Immunostaining für DNA-Modifikationen: computergestützte Analyse der konfokalen Bilder
September 7th, 2017
Neu entdeckte oxidierte Formen von 5-Methylcytosine (Oxi-mCs), 5-Hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-Formylcytosine (5-Fu) und 5-Carboxylcytosine (5caC) kann verschiedene DNA-Modifikationen mit einzigartigen funktionellen Rollen vertreten. Hier ist ein semi-quantitative Workflow zur Visualisierung der räumlichen Verteilung Oxi-mCs, Signal Intensität Profilierung und NS1 beschrieben.
Das übergeordnete Ziel dieser Technik ist es, ein computergestütztes Werkzeug zur Bewertung der räumlichen Verteilung und Signalintensität von DNA-Modifikationen bereitzustellen, die durch Immunfärbung innerhalb von Zellkernen sichtbar gemacht werden. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Epigenetik zu beantworten, indem sie die Untersuchung der Kernlokalisation und des relativen Ausmaßes von DNA-Modifikationen in verschiedenen Modellsystemen ermöglicht. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die DNA-Modifikationen durch die Größe des Bot-Signals und dann durch die Verteilung gemessen werden.
Eine der Implikationen dieser Technik besteht darin, dass sie unser Verständnis potenzieller funktioneller Reihen von DNA-Modifikationen in verschiedenen biologischen Systemen erleichtert. Diese Technik bietet auch die zusätzliche Anwendung der computergestützten Analyse anderer Epitope, die durch Immunhistochemie nachweisbar sind. Öffnen Sie zunächst die LSM-formatierten Dateien des konfokalen Mikroskopiebildes.
Wählen Sie Bildverarbeitung und dann das gewünschte Bild für die Analyse aus. Beachten Sie, dass beim Vergleich von Intensitätsprofilen zwischen Proben die Laserleistung und die Verstärkung konsistent sein müssen, um direkte Vergleiche anstellen zu können. Klicken Sie anschließend auf Alle anzeigen, um alle grafischen Steuerelemente sichtbar zu machen, wählen Sie dann die Registerkarte Grafiken und wählen Sie das Rechteckwerkzeug, um einen Bereich auszuwählen, der die interessierenden Kerne enthält.
Verwenden Sie dann den Befehl Bereich ausschneiden, um den gewünschten Bereich zu isolieren. Speichern Sie nun das Bild unter einem neuen Namen und entweder einem LSM- oder CZI-Format und öffnen Sie die Datei erneut in der Zen Blue-Software. Öffnen Sie den ZEN-Schreibtisch in Zen Blue und verwenden Sie dann den Befehl "An ZEN senden" in Zen Black, um die Datei in Zen Blue zu öffnen.
Aktivieren Sie als Nächstes die Registerkarte mit der Bezeichnung 2.5d, um die Visualisierung des Bildes in 2.5d zu aktivieren. Klicken Sie auf Alle anzeigen, um alle grafischen Steuerelemente sichtbar zu machen und die Einstellungen mithilfe der vier grauen Balken zu ändern. Die Balken steuern den Zoom, die Drehung, die Neigung der Achse sowie die Ausdehnung und Verkleinerung der Maßstabsleisten.
Wählen Sie den Rendermodus aus, um die einzelnen Gipfel am besten zu visualisieren, und ändern Sie dann die große Entfernung, indem Sie den Prozentsatz ändern. Je niedriger der Prozentsatz, desto definierter ist jeder einzelne Peak. Bevor Sie nun das 2.5d-Bild speichern, blenden Sie die Dateiliste und die grafischen Werkzeuge aus, indem Sie auf den grauen Pfeil unter dem 2.5d-Plot klicken.
Speichern Sie dann den Plot als Screenshot, indem Sie die Drucktaste auf der Tastatur verwenden. Öffnen Sie die Bildverarbeitungsoption in der Software und öffnen Sie die gewünschte Datei. Wählen Sie als Nächstes die Registerkarte Profil und dann die Registerkarte Alle anzeigen aus, um auf alle Formatierungsoptionen zuzugreifen.
