Name: Immunostaining für DNA-Modifikationen: computergestützte Analyse der konfokalen Bilder (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Lernen Sie eine computergestützte Methode zur Analyse räumlicher Verteilung und Signalintensität von DNA-Modifikationen in Zellkernen mittels Immunfärbung und konfokaler Mikroskopie.

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Die Arbeit wurde von Biotechnologie und biologische Wissenschaften Research Council [BB/N005759/1, A.R] unterstützt. NRFH wurde von der Rosetrees Vertrauen und The Stoneygate finanziert [A1130 / M546]. Das Zeiss Elyra PS.1 Mikroskop, die Verarbeitung Computer und Software wurden durch BBSRC BB/L013827/1 (multidisziplinäre Super Auflösung Mikroskopie Facility in Nottingham University Grant) finanziert.

1. Generation der konfokalen Bilder <ol><li>In Vorbereitung auf die Analyse der modifizierte Formen von Cytosin, immunhistochemische Färbung wie von Abakir Et Al. beschrieben durchführen 34.</li> <li>durchzuführen Bildgebung von Folien, unter Verwendung eines Mikroskops und Speichern von Dateien in einem Format LSM. 
	Hinweis: Beim Vergleich der Intensität zwischen Proben die Werte für Laserleistung und Verstärkung für jeden Kanal Profile beibehalten werden im gesamten Bild Verfahren ermöglicht direkten Vergleich in der Bild-Analyse-Phase nehmen.</li>
</ol> 2. Generation von 2.5D Intensität Grundstücke <ol><li>Öffnen Sie die Software (z. B. Zen schwarz) und wählen Sie &#39; Image Processing &#39;.</li>
	<li>Rufen Sie das Menü "Datei" und wählen Sie öffnen. Wählen Sie das Bild, die Verarbeitung erfordert.</li>
	<li>Klicken Sie auf &#39; zeigen alle &#39; unter dem Bild um alle grafischen Steuerelemente sichtbar zu machen. In der unteren Hälfte des Bildschirms gibt es drei Registerkarten; &#39; Abmessungen &#39;, &#39; Anzeige &#39; und &#39; Grafik &#39;, wählen Sie die &#39; Grafik &#39; tab.
	<ol><li>Wählen Sie die &#39; Rechteck &#39; Tool Kerne/Interessengebiet auswählen.</li>
		<li>Select &#39; schneiden Region &#39; um das Bild zu beschneiden. Dies erzeugt ein neues Bild für die abgeschnittenen Region in eine separate Registerkarte</li>
		<li>Gehen Sie auf das Menü "Datei" und wählen Sie speichern unter speichern geben Sie die Datei einen Namen und speichern Sie es als LSM oder CZI-Datei.</li>
	</ol></li> <li>Software (z. B. Zen blau) zu öffnen, und wählen Sie die &#39; Zen Schreibtisch &#39;.</li>
	<li>Senden Sie das zugeschnittene Bild von Zen schwarz an Zen Blau wählen Sie die Datei und klicken Sie auf das Menü "Datei" und wählen Sie senden, Zen 2012-blaue Ausgabe. Das zugeschnittene Bild öffnet sich dann in das entsprechende Programm. 
	Hinweis: Die Image-Datei wird übertragen, weil die 2.5D Intensität Plot-Funktion in Zen Black 2012 nicht mehrere Kanal Bilder gleichzeitig angezeigt werden.</li>
	<li>Auf der linken Seite des Bildes wählen Sie die Registerkarte gekennzeichnet &#39; 2,5 D &#39;, dies ermöglicht die Visualisierung des Bildes in 2.5D. Klicken Sie auf &#39; alle &#39; alle grafischen Steuerelemente sichtbar zu machen.</li>
	<li>Alter Visualisierung Einstellungen mit vier grauen Balken befindet sich auf der linken Seite und unten das Bild. 
	Hinweis: linke Hand Bar, oben im Bildschirm = Zoom. Bar der linken, unteren Bildschirmrand = drehen Bild auf Achse. Unteren Bildschirmrand, linke Hand bar = Drehung des Bildes. Unteren Bildschirmrand rechts Hand Bar = ausdehnen und zusammenziehen, Maßstabsleisten.</li>
	<li>Gewährleisten die Render-Modus ausgewählt ist Oberfläche, da dadurch die beste Visualisierung der einzelnen Peaks.</li>
	<li>Grid-Entfernung zu verändern durch eine Änderung dem Prozentsatz, desto geringer des Prozentsatzes mehr definiert jede einzelne Spitze.</li>
	<li>Zum Speichern des Bildes 2.5D verstecken zuerst die Datei-Liste auf der rechten Seite und die grafische Werkzeuge unter dem Bild durch Klicken auf den grauen Pfeil unterhalb der 2,5-D-Plot (neben &#39; zeigen alle &#39;), dadurch wird ausgeblendet, die grafische Registerkarten ermöglicht das Bild, um zu erweitern, um das Geröll zu füllen n. um die 2,5-D-Plot zu speichern, drücken Sie die &#39; PrtSc &#39; Taste auf der Tastatur. Dies wird einen Screenshot des Displays. Fügen Sie den Screenshot in Microsoft Paint und beschneiden Sie das Bild vor dem speichern.</li>
</ol> 3. Intensität Profiling <ol><li>Öffnen Sie die Software (z. B. Zen schwarz) und wählen Sie die Image Processing.</li>
