Erkennung von Mitochondrien-Membran-Potential, CLIC4 Knockdown-induzierte HN4 Zelle Apoptosis In-vitro- Studie

Diese Methode kann helfen, die Schlüsselfragen im zytobiologischen Bereich zu beantworten, einschließlich des Verständnisses der Apoptose und der Dysfunktion der Mitochondrien. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Forscher die Echtzeitüberwachung des Mitochondrienmembranpotentials über Rhodamin-123 innerhalb einer einzigen Zelle einfach und ordnungsgemäß durchführen können. Kultivieren Sie eine HN4-Zelllinie aus Plattenepithelkarzinomen der Kopf- und Halszelle, wie im Textprotokoll beschrieben.

Einen Tag vor der Transfektion werden 0,5 Millionen Zellen in zwei Millilitern pro Mulde Kulturmedium ohne Antibiotika in Sechs-Well-Platten plattiert. Verdünnen Sie vorsichtig 100 Pikosolen CLIC4 small interfering RNA oder scrambled small interfering RNA in 250 Mikrolitern reduziertem Serummedium. Verdünnen Sie dann fünf Mikroliter des Liposomenreagenzes in 250 Mikrolitern reduziertem Serummedium und inkubieren Sie es fünf Minuten lang.

Kombinieren Sie die verdünnte kleine interferierende RNA mit dem verdünnten Liposomenreagenz und mischen Sie vorsichtig. Geben Sie die Mischung in jede Vertiefung, die Zellen in Medium enthält. Vorsichtig mischen, indem Sie den Teller hin und her wiegen.

Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius in einem CO2-Inkubator. Ersetzen Sie das Medium vier Stunden nach der Transfektion durch normales Wachstumsmedium. Inkubieren Sie die Zellen weitere 20 Stunden, bevor Sie mit dem Rhodamin-123-Markierungsverfahren fortfahren.

Nach der CLIC4-Behandlung von HN4-Zellen mit kleinen interferierenden RNAs in Sechs-Well-Platten verwenden Sie eine Pinzette, um kreisförmige Deckgläser auf die Unterseite der neuen 12-Well-Platten zu setzen. Pipettieren Sie 150 Mikroliter 100 Mikrogramm Polylysin pro Milliliter auf die Mitte jedes Deckglases innerhalb der 12-Well-Platten. Entfernen Sie nach zwei Minuten das Polylysin gründlich mit einer Pipette.

Entfernen Sie als Nächstes das Nährmedium der HN4-Zellen in der Schale und fügen Sie einen Milliliter 0,25 % Trypsin hinzu, um die Zellen zu lösen. Fügen Sie nach sechs Minuten zwei Milliliter Nährmedium hinzu, um das Trypsin zu neutralisieren. Mischen Sie die HN4-Zellen vorsichtig fünfmal mit der Pipette und säen Sie die Zellen auf kreisförmigen Deckgläsern aus.

Legen Sie die Zellen in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5% CO2. Nach achtstündiger Inkubation fügen Sie zwei Mikromol pro Liter Rhodamin-123 hinzu und mischen Sie das Medium mehrmals vorsichtig auf und ab, um eine gleichmäßige Verteilung im Medium zu gewährleisten. Inkubieren Sie die HN4-Zellen 40 Minuten lang bei 37 Grad Celsius.

Entfernen Sie die Deckgläser mit einer Pinzette und geben Sie sie kurz in den vorgewärmten NPSS-Puffer, um die restliche Flüssigkeit abzuwaschen. Legen Sie die Deckgläser auf den Boden der 500-Mikroliter-Edelstahlkammer mit einem austauschbaren 25-Millimeter-Glasdeckglasboden, der durch einen O-Ring verschlossen ist. Befestigen Sie die Deckgläser, indem Sie den Deckel auf der Kammer festziehen.

Geben Sie 450 Mikroliter vorgewärmten NPSS-Puffer in die zusammengebaute Kammer. Stellen Sie dann das Bad unter das Gesichtsfeld des Fluoreszenzmikroskops oder des konfokalen Laser-Scanning-Fluoreszenzmikroskops. Schalten Sie das Fluoreszenzmikroskop gemäß den Anweisungen des Herstellers ein.