Wählen Sie auf der Registerkarte Profil die Option Tabelle und die Pfeilschaltfläche aus. Wählen Sie nun mit der Maus einen Startpunkt aus und ziehen Sie eine Linie über eine fortlaufende Anzahl von Zellen. Ein Intensitätsdiagramm für die Zellen entlang dieser Linie wird dann zusammen mit der Tabelle der Intensitätsmessungen erstellt. Beachten Sie, dass in der Tabelle auch der Abstand angegeben ist, in dem die Pixelintensität für die rote, grüne und blaue Fluoreszenz rot ist.
Die Einheit ist Mikrometer. Um diese Daten zu exportieren, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Tabelle, wählen Sie Tabelle speichern und speichern Sie sie als Textdatei. Um das Intensitätsprofil zu speichern, wählen Sie die Option "Exportieren" und schalten Sie im Popup-Fenster zwischen zwei Optionen um: getaggte Bilddatei, Format und Inhalt des Bildfensters, Einzelfenster, Daten.
Befolgen Sie dann die Anweisungen, um die Datei zu speichern. Wiederholen Sie diesen Vorgang nun für jedes benötigte Intensitätsprofil. Wählen Sie in der Software Bildverarbeitung und wählen Sie die gewünschte Bilddatei aus.
Wählen Sie dann die Registerkarte coloc für Co-Lokalisierungsanalyse aus, und wählen Sie Alle anzeigen aus, um auf alle Formatierungsoptionen zuzugreifen. Wählen Sie auf den vier Registerkarten in der unteren Hälfte des Bildschirms die Option Co-Lokalisierung und wählen Sie die Tabellen- und Bildoptionen aus. Wählen Sie dann das dritte Symbol oben auf der Registerkarte, gekennzeichnet durch den Popup-Text geschlossen besier.
Verwenden Sie dieses Werkzeug, um einen einzelnen Kern einzukreisen. Die Werte werden dann in der Tabelle angezeigt, und es wird ein Streudiagramm für rote und grüne Fluoreszenz erstellt. Die Achse dieses Diagramms ist verschiebbar und steuert das Gating der Detektion.
Alle Pixelintensitäten innerhalb des Zellkerns sollten als positive Signale betrachtet werden. Da das Ausmaß der DNA-Modifikationen im Zellkern variiert, nehmen wir zur Berücksichtigung schwacher Signale kein Gate für die Daten vor. Wir sollten hier betonen, dass es umstritten ist, ob die Hintergrundwerte in die Analyse einbezogen werden sollten.
Wichtig ist, dass der Überlappungskoeffizient unabhängig von den Unterschieden in der Signalintensität zwischen den beiden Kanälen ist. Während der Personenkorrelationskoeffizient von einer linearen Beziehung zwischen den Signalen ausgeht. Wiederholen Sie nun diesen Vorgang des Umkreisens von Kernen, um den Datensatz zu vervollständigen.
Um die Daten zu exportieren, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Tabelle und folgen Sie den Optionen zum Speichern der Daten. Um ein Co-Lokalisierungsbild zu speichern, verwenden Sie den Exportbefehl mit den beiden Optionen, getaggte Bilddatei, Format und Inhalt des Bildfensters mit einem Fenster, Daten, und folgen Sie dann den Optionen zum Speichern der Datei. Die räumliche Verteilung von zwei oxidierten Desirativen von fünf Methylcytosin wurde bei der Differenzierung haphadischer Vorläuferzellen unter Verwendung des beschriebenen Protokolls untersucht.
Rote und grüne Signale stehen für die beiden unterschiedlichen DNA-Modifikationen. Die Signale sind gut definiert und überlappen sich nur wenig. Erwartungsgemäß stimmen die Profile der beiden Signalintensitäten und der entsprechenden Zelle nicht stark überein.
