke von fliegen von der entsprechenden Genotyp mit Tools zum sezieren und Montage (Abbildung 1) indiziert. Die Ovariolen sind dann abgebildet mit quantitativen Fluoreszenzmikroskopie und die Bilder werden analysiert, um Messungen der pHi zu erhalten. Für jedes Bild werden die Zelltypen von Interesse identifiziert, wie beschrie...

Wir bieten ein Protokoll für imaging intrazelluläre pH-Wert von einer epithelialen Stammzellen Abstammung in live Drosophila Ovargewebe. Wir beschreiben Methoden, um transgene fliegen mit dem Ausdruck einer pH-Wert-Biosensor, mCherry::pHluorin, Bild der Biosensor mit quantitativen Fluoreszenz-Bildgebung zu generieren, generieren Standardkurven und pH-Werte Fluoreszenz Intensitätswerte umwandeln.

Methoden für Imaging intrazellulären pH der Follikel Stem Cell Linie in Live Drosophila Eierstockgewebe

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, den intrazellulären pH-Wert von Follikelzellen in lebendem explantiertem Drosophila-Ovarialgewebe zu messen. Diese Methode kann uns helfen, Schlüsselfragen in der Stammzell- und Entwicklungsbiologie zu beantworten, z. B. wie Veränderungen des intrazellulären pH-Werts zu Sulfatentscheidungen beitragen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie es ermöglicht, den pH-Wert in lebendem intaktem Gewebe genau zu quantifizieren.Um das Experiment zu beginnen, bereiten Sie die Montagekammern vor, indem Sie eine dünne Schicht Vakuumfett auf die flachere Seite einer 3D-gedruckten Montagekammer auftragen. Legen Sie die flachere Seite auf einen 22 x 40 Millimeter großen Deckglas, um den Deckglas zur Montagekammer hin abzudichten. Als nächstes präparieren Sie die Eierstöcke weiblicher erwachsener Fliegen in 500 Mikrolitern Dissektionspuffer.Betäuben Sie drei bis vier Fliegen mit CO2-Gas und übertragen Sie die Fliegen auf ein Fliegenpad. Wählen Sie mit einer Pinzette eine Fliege aus und platzieren Sie sie in das Präpariermedium. Kneifen Sie mit einer Pinzette in den Brustkorb der Fliege, während Sie an der Spitze ihres Bauches ziehen, bis ihre Eierstöcke freiliegen.Stellen Sie einen Timer auf genau 10 Minuten. Nachdem Sie die Eierstöcke von den anderen Organen gelöst haben, ziehen Sie die Eierstöcke mit 22 1/2 Spritzennadeln auseinander. Halten Sie die Gruppe von Eierstöcken mit einer Spritzennadel an ihrem vorderen Ende fest und streichen Sie entlang der Länge einzelner Eierstöcke nach unten, um die Muskelhülle vorsichtig von den Eierstöcken zu trennen.Inkubieren Sie die präparierten Eierstöcke für den Rest der Zeit auf dem Timer in Präpariermedien. Es ist wichtig, dass die Eierstöcke genau 10 Minuten im Präpariermedium verbleiben, um den Zellen genügend Zeit zu geben. Geben Sie einen kleinen Tropfen Seziermedium auf den Glasabdeckschirm in der Montagekammer.Übertragen Sie die getrennten Eierstöcke mit einer Pinzette. Trennen Sie die Eikammern im späteren Stadium von den Germarien, die mit den Eikammern in früheren Stadien verbunden sind, und stellen Sie sicher, dass die präparierten Germarien in der Mitte des Dissektionsmedientropfens platziert werden. Geben Sie zwei kleine Tropfen Nagellack auf die gegenüberliegenden Seiten des etwa 12 Millimeter großen Deckglases und lassen Sie ihn etwa 10 Sekunden lang an der Luft trocknen.Legen Sie den runden Deckslip auf den Tropfen des Seziermediums, das die abgetrennten Germarien enthält, so dass die Seite mit dem Nagellack nach unten zeigt und das Seziermedium berührt. Drücken Sie die Ränder nach unten, um die Germaria flach zu drücken und in Position zu halten. Füllen Sie die Montagekammer mit zusätzlichem Präpariermedium und fahren Sie mit der Live-Bildgebung fort.Bild der Ovariolen in einem Dissektionspuffer bei pH 6,5. Passen Sie die Einstellungen so an, dass die Pixelintensitäten der Phluorin- und mCherry-Bilder niedrig sind, aber nicht unter den Erkennungsgrenzen der Kamera. Als nächstes bilden Sie einen weiteren Satz Ovariolen in Nygerion-Dissektionspuffer bei pH 7,5 ab und