	<li>Rufen Sie das Menü "Datei" und wählen Sie öffnen. Wählen Sie das Bild, die Verarbeitung erfordert.</li>
	<li>Wie das Bild auf dem Bildschirm angezeigt wird, auf der linken Seite des Bildes wählen Sie die Registerkarte gekennzeichnet &#39; Profil &#39;.</li>
	<li>In der unteren Hälfte des Bildschirms auswählen (Häkchen) die &#39; zeigen alle &#39; Registerkarte ". Dies ermöglicht Zugriff auf alle Formatierungsoptionen.</li>
	<li>In der unteren Hälfte des Bildschirms gibt es drei Registerkarten; &#39; Abmessungen &#39;, &#39; Anzeige &#39; und &#39; ProfileƆ wählen &#39; Profil &#39; und wählen Sie (Häkchen) der &#39; Tabelle &#39; Feld. Wählen Sie die &#39; Pfeil &#39; Schaltfläche ".</li>
	<li>Verwenden Sie die Maus auf das Bild, wählen einen Startpunkt und ziehen die Maus über eine kontinuierliche Reihe von Zellen. Lassen Sie die Maustaste um eine Intensität Handlung für die Zellen entlang der Linie zu produzieren; Zusätzlich wird die Tabelle von Intensität Messdaten für die Pixel entlang der Linie für jede Wellenlänge bevölkert werden. 
	Hinweis: Die Tabelle erhalten den Abstand (µm) welches Pixel ist für die roten, grünen und blauen Fluoreszenz Intensität lesen.</li>
	<li>Um diese Daten zu exportieren, klicken Sie rechts auf die Tabelle und wählen Sie &#39; speichern Tabelle &#8230; &#39; und speichern Sie auf einer geeigneten Stelle als .txt-Datei.</li>
	<li>, Der eingestellten Intensität Profilbild zu speichern, wählen Sie das Menü "Datei" und wählen Sie &#39; exportieren &#8230; &#39;. Wählen Sie im Popup-Fenster &#39; Tagged Image-Datei (Format) &#39; und &#39; Bildfenster Inhalt - einzelne Scheibe (Daten) &#39; gefolgt von einem Klick &#39; Dateinamen auswählen und speichern &#8230; &#39; wählen Sie einen geeigneten Speicherort und klicken Sie auf &#39; speichern &#39;.</li>
	<li>Wiederholen Sie den Vorgang für jedes individuelle Intensität Profil je nach Blickwinkel und Anzahl der Profile zu analysieren.</li>
	<li>Import Intensität Profile Daten gespeichert (siehe 3.7) und in einer Tabellenkalkulation, gefolgt von statistischen Analyse analysieren.</li>
</ol> 4. Co Lokalisierung Analyse <ol><li>Öffnen Sie die Software und wählen Sie &#39; Bildverarbeitung &#39;.</li>
	<li>Rufen Sie das Menü "Datei" und wählen Sie öffnen. Wählen Sie das Bild, die Verarbeitung erfordert.</li>
	<li>Wie das Bild auf dem Bildschirm angezeigt wird, auf der linken Seite des Bildes wählen Sie die Registerkarte gekennzeichnet &#39; Coloc &#39;.</li>
	<li>In der unteren Hälfte des Bildschirms auswählen (Häkchen) die &#39; zeigen alle &#39; Registerkarte ". Dies ermöglicht Zugriff auf alle Formatierungsoptionen.</li>
	<li>In der unteren Hälfte des Bildschirms gibt es vier Registerkarten; &#39; Abmessungen &#39;, &#39; Anzeige &#39;, &#39; Grafiken &#39; und &#39; ColocalizationƆ Select &#39; NS1 &#39; und aktivieren Sie das Kontrollkästchen für &#39; Tabelle &#39; und &#39; Bild &#39;.
	Wählen Sie das dritte Symbol entlang am oberen Rand dieser Registerkarte (Nähe Bezier Text angezeigt wird, wenn die Maus über das Tool) mit diesem Tool können einzelne Kerne einzukreisen, Werte für diese Kerne wird dann erscheinen in der Tabelle <li><ol>. 
		Hinweis: Für jede Eingekreistes Kerne ein Streudiagramm für Rot und grün fluoreszieren entsteht, die im linken Bereich auf dem Bildschirm visualisiert wird. Die Achse wird dann verschoben, um Zellen abhängig von der Schwelle Tor. Wie die Kerne von Interesse in den Bildern manuell ausgewählt, ist die Anpassung der gating Schwellen über Null nicht erforderlich. Alle Pixelwerte Intensität beobachtet innerhalb der nuklearen Perimeter gelten als positives Signal.</li>
	</ol></li> <li>Wiederholen Sie diesen Vorgang durch das dritte Symbol in der Registerkarte auswählen und rings um nachfolgende Kerne, bis das Dataset abgeschlossen ist.</li>
	<li>Um diese Daten zu exportieren, klicken Sie rechts auf den Tisch, wählen Sie speichern Tabelle und speichern Sie auf einem geeigneten Ort.</li>
	<li>Das NS1-Bild speichern wählen Sie das Menü "Datei" und wählen Sie &#39; exportieren &#8230; &#39; wählen; Verschlagwortet mit Image-Datei (Format) und &#39; Inhalt des Bildfensters &#8211; Ebene (Daten) &#39; gefolgt von einem Klick &#39; Dateinamen auswählen und speichern &#8230; &#39;, wählen Sie einen geeigneten Speicherort und klicken Sie auf &#39; speichern &#39;.</li>
	<li>Plotten NS1 Daten in einer Tabellenkalkulation, gefolgt von statistischen Analyse.</li>
</ol>

