Immunostaining für DNA-Modifikationen: computergestützte Analyse der konfokalen Bilder
7. September 2017
Neu entdeckte oxidierte Formen von 5-Methylcytosine (Oxi-mCs), 5-Hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-Formylcytosine (5-Fu) und 5-Carboxylcytosine (5caC) kann verschiedene DNA-Modifikationen mit einzigartigen funktionellen Rollen vertreten. Hier ist ein semi-quantitative Workflow zur Visualisierung der räumlichen Verteilung Oxi-mCs, Signal Intensität Profilierung und NS1 beschrieben.
Das übergeordnete Ziel dieser Technik ist es, ein computergestütztes Werkzeug zur Bewertung der räumlichen Verteilung und Signalintensität von DNA-Modifikationen bereitzustellen, die durch Immunfärbung innerhalb von Zellkernen sichtbar gemacht werden. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Epigenetik zu beantworten, indem sie die Untersuchung der Kernlokalisation und des relativen Ausmaßes von DNA-Modifikationen in verschiedenen Modellsystemen ermöglicht. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die DNA-Modifikationen durch die Größe des Bot-Signals und dann durch die Verteilung gemessen werden.
Eine der Implikationen dieser Technik besteht darin, dass sie unser Verständnis potenzieller funktioneller Reihen von DNA-Modifikationen in verschiedenen biologischen Systemen erleichtert. Diese Technik bietet auch die zusätzliche Anwendung der computergestützten Analyse anderer Epitope, die durch Immunhistochemie nachweisbar sind. Öffnen Sie zunächst die LSM-formatierten Dateien des konfokalen Mikroskopiebildes.
Wählen Sie Bildverarbeitung und dann das gewünschte Bild für die Analyse aus. Beachten Sie, dass beim Vergleich von Intensitätsprofilen zwischen Proben die Laserleistung und die Verstärkung konsistent sein müssen, um direkte Vergleiche anstellen zu können. Klicken Sie anschließend auf Alle anzeigen, um alle grafischen Steuerelemente sichtbar zu machen, wählen Sie dann die Registerkarte Grafiken und wählen Sie das Rechteckwerkzeug, um einen Bereich auszuwählen, der die interessierenden Kerne enthält.
Verwenden Sie dann den Befehl Bereich ausschneiden, um den gewünschten Bereich zu isolieren. Speichern Sie nun das Bild unter einem neuen Namen und entweder einem LSM- oder CZI-Format und öffnen Sie die Datei erneut in der Zen Blue-Software. Öffnen Sie den ZEN-Schreibtisch in Zen Blue und verwenden Sie dann den Befehl "An ZEN senden" in Zen Black, um die Datei in Zen Blue zu öffnen.
Aktivieren Sie als Nächstes die Registerkarte mit der Bezeichnung 2.5d, um die Visualisierung des Bildes in 2.5d zu aktivieren. Klicken Sie auf Alle anzeigen, um alle grafischen Steuerelemente sichtbar zu machen und die Einstellungen mithilfe der vier grauen Balken zu ändern. Die Balken steuern den Zoom, die Drehung, die Neigung der Achse sowie die Ausdehnung und Verkleinerung der Maßstabsleisten.
Wählen Sie den Rendermodus aus, um die einzelnen Gipfel am besten zu visualisieren, und ändern Sie dann die große Entfernung, indem Sie den Prozentsatz ändern. Je niedriger der Prozentsatz, desto definierter ist jeder einzelne Peak. Bevor Sie nun das 2.5d-Bild speichern, blenden Sie die Dateiliste und die grafischen Werkzeuge aus, indem Sie auf den grauen Pfeil unter dem 2.5d-Plot klicken.
Speichern Sie dann den Plot als Screenshot, indem Sie die Drucktaste auf der Tastatur verwenden. Öffnen Sie die Bildverarbeitungsoption in der Software und öffnen Sie die gewünschte Datei. Wählen Sie als Nächstes die Registerkarte Profil und dann die Registerkarte Alle anzeigen aus, um auf alle Formatierungsoptionen zuzugreifen.
Wählen Sie auf der Registerkarte Profil die Option Tabelle und die Pfeilschaltfläche aus. Wählen Sie nun mit der Maus einen Startpunkt aus und ziehen Sie eine Linie über eine fortlaufende Anzahl von Zellen. Ein Intensitätsdiagramm für die Zellen entlang dieser Linie wird dann zusammen mit der Tabelle der Intensitätsmessungen erstellt. Beachten Sie, dass in der Tabelle auch der Abstand angegeben ist, in dem die Pixelintensität für die rote, grüne und blaue Fluoreszenz rot ist.