passen Sie die Einstellungen so an, dass die Pixelintensitäten der Phluorin- und mCherry-Bilder hoch, aber nicht gesättigt sind.Bild-Ovarien und Bikarbonat-Dissektionspuffer und stellen sicher, dass die Pixelintensitäten der Phluorin- und mCherry-Bilder mit den gewählten Einstellungen nicht übersättigt werden. Wenn die Pixel gesättigt sind, passen Sie die Einstellungen an. Nachdem Sie die entsprechenden Live-Imaging-Einstellungen ausgewählt haben, fahren Sie mit der Aufnahme von Bildern von mindestens fünf Germarien unter jeder der Bedingungen fort.Subtrahieren Sie den Hintergrund, indem Sie unbearbeitete Bilder in Fidschi öffnen, wobei jeder Kanal in einem separaten Fenster angezeigt wird. Verwenden Sie das Rechteck-Werkzeug, um einen interessanten Bereich oder ROI im pHluorin-Kanalfenster und einen Teil des Bildes ohne Signal zu zeichnen. Legen Sie die Untergrenze des Schwellenwerts so fest, dass Pixel mit Intensitätswerten unterhalb des Hintergrunds ausgeschlossen werden, und legen Sie die Obergrenze des Schwellenwerts auf Maximum fest.Wenn der Schwellenwert auf diese Weise eingestellt wird, sind die Bereiche des Bildes ohne Signal meist blau und das Signal ist deutlich sichtbar. Wenn der Schwellenwert festgelegt wurde, navigieren Sie zum Dialogfeld "Messwerte festlegen" und stellen Sie sicher, dass das Kontrollkästchen "Auf Schwellenwert begrenzen" aktiviert ist. Messen Sie die mittlere Fluoreszenzintensität in der ROI, gehen Sie zum Prozess und dann zum mathematischen Menü, um die gemessene Hintergrundintensität von jedem Kanal und jeder Schicht des Bildes mit der Subtraktionsfunktion zu subtrahieren.Wiederholen Sie die Schritte für das mCherry-Kanalfenster, verwenden Sie jedoch die Funktion zum Wiederherstellen der Auswahl, anstatt ein neues Rechteck mit dem Rechteckwerkzeug im Auswahlmenü zu zeichnen, um ein Rechteck mit den gleichen Abmessungen und der gleichen Position auf dem Bild hinzuzufügen. Wählen Sie eine oder mehrere Schichten, in denen die interessierende Zelle die höchste Fluoreszenzintensität im mCherry-Kanal aufweist, und stellen Sie sicher, dass die Concanavalin A-Färbung im fernroten Kanal innerhalb der ausgewählten Scheibe scharf ist. Zeichnen Sie als Nächstes einen ROI um jede Follikelstammzelle oder FSC und messen Sie die mittlere Fluoreszenzintensität von pHluorin und mCherry sowie alle für die Messungen ausgewählten Scheiben.Teilen Sie schließlich die mittlere Fluoreszenzintensität des pHluorin-Kanals durch die mittlere Fluoreszenzintensität des mCherry-Kanals, um ein Verhältnis von pHluorin zu mCherry-Fluoreszenz zu berechnen. Zwei Germarien wurden mittels quantitativer Fluoreszenzmikroskopie mit UAS mCherry pHluorin und 10930 gal 4 abgebildet, gefärbt mit Concanavalin A und ROI-Umriss einer Follikelstammzelle oder FSC oder PFC, und in jedem Bild ist eine Follikelzelle zu sehen. Das Verhältnis der Fluoreszenzintensitäten in den GFP- und mCherry-Kanälen wird mit Hilfe einer Standardkurve in pH I-Werte umgerechnet.Der pH-Wert I steigt mit der Differenzierung in der frühen FSC-Linie an, von 6,8 bei FSCs über 7,0 in Präfollikelzellen bis hin zu 7,3 in Follikelzellen. Die pH-I-Werte jedes Zelltyps können als pseudofarbige Mikroaufnahme dargestellt werden, die die Unterschiede im Verhältnis von pHluorin zu mCherry zeigt, und zeigen diese Farbunterschiede an, wie sie durch eine LUT definiert sind. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, alle Reagenzien vorher zur Hand zu haben, da viele Schritte in diesem Protokoll zeitkritisch sind.Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Entwicklungsbiologie, um die Rolle des pH-Werts bei Sulfatentscheidungen zu erforschen intrazelluläre Malano-Gaster.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Drosophila Blutzellen über die Gesamtheit des sich entwickelnden Embryos zu zerstreuen. Dieses Protokoll zeigt, wie die Montage und Bild dieser Migrationen Verwendung von Embryonen mit fluoreszenzmarkierten Blutzellen.