<ol><li>Bird, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+restriction+enzymes+to+study+eukaryotic+DNA+methylation%3A+II.+The+symmetry+of+methylated+sites+supports+semi-conservative+copying+of+the+methylation+pattern%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Use of restriction enzymes to study eukaryotic DNA methylation: II. The symmetry of methylated sites supports semi-conservative copying of the methylation pattern.</a> J Mol Biol. 118 (1), 49-60 (1978).</li>
<li>Youssoufian, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recurrent+mutations+in+haemophilia+A+give+evidence+for+CpG+mutation+hotspots%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Recurrent mutations in haemophilia A give evidence for CpG mutation hotspots.</a> Nature. 324 (6095), 380-382 (1985).</li>
<li>Holliday, R., Pugh, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+modification+mechanisms+and+gene+activity+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Monograph+Series%22%5BJournal%5D)">DNA modification mechanisms and gene activity during development.</a> Cold Spring Harbor Monograph Series. 32, 639-645 (1996).</li>
<li>Christman, J. K., Price, P., Pedrinan, L., Acs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+between+hypomethylation+of+DNA+and+expression+of+globin+genes+in+Friend+erythroleukemia+cells%5BTitle%5D)+AND+%22European+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Correlation between hypomethylation of DNA and expression of globin genes in Friend erythroleukemia cells.</a> European J Biochem. 81 (1), 53-61 (1977).</li>
<li>Bird, A. P., Southern, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+restriction+enzymes+to+study+eukaryotic+DNA+methylation%3A+I.+The+methylation+pattern+in+ribosomal+DNA+from+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Use of restriction enzymes to study eukaryotic DNA methylation: I. The methylation pattern in ribosomal DNA from Xenopus laevis.</a> J Mol Biol. 118 (1), 27-47 (1978).</li>
<li>Kim, G. D., Ni, J., Kelesoglu, N., Roberts, R. J., Pradhan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-operation+and+communication+between+the+human+maintenance+and+de+novo+DNA+%28cytosine-5%29+methyltransferases%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Co-operation and communication between the human maintenance and de novo DNA (cytosine-5) methyltransferases.</a> EMBO J. 21 (15), 4183-4195 (2002).</li>
<li>Reik, W., Kelsey, G., Walter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+de+novo+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+genetics%22%5BJournal%5D)">Dissecting de novo methylation.</a> Nature genetics. 23 (4), 380-382 (1999).</li>
<li>Okano, M., Bell, D. W., Haber, D. A., Li, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methyltransferases+Dnmt3a+and+Dnmt3b+are+essential+for+de+novo+methylation+and+mammalian+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b are essential for de novo methylation and mammalian development.</a> Cell. 99 (3), 247-257 (1999).</li>
<li>Eckhardt, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation+profiling+of+human+chromosomes+6%2C+20+and+22%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">DNA methylation profiling of human chromosomes 6, 20 and 22.</a> Nat Genet. 38 (12), 1378-1385 (2006).</li>
<li>Lees-Murdock, D. J., Lau, H. -T., Castrillon, D. H., De Felici, M., Walsh, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methyltransferase+loading%2C+but+not+de+novo+methylation%2C+is+an+oocyte-autonomous+process+stimulated+by+SCF+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA methyltransferase loading, but not de novo methylation, is an oocyte-autonomous process stimulated by SCF signalling.</a> Dev Biol. 321 (1), 238-250 (2008).</li>
<li>Leonhardt, H., Page, A. W., Weier, H. -U., Bestor, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+targeting+sequence+directs+DNA+methyltransferase+to+sites+of+DNA+replication+in+mammalian+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A targeting sequence directs DNA methyltransferase to sites of DNA replication in mammalian nuclei.</a> Cell. 71 (5), 865-873 (1992).</li>
<li>Jones, P. A., Taylor, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+differentiation%2C+cytidine+analogs+and+DNA+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cellular differentiation, cytidine analogs and DNA methylation.</a> Cell. 20 (1), 85-93 (1980).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22DNA+methylation%3A+DNA+Methylation+in+Early+mammalian+Development%22">DNA methylation: DNA Methylation in Early mammalian Development</a>. Jähner, D., Jaenisch, R. , Springer. 189-219 (1984).</li>
<li>Chalitchagorn, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinctive+pattern+of+LINE-1+methylation+level+in+normal+tissues+and+the+association+with+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Distinctive pattern of LINE-1 methylation level in normal tissues and the association with carcinogenesis.</a> Oncogene. 23 (54), 8841-8846 (2004).</li>
<li>Fatemi, M., Hermann, A., Gowher, H., Jeltsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dnmt3a+and+Dnmt1+functionally+cooperate+during+de+novo+methylation+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Dnmt3a and Dnmt1 functionally cooperate during de novo methylation of DNA.</a> Eur J Biochem. 269 (20), 4981-4984 (2002).</li>
<li>Gruenbaum, Y., Cedar, H., Razin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+and+sequence+specificity+of+a+eukaryotic+DNA+methylase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Substrate and sequence specificity of a eukaryotic DNA methylase.</a> Nature. 295 (5850), 620-622 (1982).</li>
<li>Dean, W., Santos, F., Reik, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+reprogramming+in+early+mammalian+development+and+following+somatic+nuclear+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+cell+%26+developmental+biology+%28Elsevier%29%22%5BJournal%5D)">Epigenetic reprogramming in early mammalian development and following somatic nuclear transfer.</a> Seminars in cell & developmental biology (Elsevier). 14 (1), 93-100 (2003).</li>
<li>Wu, S. C., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+DNA+demethylation%3A+many+roads+lead+to+Rome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Active DNA demethylation: many roads lead to Rome.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (9), 607-620 (2010).</li>
<li>Ito, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tet+proteins+can+convert+5-methylcytosine+to+5-formylcytosine+and+5-carboxylcytosine%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tet proteins can convert 5-methylcytosine to 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine.</a> Science. 333 (6047), 1300-1303 (2011).</li>
<li>Tahiliani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+5-methylcytosine+to+5-hydroxymethylcytosine+in+mammalian+DNA+by+MLL+partner+TET1%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1.</a> Science. 324 (5929), 930-935 (2009).</li>
<li>Bachman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Formylcytosine+can+be+a+stable+DNA+modification+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">5-Formylcytosine can be a stable DNA modification in mammals.</a> Nat Chem Biol. 11 (8), 555-557 (2015).</li>
<li>Bachman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Hydroxymethylcytosine+is+a+predominantly+stable+DNA+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem%22%5BJournal%5D)">5-Hydroxymethylcytosine is a predominantly stable DNA modification.</a> Nat Chem. 6 (12), 1049-1055 (2014).</li>
<li>Lurlaro, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+genome-wide+profiling+reveals+a+tissue-specific+role+for+5-formylcytosine%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo genome-wide profiling reveals a tissue-specific role for 5-formylcytosine.</a> Genome Biol. 17 (1), 141(2016).</li>
<li>Tamanaha, E., Guan, S., Marks, K., Saleh, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distributive+Processing+by+the+Iron+%28II%29%2F%CE%B1-Ketoglutarate-Dependent+Catalytic+Domains+of+the+TET+Enzymes+Is+Consistent+with+Epigenetic+Roles+for+Oxidized+5-Methylcytosine+Bases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Distributive Processing by the Iron (II)/α-Ketoglutarate-Dependent Catalytic Domains of the TET Enzymes Is Consistent with Epigenetic Roles for Oxidized 5-Methylcytosine Bases.</a> J Am Chem Soc. 138 (30), 9345-9348 (2016).</li>
<li>He, Y. -F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tet-mediated+formation+of+5-carboxylcytosine+and+its+excision+by+TDG+in+mammalian+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA.</a> Science. 333 (6047), 1303-1307 (2011).</li>
<li>Herman, J. G., Graff, J. R., Myöhänen, S., Nelkin, B. D., Baylin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylation-specific+PCR%3A+a+novel+PCR+assay+for+methylation+status+of+CpG+islands%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands.</a> Proc Natl Acad Sci. 93 (18), 9821-9826 (1996).</li>
<li>Nagae, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+demethylation+in+CpG-poor+promoters+during+cellular+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific demethylation in CpG-poor promoters during cellular differentiation.</a> Hum Mol Genet. 20 (14), 2710-2721 (2011).</li>
<li>Ficz, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+regulation+of+5-hydroxymethylcytosine+in+mouse+ES+cells+and+during+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dynamic regulation of 5-hydroxymethylcytosine in mouse ES cells and during differentiation.</a> Nature. 473 (7347), 398-402 (2011).</li>
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<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abundant+DNA+6mA+methylation+during+early+embryogenesis+of+zebrafish+and+pig%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Abundant DNA 6mA methylation during early embryogenesis of zebrafish and pig.</a> Nat Commun. 7, (2016).</li>
<li>Wu, T. P., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27027282">DNA methylation on N6-adenine in embryonic stem cells.</a> Nature. 532 (7599), 329-333 (2016).</li>
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<li>Abakir, A., Wheldon, L. M., Ruzov, A. <a target="_blank" href="http://link.springer.com/protocol/10.1007%2F978-1-4939-2754-8_8">Epigenetic Methods in Neuroscience Research: Immunohistochemical Detection of Oxidized Forms of 5-Methylcytosine in Embryonic and Adult Brain Tissue</a>. , Springer. 125-137 (2016).</li>
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<li>Chen, Y., Damayanti, N., Irudayaraj, J., Dunn, K., Zhou, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+of+two+forms+of+DNA+methylation+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">Diversity of two forms of DNA methylation in the brain.</a> Front Genet. 5, 46(2014).</li>
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<li>Lachmanovich, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-localization+analysis+of+complex+formation+among+membrane+proteins+by+computerized+fluorescence+microscopy%3A+application+to+immunofluorescence+co-patching+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Co-localization analysis of complex formation among membrane proteins by computerized fluorescence microscopy: application to immunofluorescence co-patching studies.</a> J Microsc. 212 (Pt 2), 122-131 (2003).</li>
</ol>