Die Einheit ist Mikrometer. Um diese Daten zu exportieren, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Tabelle, wählen Sie Tabelle speichern und speichern Sie sie als Textdatei. Um das Intensitätsprofil zu speichern, wählen Sie die Option "Exportieren" und schalten Sie im Popup-Fenster zwischen zwei Optionen um: getaggte Bilddatei, Format und Inhalt des Bildfensters, Einzelfenster, Daten.
Befolgen Sie dann die Anweisungen, um die Datei zu speichern. Wiederholen Sie diesen Vorgang nun für jedes benötigte Intensitätsprofil. Wählen Sie in der Software Bildverarbeitung und wählen Sie die gewünschte Bilddatei aus.
Wählen Sie dann die Registerkarte coloc für Co-Lokalisierungsanalyse aus, und wählen Sie Alle anzeigen aus, um auf alle Formatierungsoptionen zuzugreifen. Wählen Sie auf den vier Registerkarten in der unteren Hälfte des Bildschirms die Option Co-Lokalisierung und wählen Sie die Tabellen- und Bildoptionen aus. Wählen Sie dann das dritte Symbol oben auf der Registerkarte, gekennzeichnet durch den Popup-Text geschlossen besier.
Verwenden Sie dieses Werkzeug, um einen einzelnen Kern einzukreisen. Die Werte werden dann in der Tabelle angezeigt, und es wird ein Streudiagramm für rote und grüne Fluoreszenz erstellt. Die Achse dieses Diagramms ist verschiebbar und steuert das Gating der Detektion.
Alle Pixelintensitäten innerhalb des Zellkerns sollten als positive Signale betrachtet werden. Da das Ausmaß der DNA-Modifikationen im Zellkern variiert, nehmen wir zur Berücksichtigung schwacher Signale kein Gate für die Daten vor. Wir sollten hier betonen, dass es umstritten ist, ob die Hintergrundwerte in die Analyse einbezogen werden sollten.
Wichtig ist, dass der Überlappungskoeffizient unabhängig von den Unterschieden in der Signalintensität zwischen den beiden Kanälen ist. Während der Personenkorrelationskoeffizient von einer linearen Beziehung zwischen den Signalen ausgeht. Wiederholen Sie nun diesen Vorgang des Umkreisens von Kernen, um den Datensatz zu vervollständigen.
Um die Daten zu exportieren, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Tabelle und folgen Sie den Optionen zum Speichern der Daten. Um ein Co-Lokalisierungsbild zu speichern, verwenden Sie den Exportbefehl mit den beiden Optionen, getaggte Bilddatei, Format und Inhalt des Bildfensters mit einem Fenster, Daten, und folgen Sie dann den Optionen zum Speichern der Datei. Die räumliche Verteilung von zwei oxidierten Desirativen von fünf Methylcytosin wurde bei der Differenzierung haphadischer Vorläuferzellen unter Verwendung des beschriebenen Protokolls untersucht.
Rote und grüne Signale stehen für die beiden unterschiedlichen DNA-Modifikationen. Die Signale sind gut definiert und überlappen sich nur wenig. Erwartungsgemäß stimmen die Profile der beiden Signalintensitäten und der entsprechenden Zelle nicht stark überein.
Das unterschiedliche Muster deutet darauf hin, dass die tap-abhängige Oxidation von fünf Methylcytosin unterschiedliche oxidierte Derivate in spezifischen Chromatinbereichen erzeugen kann. Ein ähnlicher Vergleich der beiden DNA-Modifikationen wurde in Daoy-Medulloblastomzellen und in BXD-Ependymomzellen durchgeführt. Beide Zelllinien stammen von pädiatrischen Hirntumoren.
Die Quantifizierung zeigt, dass BXD-Zellen im Vergleich zu Daoy-Zellen signifikant geringere Spiegel beider Signale aufweisen. Als nächstes wurde die Co-Lokalisierung der oxidierten Derivate von 5MC in undifferenzierten hiPSCs untersucht. 24 Stunden nach Induktion der hepatischen Endodermdifferenzierung und hiPSCs.
In dieser Analyse veränderte sich die Signalkolokalisation signifikant mit der Induktion der Differenzierung, was möglicherweise auf eine reduzierte Größe von fünf CAC in den undifferenzierten Zellen zurückzuführen ist. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie 2,5D-Intensitätsdiagramme und -profile erstellen und wie Sie Co-Lokalisierungsdaten erstellen. Die hier beschriebenen Bildanalyse- und Visualisierungswerkzeuge tragen zur epigenetischen Forschung bei und bieten eine relativ schnelle Möglichkeit, Signale der verschiedenen DNA-Modifikationen in verschiedenen Versuchsgruppen zu vergleichen.