Das unterschiedliche Muster deutet darauf hin, dass die tap-abhängige Oxidation von fünf Methylcytosin unterschiedliche oxidierte Derivate in spezifischen Chromatinbereichen erzeugen kann. Ein ähnlicher Vergleich der beiden DNA-Modifikationen wurde in Daoy-Medulloblastomzellen und in BXD-Ependymomzellen durchgeführt. Beide Zelllinien stammen von pädiatrischen Hirntumoren.
Die Quantifizierung zeigt, dass BXD-Zellen im Vergleich zu Daoy-Zellen signifikant geringere Spiegel beider Signale aufweisen. Als nächstes wurde die Co-Lokalisierung der oxidierten Derivate von 5MC in undifferenzierten hiPSCs untersucht. 24 Stunden nach Induktion der hepatischen Endodermdifferenzierung und hiPSCs.
In dieser Analyse veränderte sich die Signalkolokalisation signifikant mit der Induktion der Differenzierung, was möglicherweise auf eine reduzierte Größe von fünf CAC in den undifferenzierten Zellen zurückzuführen ist. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie 2,5D-Intensitätsdiagramme und -profile erstellen und wie Sie Co-Lokalisierungsdaten erstellen. Die hier beschriebenen Bildanalyse- und Visualisierungswerkzeuge tragen zur epigenetischen Forschung bei und bieten eine relativ schnelle Möglichkeit, Signale der verschiedenen DNA-Modifikationen in verschiedenen Versuchsgruppen zu vergleichen.
Einmal gemeistert, kann diese Technik in etwa einer Stunde durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Es ist wichtig, eine Überbelichtung zu vermeiden und während der Mikroskopie die gleichen Einstellungen für verschiedene Versuchsgruppen zu verwenden. Luftblasen in der Halterung und unzureichendes Eintauchen können zu lokalem Fluoreszenzverlust führen, daher ist eine visuelle Inspektion des Scanbereichs von entscheidender Bedeutung.
Das Verfahren kann weiter automatisiert werden, indem die Zellkerne segmentiert und interessante Regionen mit Zen Blue erstellt werden. Diese Regionen können in Zen Black importiert werden, um eine Co-Lokalisierungsanalyse an mehreren Kernen durchzuführen.
Überblick
Dieser Artikel präsentiert einen semi-quantitativen Workflow zur Visualisierung neu entdeckter oxidierter Formen von 5-Methylcytosin (oxi-mCs) und deren räumliche Verteilung innerhalb der Zellkerne. Die Methode ermöglicht die Bewertung der Signalintensität und Kolokalisation von DNA-Modifikationen und trägt so zum Verständnis ihrer funktionellen Rollen in der Epigenetik bei.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Epigenetik
- DNA-Modifikationen
- Immunfärbetechniken
Hintergrund
- 5-Methylcytosin und seine oxidierten Derivate spielen eine entscheidende Rolle bei der Genregulation.
- Das Verständnis ihrer räumlichen Verteilung kann Einblicke in ihre funktionellen Auswirkungen geben.
- Bestehende Methoden visualisieren diese Modifikationen möglicherweise nicht ausreichend.
- Diese Studie stellt ein Computerwerkzeug vor, um Visualisierung und Analyse zu verbessern.
Zweck der Studie
- Eine Methode zur Bewertung der räumlichen Verteilung von DNA-Modifikationen zu entwickeln.
- Die Signalintensität und Kolokalisation verschiedener oxidierter Derivate zu analysieren.
- Das Verständnis der funktionellen Rollen dieser Modifikationen in biologischen Systemen zu erleichtern.
Verwendete Methoden
- Immunfärbung von DNA-Modifikationen in Zellkernen.
- Konfokale Mikroskopie für Bilderfassung.
- Bildverarbeitung mit Zen Blue Software zur Visualisierung.