Potenzielle Interessenkonflikte wurden bekannt gegeben.

Dieses Protokoll beschreibt den schrittweisen Prozess der Generierung visueller Darstellungen von DNA-Veränderungen innerhalb der Kerne. Während sensible und wirkungsvolle, besitzen diese Techniken eine Reihe von Einschränkungen.
Es ist notwendig zu betonen, dass Grundstücke von 2.5D generierten Daten, Signal Intensität Profile und NS1 Analyse sind semi-quantitativen in der Natur. Aufgrund der Punkt für Punkt Beleuchtung der Probe während der Bildaufnahme über die Laser-scanning-confocal Mikroskop sind absolute Signalintensitäten der einzelnen Kanäle aufgezeichnet. Jedoch sind keine absoluten Größen der 5hmC und 5caC Wesen erkannt und nur Anzeichen für die Anwesenheit, Abwesenheit oder Skala dieser epigenetischen Markierungen darstellen.
Aufgrund der sich wiederholenden Signal Amplifikationen verwechseln Einschränkungen konsistent mit der Größe der Maschinen angewendet, um das Signal unweigerlich zu verbessern Annäherungen der wahre körperliche genomische Belegung von diesen Marken-34. Die wahre genomische Lokalisation dieser Marken kann durch diese sperrigen Proteine, die physisch Gebieten auch bei optimalen konfokale Auflösung Grenzen von 200-300 nm34unlösbaren besetzen verdeckt werden. Darüber hinaus können nicht die Signalintensitäten der einzelnen Kanäle für jede Marke aufgrund der unterschiedlichen Antikörper Empfindlichkeit und Fluorophor Konjugation34miteinander verglichen werden. Aber wirft die Informationen mittels Bildgebung Licht auf die räumliche und zeitliche Organisation der genomischen Marken.
Für genaue Quantifizierung von 5hmC und 5caC Signalen sind Kerne hervorgehoben und umkreist gegen das DAPI Gegenfärbung, klare Abgrenzung der Region analysiert werden. Dieses Verfahren verzichtet auf die Anforderung für die Kalibrierung gating Schwellenwerte wie Hintergrundgeräusche durch den manuellen Prozess der Auswahl von Kernen1außer acht gelassen wird. Eine Automatisierung dieses Prozesses kann in der neuesten Software erfolgen, die für nukleare Segmentierung durchgeführt werden können. Während kostenlose alternative Software-Pakete wie Fidschi sind verfügbar für die NS1 Analyse, Nachteile wie die Anforderung, Bilder in 8 Bit binäre Formate zu konvertieren Interesse Maskierung Bilder und Eingabe Größe Ausschluss Daten wählen Sie Regionen der Begrenzung der Zugänglichkeit für Benutzer dieses Programms. Darüber hinaus stellt in Anbetracht der allgemeinen Ebenen von 5hmC und 5caC in das Genom, zusammen mit ihre vorherrschende Position in euchromatisch Regionen und Erschöpfung der CpG Genomsequenzen im Allgemeinen begrenzt, manuelle rings um Kerne Benutzer-Bias. Daher die Hervorhebung der Kerne automatisch übernimmt alle Ereignisse, die innerhalb der abgegrenzten Region positiv und ignoriert alle Hintergrundpixel, die vorhanden sein können. Analyse von Bildern anhand Pixel Intensität kann daher sinnvoller sein. Diese Faktoren sind wichtig, wenn man die Verwendung von Mander des NS1 Koeffizient, analysieren den Grad der räumlichen Überschneidungen zwischen beiden Signalen, unabhängig von ihrer Signalintensitäten wie Pearson Korrelationskoeffizient gegen die übernimmt eine lineare Beziehung zwischen Signalen.
Insgesamt tragen die hier beschriebenen Techniken das Thema der visuellen Darstellung von biologischen Daten in einem intuitiven Format. Während semi-quantitativen Bildanalyse leistungsstarke Techniken wie Massenspektrometrie im Hinblick auf die Empfindlichkeit oder einheitliche Basis Abwicklung Genom ablösen kann nicht breit Rüst-, es liefert ergänzende Daten erlauben Rückschlüsse und Hypothesen zu aus der Analyse von Bildern mit Präzision konzipiert.