Öffnen Sie die Software des Bildverarbeitungssystems, und wählen Sie in der Befehlsleiste die Schaltfläche Neu aus, um ein neues Experiment zu starten. Passen Sie das Gesichtsfeld und den Fokus an, um die Position der Zellen im weißen Licht zu finden. Schalten Sie dann das Licht aus und drücken Sie den Knopf, um das weiße Licht zu schließen.

Klicken Sie in der Befehlsleiste auf die Schaltfläche Fokus, und wählen Sie Fokussierung starten aus, um die Fluoreszenz einzuschalten. Finden Sie die Position der Zellen über das Mikroskop mit einer 507 Nanometer Anregung und 529 Nanometer Langpass-Emissionswellenlänge wieder. Passen Sie das Gesichtsfeld an und fokussieren Sie bei Bedarf erneut.

Wählen Sie ein visuelles Feld aus, das nur 20 bis 30 getrennte HN4-Zellen enthält. Sobald ein klares Gesichtsfeld erreicht ist, klicken Sie in der Fokusleiste auf "Nahfokussierung". Klicken Sie dann in der Befehlsleiste auf "Erfassen", um einen Satz von Bildern zu erfassen.

Klicken Sie anschließend in der Befehlsleiste auf Bereiche und dann auf die Schaltfläche OK, um die Messbereiche zu bearbeiten. Um die verschiedenen Formen einzelner Zellen anzupassen, wählen Sie das Werkzeug für den Verfolgungsbereich aus. Kreisen Sie den Bereich einer einzelnen Zelle ein, und doppelklicken Sie, wenn Sie fertig sind.

Wiederholen Sie den Vorgang, bis alle Zellen eingekreist sind. Klicken Sie auf Fertig und wählen Sie Bilder speichern, um den gespeicherten Speicherort zu finden. Klicken Sie auf Null Uhr und drücken Sie schnell F4, um die Änderung der Fluoreszenzintensität zu überwachen.

Zeichnen Sie die Änderung der Fluoreszenzintensität in Echtzeit einmal alle fünf Sekunden für fünf Minuten auf. Wenn die Basislinie stabil wird, geben Sie 50 Mikroliter NPSS gemischt mit 0,5 Mikrolitern 100 Millimol pro Liter ATP über eine Pipette in die Kammer. Schalten Sie das konfokale Laser-Scanning-Fluoreszenzmikroskop gemäß den Anweisungen des Herstellers ein und öffnen Sie die mitgelieferte Software.

Klicken Sie im Erfassungsmenü auf Objektiv, um das Ölobjektiv mit 63-facher numerischer Apertur und 1,4 auszuwählen. Beobachten Sie die Probe und finden Sie ein klares Gesichtsfeld unter dem Lichtfeld. Drücken Sie die Lichtauswahltaste, um in den Fluoreszenzmodus zu wechseln, und wählen Sie die richtigen Fluoreszenzfilter aus, um die Position der Zelle bei Dunkelheit über das Mikroskop zu finden.

Drücken Sie den Verschluss, um die Probe zu schützen, wenn die Beobachtung beendet ist. Stellen Sie im Acquire-Menü den geeigneten PMT-Kanal ein und klicken Sie auf Erreichen, um den eingestellten Strahlengang zu aktivieren. Klicken Sie auf das Konfigurationsmenü und wählen Sie Laser, um den gewünschten Lasertyp zu bestimmen.

Klicken Sie auf Live, um Echtzeitbilder zu erhalten und sicherzustellen, dass das Gesichtsfeld nur 20 bis 30 getrennte HN4-Zellen enthält. Wählen Sie anschließend im Erfassungsmodus im Erfassungsuntermenü unter dem Erfassungsmenü die Option XYT aus. Legen Sie fünf Sekunden für das Zeitintervall und 20 Minuten für die Dauer fest.

Klicken Sie auf Anwenden, wenn alle Parameter abgerechnet sind. Verwenden Sie im Menü "Quantifizieren" das Werkzeug Polylinie zeichnen, um den Aufzeichnungsbereich jeder Zelle einzukreisen. Wählen Sie Linienprofil aus, und wählen Sie Start aus, um die Beobachtung durchzuführen.