- Kolokationsanalyse der Signalintensitäten.
Hauptergebnisse
- Verschiedene räumliche Muster oxidierter Derivate wurden in verschiedenen Zelltypen beobachtet.
- Die Kolokationsanalyse zeigte signifikante Veränderungen während der Differenzierung.
- Die Quantifizierung zeigte Unterschiede in den Signalniveaus zwischen Zelllinien.
- Die Methode zeigte Potenzial für breitere Anwendungen in der epigenetischen Forschung.
Schlussfolgerungen
- Der entwickelte Workflow verbessert die Visualisierung von DNA-Modifikationen.
- Die Ergebnisse deuten auf unterschiedliche funktionelle Rollen für verschiedene oxidierte Derivate hin.
- Diese Technik kann in verschiedenen biologischen Kontexten für tiefere Einblicke angewendet werden.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
This method enables biopharma R&D teams to quantitatively assess the spatial distribution and signal intensity of DNA modifications in nuclear contexts, supporting mechanistic de-risking in epigenetic target validation. By providing computational analysis of immunostained confocal images, it enhances predictive confidence in early discovery stages where understanding the localization of novel epigenetic marks informs therapeutic hypothesis interrogation. The workflow supports cross-functional collaboration through standardized, reproducible quantitative outputs that can be applied across diverse model systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing tissue- and developmental stage-specific occurrence of DNA modifications in vertebrates.
- Operational Value: Supports biological de-risking through quantitative measurement of signal intensity and distribution patterns in nuclei.
- Predictive Value: Contributes to portfolio triage by providing data on the localization of oxidized derivatives of 5-methylcytosine that may play specific roles in cellular processes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by generating 2.5D signal intensity plots and intensity profiles for multiple cells.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through consistent laser power and gain settings during microscopy, enabling direct comparisons between samples.
- Screening Readiness: Highlights scalability and platform reuse by demonstrating applicability to other epitopes detectable by immunohistochemistry.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Discusses disease relevance through examination of signal colocalization changes during differentiation in hiPSCs and pediatric brain tumor cell lines.
- Risk-Adjusted Advancement: Describes how quantification of signal levels in Daoy medulloblastoma and BXD ependymoma cells supports decision-making in preclinical validation.
- Mechanistic De-risking: Focuses on predictive value by showing how distinct spatial patterns of oxidized derivatives may reflect tap-dependent oxidation in specific chromatin regions.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from Early Discovery to Lead Identification by providing quantitative imaging data that supports hypothesis testing and pathway clarification in epigenetics research.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing through spatial distribution analysis of DNA modifications visualized by immunostaining.
- Screening: Describes assay readiness via signal intensity profiles and table exports that enable quantitative comparison of staining intensity across cells.
- Analytics: Highlights colocalization coefficients and scatter plots that help teams compare conditions and assess relationships between different DNA modifications.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity through analysis of signal changes during differentiation in stem cell and tumor models.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability by noting its added application to computational analysis of other epitopes detectable by immunohistochemistry.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through assessment of nuclear localization and relative levels of DNA modifications.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via consistent imaging settings and exportable data tables for cross-group comparison.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions by enabling evaluation of DNA modification levels in different experimental groups, such as undifferentiated vs. differentiated hiPSCs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization through quantification of signal differences between cell lines, such as lower signals in BXD vs. Daoy cells.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in confocal microscopy and immunostaining for DNA modifications.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs include Zen Blue software for 2.5D visualization, profile analysis, and colocalization tools.
- Cross-team standardization requirements involve maintaining consistent laser power and gain when comparing intensity profiles between samples.
- Adaptation considerations across model systems are supported by the method’s application in differentiating haphadic progenitors, Daoy medulloblastoma, BXD ependymoma, and hiPSCs.
- Practical limitations include the need to avoid overexposure and inspect scanning areas for air bubbles or insufficient immersion that can cause local fluorescence loss.