Einmal gemeistert, kann diese Technik in etwa einer Stunde durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Es ist wichtig, eine Überbelichtung zu vermeiden und während der Mikroskopie die gleichen Einstellungen für verschiedene Versuchsgruppen zu verwenden. Luftblasen in der Halterung und unzureichendes Eintauchen können zu lokalem Fluoreszenzverlust führen, daher ist eine visuelle Inspektion des Scanbereichs von entscheidender Bedeutung.
Das Verfahren kann weiter automatisiert werden, indem die Zellkerne segmentiert und interessante Regionen mit Zen Blue erstellt werden. Diese Regionen können in Zen Black importiert werden, um eine Co-Lokalisierungsanalyse an mehreren Kernen durchzuführen.
Übersicht
Dieser Artikel stellt einen halbquantitativen Arbeitsablauf zur Visualisierung neu entdeckter oxidierter Formen von 5-Methylcytosin (oxi-mCs) und ihrer räumlichen Verteilung innerhalb von Kernen vor. Die Methode ermöglicht die Beurteilung der Signalintensität und der Kolokalisation von DNA-Modifikationen und trägt somit zum Verständnis ihrer funktionellen Rolle in der Epigenetik bei.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Epigenetik
- DNA-Modifikationen
- Immunfärbetechniken
Hintergrund
- 5-Methylcytosin und seine oxidierten Derivate spielen entscheidende Rollen bei der Genregulation.
- Das Verständnis ihrer räumlichen Verteilung kann Einblicke in ihre funktionellen Auswirkungen liefern.
- Bestehende Methoden können diese Modifikationen möglicherweise nicht ausreichend visualisieren.
- Diese Studie stellt ein computergestütztes Werkzeug vor, um die Visualisierung und Analyse zu verbessern.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer Methode zur Beurteilung der räumlichen Verteilung von DNA-Modifikationen.
- Analyse der Signalintensität und Kolokalisation verschiedener oxidierter Derivate.
- Unterstützung des Verständnisses der funktionellen Rollen dieser Modifikationen in biologischen Systemen.
Verwendete Methoden
- Immunfärbung von DNA-Modifikationen in Kernen.
- Konfokale Mikroskopie zur Bildaufnahme.
- Bildverarbeitung mit Zen Blue-Software zur Visualisierung.
- Kokalalisationsanalyse der Signalintensitäten.
Hauptergebnisse
- Es wurden unterschiedliche räumliche Muster oxidiierter Derivate in verschiedenen Zelltypen beobachtet.
- Die Kolokalisationsanalyse zeigte signifikante Veränderungen während der Differenzierung.
- Die Quantifizierung ergab Unterschiede in den Signalintensitäten zwischen Zelllinien.
- Die Methode zeigte Potenzial für weiterreichende Anwendungen in der epigenetischen Forschung.
Schlussfolgerungen
- Der entwickelte Arbeitsablauf verbessert die Visualisierung von DNA-Modifikationen.
- Die Ergebnisse deuten auf unterschiedliche funktionelle Rollen für verschiedene oxidierte Derivate hin.
- Diese Technik kann in verschiedenen biologischen Kontexten angewendet werden, um tiefere Einblicke zu gewinnen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Diese Methode ermöglicht es Biopharma-F&E-Teams, die räumliche Verteilung und Signalintensität von DNA-Modifikationen in nukleären Kontexten quantitativ zu bewerten und unterstützt so die mechanistische Entschärfung von Risiken bei der Validierung epigenetischer Zielstrukturen. Durch die berechnende Analyse immunofluoreszenzmarkierter konfokaler Bilder wird das prognostische Vertrauen in frühen Entdeckungsphasen gestärkt, in denen das Verständnis der Lokalisation neuartiger epigenetischer Markierungen die Überprüfung therapeutischer Hypothesen voranbringt. Der Arbeitsablauf fördert die Zusammenarbeit zwischen Fachbereichen durch standardisierte, reproduzierbare quantitative Ergebnisse, die auf verschiedene Modellsysteme angewendet werden können.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch die Visualisierung der gewebe- und entwicklungsstadiumsspezifischen Vorkommen von DNA-Modifikationen bei Wirbeltieren.
- Operativer Wert: Unterstützt die biologische Ent风险bewertung durch quantitative Messung der Signalintensität und Verteilungsmuster in den Kernen.
- Prädiktiver Wert: Leistet einen Beitrag zur Portfolio-Priorisierung, indem er Daten über die Lokalisation oxidierten Derivate von 5-Methylcytosin bereitstellt, die möglicherweise spezifische Rollen in zellulären Prozessen spielen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bereitet validierte biologische Systeme für nachgeschaltete Workflows vor, indem 2,5D-Signalintensitätsdarstellungen und Intensitätsprofile für mehrere Zellen generiert werden.