Zeichnen Sie die Änderung der Fluoreszenzintensität fünf Minuten lang in Echtzeit auf. Wenn die Basislinie stabil wird, geben Sie 50 Mikroliter NPSS gemischt mit 0,5 Mikrolitern 100 Millimol pro Liter ATP über eine Pipette in die Kammer. Um statistische Analysen mit einem gängigen Fluoreszenzmikroskop durchzuführen, öffnen Sie die Software des Bildgebungssystems und wählen Sie in der Befehlsleiste die Schaltfläche "Öffnen" aus, um ein gespeichertes Experiment zu öffnen.

Klicken Sie in der Befehlsleiste auf Bereiche und dann auf die Schaltfläche OK, um die Messbereiche zu bearbeiten. Wählen Sie das Werkzeug Verfolgungsbereich aus. Kreisen Sie den Bereich einer einzelnen Zelle ein und doppelklicken Sie, wenn Sie fertig sind.

Wiederholen Sie den Vorgang, bis alle Zellen eingekreist sind. Klicken Sie auf Fertig, und wählen Sie die Vorwärtstaste F4 aus, um eine Spur mit Fluoreszenzintensität zu erhalten. Wenn Sie fertig sind, klicken Sie auf die Schaltfläche mit dem Abwärtspfeil in der unteren rechten Ecke des Diagramms und klicken Sie auf Diagrammdaten anzeigen.

Klicken Sie zweimal auf OK und wählen Sie die Schaltfläche Protokolldaten, um die Schnittstelle der Datenverarbeitungssoftware zu öffnen. Klicken Sie dann erneut auf Daten protokollieren, um die Aufzeichnungen der Echtzeitschwankungen der Fluoreszenzintensität zu finden, die in der Tabelle angezeigt werden. Hier sind repräsentative Ergebnisse zu sehen, die ATP-induzierte Veränderungen der mitochondrialen Depolarisation in der HN4-Zelle unter verschiedenen Eingriffen zeigen, wie sie durch gängige Fluoreszenzmikroskopie aufgelöst wurden.

Die Depolarisation der mitochondrialen Membran nahm nach der ATP-Behandlung schnell zu und erholte sich in beiden Gruppen allmählich auf das normale Niveau. Repräsentative Spuren der Rhodamin-123-Fluoreszenzintensität zeigen, dass die MMP-Behandlung mit CLIC4-small interfering RNA die mitochondriale Depolarisation im Vergleich zur Kontrollgruppe verstärkte. Ein repräsentatives Histogramm zeigte ferner, dass der Knockdown von CLIC4 die mitochondriale Depolarisation im Vergleich zur Kontrollgruppe verstärkte.

Auch hier zeigen repräsentative Ergebnisse der konfokalen Laserscanning-Mikroskopie ATP-induzierte Veränderungen der mitochondrialen Depolarisation in der HN4-Zelle unter verschiedenen Eingriffen. Die Depolarisation der mitochondrialen Membran nimmt nach der ATP-Behandlung schnell zu und erholt sich in beiden Gruppen allmählich auf ein normales Niveau. Repräsentative Spuren der Fluoreszenzintensität von Rhodamin-123 zeigen, dass die MMP-Behandlung mit CLIC4 small interfering RNA die mitochondriale Depolarisation im Vergleich zur Kontrollgruppe verstärkte.

In ähnlicher Weise zeigte das repräsentative Histogramm weiterhin, dass der Knockdown von CLIC4 die mitochondriale Depolarisation im Vergleich zur Kontrollgruppe verstärkte. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, werden Sie ein besseres Verständnis dafür haben, wie Sie Rhodamin-123 verwenden können, um eine Echtzeitüberwachung des mitochondrialen Membranpotentials sowohl durch normale Fluoreszenzmikroskopie als auch durch konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie durchzuführen. Einmal gemeistert, kann diese Technik der Mikroskopie mit Rhodamin-123 in weniger als 20 Minuten für eine Probe durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird.

Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, dass Sie während der Injektion bis zum Scanvorgang keinen Kontakt mit der Kammer haben. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie Western Blot und Durchflusszytometrie durchgeführt werden, um weitere Fragen zu beantworten, z.B. ob Apoptose oder Nekrose aufgetreten ist. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für die Forscher auf dem Gebiet der Live-Wissenschaft, um die mitochondriale Dysfunktion zu erforschen und solide Beweise für die Zellapoptose in verschiedenen lebenden Zellen zu finden.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Rhodamin-123 äußerst gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen und Gesichtsmasken getroffen werden sollten.