DNA-Methylierung, ein gut dokumentierter Mechanismus verbunden mit transcriptional Regelung bringt Änderung von Cytosin-Rückständen in eine 5'-Cytosin-Phosphat-Guanin-3 "(CpG) Dinucleotide Kontext über die Zugabe einer Methylgruppe (-CH3), 5 - Kohlenstoffatom der Cytosin Pyrimidine Ring 5-Methylcytosine (5mC)1zu bilden. Bei Säugetieren sind etwa 70 % der Verbrauchsgüter methyliert, die nur 1 % von ihrem Genom darstellt, wie sie dieser palindromische Sequenz aufgrund 5mC mutagene Neigung zu deaminate spontan zu Thymin2aufgebraucht sind. Vorhandensein von Methylgruppen auf gen Promotorsequenzen zeigen starke Korrelation mit transcriptional Repression in Wirbeltieren3,4,5. Zugabe von diese Methylgruppen ist katalysiert durch hoch konservierte DNA-Methyltransferase (DNMT) Enzyme DNMT3a, 3 b und 3 L und DNMT1 die CpG Cytosines in de Novo und Wartung Methylierung zusammenhängen bzw. ändern6. DNMT3A/B Ausdruck ist während der Entwicklung in embryonale Stammzellen und Epiblast erhöht; jedoch ist seine verminderte Expression nach pluripotente Zelle Abstammung Engagement für somatische Schicksale während der Differenzierung8beobachtet. Während funktionelle Redundanz zu teilen, display DNMT3a und 3 b gewebespezifischen Expressionsmuster mit 3a einheitlich in Mausembryonen erkannt aber 3 b überwiegend auf Neuroectoderm und Chorion Ektoderm Gewebe8lokalisiert.
Methylierung Signaturen können während der Mitose und Meiose10vererbt werden. Wartung-Methylierung beinhaltet DNMT1 erleichtert Änderung der CpG Cytosin Rückstände im Hemi methyliert Palindrome auf doppelsträngigen DNA-11. DNMT1 bindet DNA bei Replikation Gabeln11 und infolgedessen genomische Methylierung Ebenen Höhepunkt während der S-Phase des Zellzyklus12. DNMT1 methylates unveränderten Cytosines dadurch neu synthetisierten DNA-Stränge zu unterscheiden, X-Chromosom Inaktivierung zu fördern und pflegen transkriptionellen Repression Profile13. Durch Anerkennung der Hemi-methylierte CpG DNA-Sequenzen unterhält DNMT1 etablierte Muster der Methylierung abgegrenzt durch de Novo Methylierung z.B. Unterdrückung von langen durchsetzt Nuclear Element 1 (Linie1) Retrotransposon Promotoren, die potenziell krebserregend Vermehrung14zu hemmen. Obwohl Hemi-methylierte DNA bevorzugte Bindungsaffinität zu besitzen, können DNMT1 unmethylated CpG-Insel (CGI)-Sequenzen in DNMT3a/b - / - Mutantenzellen methylieren ein Notfall de Novo Methylierung Rolle15 . So kann aufgrund der semi-konservative Art der DNA-Replikation16Wartung Methylierung treu Methylierung Unterschriften von übergeordneten Tochterzelle17rekapitulieren.
Allerdings muss für gen Ausdruck dynamisch moduliert, repressiven Methylierung Modifikation ist gelöscht werden, lässt sich von passiven und aktiven Demethylierung Mechanismen18. Die zehn-elf Translocase (TET) Proteine aus einer erhaltenen Familie Dioxygenase Proteine sind in der Lage der iterativen Oxidation von Methylgruppen auf CpG Rückstände19. Diese Tet Proteine, homolog zu J-Base-bindende Proteine (JBP) entdeckt in Trypanosomen Bruceii, erkennen und binden veränderte DNA Basen z.B. 5mC und diese Rückstände, 5-Hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-Formylcytosine (5-Fu) und 5 - Sauerstoff Carboxylcytosine (5caC)20. Tet-Protein erleichtert Oxidation von 5mC führt schrittweise Konformation Wechsel von Methyl, Hydroxyl, Carbonyl und Carboxylat Konfigurationen, aber 5fC und 5caC Änderungen direkt aus 5mC Oxidation21, synthetisiert werden können 22 , 23 , 24.
Informative Angabe der TET Proteinaktivität verstehen ihre Regulierung studiert die Verteilung und die Fülle der Oxi-Methyl-Cytosin-Marken. Erhebliche 5mC Präsenz auf CpG Armen Promotoren ist im Gegensatz zu unmethylated CpG reichen Regionen nachweisbar, letztere Merkmal der CpG Inseln25. Über Gewebe, höchste Gewebe, die spezifische Methylierung in Blut, Gehirn und Hoden beobachtet wird, während der Mundschleimhaut zeigen größte Hypomethylierung zeigt eine differenzielle Methylierung Muster an Gewebe spezifische Promotoren26auftretenden.
Durch Nutzung der sensiblen Anti-5mC und Anti-5hmC demonstriert Antikörper im selektiven Methyl/Hydroxymethyl DNA Immunopräzipitation (MeDIP/HmeDIP) und anschließende Hochdurchsatz-Sequenzierung, Ficz Et Al. hohe 5hmC Belegung an Projektträger, Exons und LINE-1 Retrotransposon Sequenzen die korreliert mit reduzierten 5mC Ebenen an diesen Standorten im embryonalen Maus Stammzellen Zellen27. Umgekehrt beobachtet wo war 5hmC Anwesenheit begrenzt28größten 5mC Bereicherung bei sich wiederholenden Sat-Sequenzen. Studien an menschlichen Frontallappen Hirngewebe zeigen hochsignifikante 5hmC Bereicherung, Vierfache höher als bei Maus embryonale Stammzellen28. In Übereinstimmung mit früheren Beobachtungen lokalisiert Hochdurchsatz-Sequenzierung der Frontallappen Gewebe illustriert Mehrheit 55-59 % des 5hmC-Signals bei geringer Dichte CpG Förderer Regionen, 35-38 % innerhalb von gen stellen und ca. 6 % Auslastung bei intergenetischer Regionen. Im Gegensatz dazu 5mC war bei intergenetischer Regionen (25-26 %) und höher in gen Gremien (52-55 %) bereichert, sondern reduzierte (22-24 %) beim Projektträger Sequenzen29. Diese Studien zeigen Fülle von 5hmC in embryonalen Stammzellen und somatischen Gewebe, insbesondere das Gehirn, aber Untersuchungen auf 5fC und 5caC Distributionen begrenzt sind.
Interessant ist, vor kurzem entdeckt in den Eukaryotes, Methylierung von Adenin Rückstände auf der Position 6 Stickstoff (N-6) (6mA) Display eine genomische Fülle Profil invers zu derjenigen 5mC30. Beobachtungen von Flüssigkeitschromatographie gekoppelt-Tandem-Massenspektrometrie zeigen 6mA absoluten Niveaus im Übermaß im Zebrafisch und Schweinen frühen Embryo im Vergleich zu den Samenzellen mit seinen Ebenen (0,003 % der genomischen Adenines) bestehen bei der Befruchtung, stetig Höchststand von Morula Entwicklungsstadium (33 Fach höher als Spermien) und somatische Ausmaße Steady-State von 0,004 % der genomischen Adenines31. Immunopräzipitation 6mA bereichert DNA-Sequenzen hat vorherrschende Belegung (ca. 80 % Anreicherung) von dieser Marke auf sich wiederholende Element Regionen und transkriptionelle Start Seiten32gezeigt. Diese Beobachtungen zu kontextualisieren und validieren die Entdeckung der 6mA Demethylase-Null eMbryonic Stammzellen ausstellenden angesammelten 6mA vermittelt transcriptionally aktiven Elemente in Wildtyp-Zellen gegenüber LINE-1 Retrotransposon zum Schweigen zu bringen. Diese Daten schlagen eine transcriptional regulierende Funktion für 6mA33.
Während konjugierten Biochemische Tags gekoppelt an nachfolgende DIP-Assays Vorhandensein oder Fehlen von oxidierten Methylcytosine Derivate (Oxi-mCs) angeben, können nicht sie räumliche Verteilung oder quantifizierbare Informationen von diesen Marken34, vermitteln. 35. ein Protokoll für sensible immunchemische Nachweis von 5hmC und 5caC wurde vor kurzem entwickelten36. Diese Fluorophor konjugiert sekundäre Antikörper-basierten Immunostaining Methode gepaart mit Verwendung von Scan konfokale Lasermikroskopie besitzt den einzigartigen Vorteil, dass visuelle Lokalisierung dieser DNA-Modifikationen innerhalb der Zellen, so, Betonung einzelner positiv oder negativ gefärbt Zellen entsprechend der heterogenen Präsenz dieser Marken. Die 5hmC und 5caC absolute Signalintensitäten aktivieren, da durch die konjugierten Antikörper verstärkt semi-quantitative Interpretationen über das Ausmaß und die Positionen dieser Marken innerhalb des Zellkerns z.B. heterochromatischen und euchromatisch Regionen vorgeschlagen werden 37 , 38. hier eine Technik für die computergestützte Analyse der konfokalen Mikroskopie-Bildern beschrieben. Die Generation der räumlichen Verteilung 2.5D Grundstücke für die Anzeige von verschiedenen 5hmC und 5caC Signalspitzen pro Pixel und deren Standorte innerhalb Kerne zeigt. Histogramm Grundstücke von 5hmC und 5caC Signal Intensität Profile zeigen Trends in Hülle und Fülle dieser Marken als die Gipfel und Tröge sind als separate nicht überlappende Kanäle dargestellt. Schließlich durch die Implementierung der Kolokalisierung-Funktion, der Grad der Nähe eines Signals ermittelt werden und als Folge davon, ihre jeweiligen genomischen Koordinaten identifiziert werden können.