Live-Bildgebung Drosophila melanogaster Embryonale Hemocyte Migrationen

Ein Protokoll für die Live-Darstellung von GFP-markierten Proteine ​​oder autofluoreszierenden Strukturen in den...

Live-Imaging von GFP-markierten Proteine ​​in<em&gt; Drosophila</em&gt; Oozyten

Stufe spezifischen Isolierung von mittleren bis späten Drosophila Follikel ist nützlich für eine Vielzahl von Zwecken. Wie Follikel in Kultur, die für die genetische und / oder pharmakologischen Manipulationen in vitro-Assays und Entwicklung die Bildgebung gekoppelt werden können. Zusätzlich kann Follikel für molekularbiologische Untersuchungen, wie Isolierung von mRNA und Protein verwendet werden.

Das Utility von Stage-spezifischen Mid-zu-spät<em&gt; Drosophila</em&gt; Follikel Isolation

Dieses Papier zeigt die Verwendung eines schnellen konfokalen Mikroskop, um Bildzelle Verhalten direkt durch die Puppenhülle. Nach dem Verlassen der Puppenhülle intakt ist, erlaubt dieses Verfahren die Beobachtung und Messung von dynamischen Zellprozesse im Stadium der Drosophila-Entwicklung, die schwer direkt zu studieren.

Imaging Durch die Puppenhülle von<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Dieses Protokoll Details eine optimierte Methode verwendet, um Live-Cell-Imaging im Rahmen eines intakten Larven Gehirn durchzuführen. Live-Cell-Imaging Ansätze sind von unschätzbarem Wert für die Erforschung der neuronalen Stamm asymmetrische Zellteilungen sowie andere neurogene und Entwicklungsprozesse konsequent aufzudecken Mechanismen, die bisher übersehen wurden.

Live-Imaging von<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven Neuroblasten

Die in diesem Protokoll beschriebene aufrechte Bildgebungsmethode ermöglicht die detaillierte Visualisierung der Pole eines sich entwickelnden Drosophila melanogaster-Eies.  Diese End-on-Ansicht bietet eine neue Perspektive auf die Anordnungen und Morphologien mehrerer Zelltypen im follikulären Epithel.

Upright-Imaging von<em&gt; Drosophila</em&gt; Egg Chambers

Eine Analyse der mitochondrialen Struktur-Funktions-Beziehung ist für ein gründliches Verständnis der regulatorischen Mechanismen der mitochondrialen Funktionalität erforderlich. Spezifische Methoden zur Untersuchung der mitochondrialen Struktur und Funktion in lebenden und fixierten Drosophila-Eierstöcken werden in dieser Arbeit beschrieben und demonstriert.

Studieren Mitochondrial Struktur und Funktion in Drosophila Ovarien

Bei Drosophiladurchläuft der Eizellkern während der Oogenese eine mikrotubuliabhängige Migration. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das entwickelt wurde, um die Migration durch Live-Bildgebung an Eierkammern ex-vivozu verfolgen. Unser Verfahren hält Eierkammern für 12 Stunden am Leben, um multipositionale 3D-Zeitrafferfilme mit konfokaler Spinning-Disk-Mikroskopie zu erfassen.

Kernmigration in der Drosophila-Eizelle

Die Basalmembran ist essentiell für die Gewebe- und Organmorphogenese während der Entwicklung. Um die Mechanismen, die zur richtigen Platzierung dieser Struktur führen, besser zu verstehen, beschreibt das vorgestellte Protokoll Methoden zur Visualisierung und Charakterisierung des intrazellulären Transports und der Sekretion von Basalmembranproteinen in Epithelzellen mittels konfokaler und hochauflösender Mikroskopie.

Konfokale und hochauflösende Bildgebung des polarisierten intrazellulären Transports und der Sekretion von Basalmembranproteinen während der Drosophila-Oogenese

Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Verfügung, um Live-Bildgebung der asymmetrischen Teilung von Keimbahnstammzellen (GSCs) in der ovariellen Nische von Drosophila durchzuführen. Wir verwenden eine transgene Linie, die ubiquitär eine grün fluoreszierende Protein (GFP)-Fusion des Spektrosomproteins Par-1 exprimiert.

Erweiterte Live-Bildgebung von weiblichen Drosophila melanogaster Keimbahn-Stammzellnischen

Erfahren Sie die Messung intrazellulären pH in Follikelzellen lebender Drosophila-Eierstöcke mittels quantitativer Fluoreszenzbildgebung. Diese Methode ermöglicht präzise pH-Bestimmungen in intaktem Gewebe und liefert Einblicke in Stammzellverhalten.

Methoden für Imaging intrazellulären pH der Follikel Stem Cell Linie in Live Drosophila Eierstockgewebe

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