- Operativer Wert: Trägt zur Standardisierung und Reproduzierbarkeit von Assays bei, indem während der Mikroskopie konstante Laserleistung und Verstärkungseinstellungen verwendet werden, was direkte Vergleiche zwischen Proben ermöglicht.
- Eignung für die Hochdurchsatzanalyse: Unterstreicht Skalierbarkeit und Plattformwiederverwendung, indem die Anwendbarkeit auf andere Epitope gezeigt wird, die mittels Immunhistochemie nachweisbar sind.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Erläutert die Krankheitsrelevanz durch Untersuchung von Veränderungen der Signal-Kokompartimentierung während der Differenzierung in hiPSCs und pädiatrischen Hirntumorzelllinien.
- Risikoadjustierte Weiterentwicklung: Beschreibt, wie die Quantifizierung von Signalintensitäten in Daoy-Medulloblastom- und BXD-Ependymomzellen die Entscheidungsfindung bei der präklinischen Validierung unterstützt.
- Mechanistische Risikominimierung: Konzentriert sich auf den prädiktiven Wert, indem gezeigt wird, wie unterschiedliche räumliche Muster oxidierte Derivate möglicherweise tap-abhängige Oxidation in spezifischen Chromatinregionen widerspiegeln.
Integration von Pipeline und Workflow
Die Methode integriert sich in den Entdeckungsprozess von der Frühphase der Entdeckung bis zur Identifizierung von Wirkstoffkandidaten, indem sie quantitative Bildgebungsdaten bereitstellt, die Hypothesentests und die Aufklärung von Signalwegen in der Epigenetikforschung unterstützen.
- Entdeckungsbiologie: Erläutert, wie die Methode die Hypothesenprüfung durch die Analyse der räumlichen Verteilung von DNA-Modifikationen unterstützt, die mittels Immunfärbung sichtbar gemacht werden.
- Screening: Beschreibt die Bereitschaft des Assays anhand von Signalintensitätsprofilen und Tabellenexporten, die einen quantitativen Vergleich der Färbungsintensität zwischen Zellen ermöglichen.
- Analytik: Betont Kolokalisationkoeffizienten und Streudiagramme, die Teams dabei helfen, Bedingungen zu vergleichen und Beziehungen zwischen verschiedenen DNA-Modifikationen zu bewerten.
- Translationale Forschung: Verbindet die Methode mit der präklinischen Kontinuität durch die Analyse von Signaländerungen während der Differenzierung in Stammzell- und Tumormodellen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Stellt die Methode als wiederverwendbare Fähigkeit dar, indem auf ihre zusätzliche Anwendung bei der computergestützten Analyse anderer Epitope hingewiesen wird, die mittels Immunhistochemie nachweisbar sind.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Vorhersagegenauigkeit bei der Target-Validierung durch Beurteilung der nukleären Lokalisation und relativer Mengen an DNA-Modifikationen.
- Operativer Wert: Standardisierung und Reproduzierbarkeit durch konsistente Bildgebungsparameter und exportierbare Datentabellen für den Vergleich zwischen Gruppen.
- Strategischer Wert: Verbesserte Go/No-Go-Entscheidungen durch die Möglichkeit, DNA-Modifikationsgrade in verschiedenen experimentellen Gruppen zu bewerten, beispielsweise undifferenzierte vs. differenzierte hiPSCs.
- Portfolio-Wirkung: Risikoadjustierte Priorisierung durch Quantifizierung von Signaldifferenzen zwischen Zelllinien, beispielsweise niedrigere Signale in BXD- gegenüber Daoy-Zellen.
Durchführungsaspekte
- Notwendige wissenschaftliche Fachkenntnisse in konfokaler Mikroskopie und Immunfärbung für DNA-Modifikationen.
- Zu den Anforderungen an Instrumente und analytische Infrastruktur gehören die Zen-Blue-Software für 2,5D-Visualisierung, Profilanalyse und Kollokalisationstools.
- Standardisierungsanforderungen über Teamgrenzen hinweg beinhalten die Aufrechterhaltung konstanter Laserleistung und Verstärkung bei der Vergleichbarkeit von Intensitätsprofilen zwischen Proben.
- Anpassungsüberlegungen über verschiedene Modellsysteme hinweg werden durch die Anwendung der Methode bei der Differenzierung von haphatischen Vorläufern, Daoy-Medulloblastomen, BXD-Ependymomen und hiPSCs unterstützt.
- Zu den praktischen Einschränkungen gehört die Notwendigkeit, Überbelichtung zu vermeiden und die Abtastbereiche auf Luftblasen oder unzureichende Immersion zu überprüfen, die zu lokalem Fluoreszenzverlust führen können.