<table><tbody><tr><td>Zeiss Elyra PS1. Superauflösendes Mikroskop mit konfokalem Kopf LSM780</td><td>Zeiss</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Zen Black 2012</td><td>Zeiss</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Zen Blue 2012</td><td>Zeiss</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

immunostaining für dna-modifikationen: computergestützte analyse der konfokalen bilder

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

Seit mehreren Jahrzehnten hat 5-Methylcytosine (5mC) gedacht worden, um die einzige DNA-Modifikation mit einem funktionalen Bedeutung in Metazoen werden. Die Entdeckung der enzymatischen Oxidation von 5mC, 5-Hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-Formylcytosine (5-Fu) und 5-Carboxylcytosine (5caC) sowie die Erkennung von N6-Methyladenine (6mA) in der DNA von mehrzelligen Lebewesen zur Verfügung gestellt zusätzliche Freiheitsgrade Komplexität der epigenetischen Forschung. Nach eine wachsende Zahl von experimentellen Beweis können diese neuartige DNA-Modifikationen bestimmte Rollen in verschiedenen zellulären und Entwicklungs-Prozessen spielen. Wichtiger ist, als einige dieser Marken (e. g. 5hmC, 5fC und 5caC) Ausstellung Gewebe- und Entwicklungsstörungen Bühne-spezifische auftreten bei Wirbeltieren, stellt Immunchemie ein wichtiges Instrument, die Beurteilung der räumlichen Verteilung der DNA-Veränderungen in verschiedenen biologischen zusammenhängen. Hier sind die Methoden für computergestützte Analyse von DNA-Veränderungen visualisiert durch Immunostaining gefolgt von konfokalen Mikroskopie beschrieben. Insbesondere die Generation 2.5 Dimension (2,5 D) signal Intensität Grundstücke, signalisieren, dass Intensität Profile, Quantifizierung der Färbung Intensität in mehreren Zellen und Bestimmung des Signal NS1 Koeffizienten angezeigt werden. Gemeinsam können diese Techniken bei der Bewertung der Ebenen und Lokalisierung dieser Modifikationen der DNA im Zellkern, einen Beitrag zur Aufklärung ihre biologische Rolle bei Metazoen einsatzfähig sein.

Um festzustellen, die räumliche Verteilung der 5hmC und 5caC bei der Unterscheidung von hepatischen Stammväter Immunostained Folien für diese DNA-Modifikationen wurden abgebildet unter Verwendung eines Mikroskops.
Erste Analyse der räumlichen Verteilung dieser Oxi-MCS erfolgte durch die Generierung von 2.5D Intensität Grundstücke (Abb. 1A, 1 b). Die roten und grünen Gipfel schien gut definiert mit der geringen Präsenz von orange Spitzen Angabe nur eine kleine Überlappung der 5caC und 5hmC Signale. Im Einvernehmen mit diesen Ergebnissen übereinstimmen die Profile für 5hmC und 5caC Intensitäten in der entsprechenden Zelle nicht stark mit einander (Abbildung 1). Dies zeigt, dass 5caC und 5hmC unterschiedliche Muster der nuklearen Verbreitung in hepatischen Stammväter weisen, was darauf hindeutet, dass Tet-abhängige Oxidation von 5mC führt zur Erzeugung von verschiedenen oxidierten Derivate dieser DNA-Modifikation in bestimmten chromatin Regionen.
Um das Maß an 5caC und 5hmC in Daoy Medulloblastom und BXD-1425EPN Ependymoma Zellen zu vergleichen, wurde Immunostaining für diese Oxi-mCs auf beide Proben unter identischen Versuchsbedingungen durchgeführt. Intensitäten von 5caC und 5hmC Signale wurden dann in 20 Profile generiert über 3-5 Zellen aufgezeichnet für jede Zelllinie verglichen (Abbildung 2A-2D). Die Quantifizierung der Ergebnisse ergab, dass BXD-1425EPN Zellen signifikant niedrigere Werte von 5hmC und 5caC Immunostaining im Vergleich zu Daoy Zellen (Abb. 2D) aufweisen.
In Anbetracht der beiden Kanäle rot (5hmC) und grün (5caC), kann bezeichnet werden als f und G bzw. der Pearson-Korrelationskoeffizient (PCC) beschreibt den Grad der räumlichen Überschneidungen und Co Trennung von R &amp; G, vorausgesetzt, beide Marken existieren in einer linearen Beziehung zu einander, durch R Statistik34bezeichnet. Quadratur den PCC-Wert gekennzeichnet durch R2 ermöglicht die Messung von grünes Signal Intensität Variation der durch rotes Signal Intensität34beeinflusst wird. Dies ist für unsere 5caC Vs 5hmC Co Lokalisierung Analyse überflüssig.
Um die räumliche Verteilung der 5caC und 5hmC in undifferenzierten (Undiff) HiPSCs und hepatische Entoderm 24 Stunden (HE24) nach Induktion zu untersuchen, wurde NS1 Analyse dieser DNA-Modifikationen auf die gleichen konfokale Bilder mit R-Werte für 20 durchgeführt Kerne analysiert für jede Zelllinie (Abb. 3A-3 C).
Die Quantifizierung dieser Ergebnisse gezeigt, dass Grad der NS1 deutlich höher ist (P &lt; 0,05) in HE24 im Vergleich zu Undiff (Abb. 3 c). Dies kann auf die reduzierte Größe der 5caC Präsenz und damit seine verringerte Signalintensität in Undiff Zellen zurückzuführen sein.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56318/56318fig1.jpg"> 
Abbildung 1: immunhistochemische Färbung der hepatischen Entoderm Stammväter auf 72 Stunden Post Induktion der Differenzierung. (A) Co Färbung des 5hmC (rot), 5caC (grün) und DAPI nuklearen Zähler Fleck (blau). Der weiße gestrichelte Pfeil "B" bezeichnet die Richtung des profiling Stichprobe durch den Zellkern, in 1 Cdargestellt. Maßstabsbalken entspricht 5 µm. Rot-Kanal: gain-800, laser-1 %. Grün-Kanal: gain-750, laser-2,4 %. DAPI-Kanal: gain-750, laser-2,6 %. (B) 2.5D Intensität Grundstück von 5hmC, 5caC und DAPI-Signale. Einzelne Spitzen stellen absolute Signalintensitäten der einzelnen Pixel. Zusammengeführte Ansichten und einzelne Kanäle werden angezeigt. (C) die Intensität Profile von 5hmC, 5caC und DAPI-Signale in hepatischen Stammväter auf 72 Stunden Post Induktion der Differenzierung. Peak-Intensitäten entlang der Dimensionen der weiße gestrichelte Pfeil "B" aufgenommen wurden und werden durch einen schwarzen gestrichelten Pfeil entlang der x-Achse Intensität Profil angegeben. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56318/56318fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56318/56318fig2.jpg"> 
Abbildung 2: Analyse der 5hmC und 5caC signal Intensitäten in Daoy Medulloblastom und Zelllinien BXD-1425EPN Ependymoma. (A) Immunofluorescent Färbung des 5hmC (rot) und 5caC (grün) in Daoy und BXD-1425EPN Zellen. Die Bilder wurden mit 63 x Öl Immersion Objektiv, beide mit den gleichen Einstellungen aufgenommen. Zusammengeführte Ansichten und einzelne Kanäle werden angezeigt. Maßstabsleisten repräsentieren 10 µm. Rot-Kanal: gain-746, laser-1 %. Grün-Kanal: gain-750, laser-2,4 %. (B) Daoy und (C) BXD-1425EPN Einzelzellen werden in benachbarten Zahlen erweitert. Skalieren Sie Bars für (B) und (C) stellen 5 µm. (D) mittlere Fluoreszenzintensität 5hmC Vs 5caC Signale in Daoy und BXD-1425EPN Zellen (n = 20, SD). Bedeutung wurde anhand eines F-Tests und zwei Stichproben t-Test Sternchen bezeichnen statistisch signifikante p-Werten von ** p &lt; 0,01 und *** p &lt; 0,001. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56318/56318fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56318/56318fig3.jpg"> 
Abbildung 3: NS1 Analyse von 5hmC und 5caC absolute Signalen in undifferenzierten HiPSCs (Undiff) im Vergleich zur hepatischen Entoderm 24 Stunden Post-differenzierte Vorläuferzellen (HE24). Bilder der konfokalen Mikroskopie (A) undifferenzierten HiPSCs und (B) HE24 Zellen für 5hmC (rot), 5caC (grün) und DAPI (blau) gefärbt. Zellen wurden mit 63 X Öl Immersion Objektiv bei identischen Einstellungen abgebildet. 20 Eingekreistes Kerne zeigen die Zellen für die NS1 Analyse abgetastet. Maßstabsleisten repräsentieren 20 µm. Rot-Kanal: gain-800, laser-1 %. Grün-Kanal: gain-750, laser-2,4 %. DAPI-Kanal: gain-750, laser-2,6 %. (C) Kolokalisierung Analyse der Präsenz des 5caC-Signals im Bereich der 5hmC Nähe in Undiff und HE24 (n = 20, SD). Bedeutung wurde anhand eines F-Tests und zwei Stichproben t-Test Sternchen bezeichnen statistisch signifikante p-Werten von * p &lt; 0,05. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56318/56318fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

Neu entdeckte oxidierte Formen von 5-Methylcytosine (Oxi-mCs), 5-Hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-Formylcytosine (5-Fu) und 5-Carboxylcytosine (5caC) kann verschiedene DNA-Modifikationen mit einzigartigen funktionellen Rollen vertreten. Hier ist ein semi-quantitative Workflow zur Visualisierung der räumlichen Verteilung Oxi-mCs, Signal Intensität Profilierung und NS1 beschrieben.

Immunostaining für DNA-Modifikationen: computergestützte Analyse der konfokalen Bilder

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

Das übergeordnete Ziel dieser Technik ist es, ein computergestütztes Werkzeug zur Bewertung der räumlichen Verteilung und Signalintensität von DNA-Modifikationen bereitzustellen, die durch Immunfärbung innerhalb von Zellkernen sichtbar gemacht werden. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Epigenetik zu beantworten, indem sie die Untersuchung der Kernlokalisation und des relativen Ausmaßes von DNA-Modifikationen in verschiedenen Modellsystemen ermöglicht. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die DNA-Modifikationen durch die Größe des Bot-Signals und dann durch die Verteilung gemessen werden.Eine der Implikationen dieser Technik besteht darin, dass sie unser Verständnis potenzieller funktioneller Reihen von DNA-Modifikationen in verschiedenen biologischen Systemen erleichtert. Diese Technik bietet auch die zusätzliche Anwendung der computergestützten Analyse anderer Epitope, die durch Immunhistochemie nachweisbar sind. Öffnen Sie zunächst die LSM-formatierten Dateien des konfokalen Mikroskopiebildes.Wählen Sie Bildverarbeitung und dann das gewünschte Bild für die Analyse aus. Beachten Sie, dass beim Vergleich von Intensitätsprofilen zwischen Proben die Laserleistung und die Verstärkung konsistent sein müssen, um direkte Vergleiche anstellen zu können. Klicken Sie anschließend auf Alle anzeigen, um alle grafischen Steuerelemente sichtbar zu machen, wählen Sie dann die Registerkarte Grafiken und wählen Sie das Rechteckwerkzeug, um einen Bereich auszuwählen, der die interessierenden Kerne enthält.Verwenden Sie dann den Befehl Bereich ausschneiden, um den gewünschten Bereich zu isolieren. Speichern Sie nun das Bild unter einem neuen Namen und entweder einem LSM- oder CZI-Format und öffnen Sie die Datei erneut in der Zen Blue-Software. Öffnen Sie den ZEN-Schreibtisch in Zen Blue und verwenden Sie dann den Befehl "An ZEN senden" in Zen Black, um die Datei in Zen Blue zu öffnen.Aktivieren Sie als Nächstes die Registerkarte mit der Bezeichnung 2.5d, um die Visualisierung des Bildes in 2.5d zu aktivieren. Klicken Sie auf Alle anzeigen, um alle grafischen Steuerelemente sichtbar zu machen und die Einstellungen mithilfe der vier grauen Balken zu ändern. Die Balken steuern den Zoom, die Drehung, die Neigung der Achse sowie die Ausdehnung und Verkleinerung der Maßstabsleisten.Wählen Sie den Rendermodus aus, um die einzelnen Gipfel am besten zu visualisieren, und ändern Sie dann die große Entfernung, indem Sie den Prozentsatz ändern. Je niedriger der Prozentsatz, desto definierter ist jeder einzelne Peak. Bevor Sie nun das 2.5d-Bild speichern, blenden Sie die Dateiliste und die grafischen Werkzeuge aus, indem Sie auf den grauen Pfeil unter dem 2.5d-Plot klicken.Speichern Sie dann den Plot als Screenshot, indem Sie die Drucktaste auf der Tastatur verwenden. Öffnen Sie die Bildverarbeitungsoption in der Software und öffnen Sie die gewünschte Datei. Wählen Sie als Nächstes die Registerkarte Profil und dann die Registerkarte Alle anzeigen aus, um auf alle Formatierungsoptionen zuzugreifen.Wählen Sie auf der Registerkarte Profil die Option Tabelle und die Pfeilschaltfläche aus. Wählen Sie nun mit der Maus einen Startpunkt aus und ziehen Sie eine Linie über eine fortlaufende Anzahl von Zellen. Ein Intensitätsdiagramm für die Zellen entlang dieser Linie wird dann zusammen mit der Tabelle der Intensitätsmessungen erstellt. Beachten Sie, dass in der Tabelle auch der Abstand angegeben ist, in dem die Pixelintensität für die rote, grüne und blaue Fluoreszenz rot ist.Die Einheit ist Mikrometer. Um diese Daten zu exportieren, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Tabelle, wählen Sie Tabelle speichern und speichern Sie sie als Textdatei. Um das Intensitätsprofil zu speichern, wählen Sie die Option "Exportieren" und schalten Sie im Popup-Fenster zwischen zwei Optionen um: getaggte Bilddatei, Format und Inhalt des Bildfensters, Einzelfenster, Daten.Befolgen Sie dann die Anweisungen, um die Datei zu speichern. Wiederholen Sie diesen Vorgang nun für jedes benötigte Intensitätsprofil. Wählen Sie in der Software Bildverarbeitung und wählen Sie die gewünschte Bilddatei aus.Wählen Sie dann die Registerkarte coloc für Co-Lokalisierungsanalyse aus, und wählen Sie Alle anzeigen aus, um auf alle Formatierungsoptionen zuzugreifen. Wählen Sie auf den vier Registerkarten in der unteren Hälfte des Bildschirms die Option Co-Lokalisierung und wählen Sie die Tabellen- und Bildoptionen aus. Wählen Sie dann das dritte Symbol oben auf der Registerkarte, gekennzeichnet durch den Popup-Text geschlossen besier.Verwenden Sie dieses Werkzeug, um einen einzelnen Kern einzukreisen. Die Werte werden dann in der Tabelle angezeigt, und es wird ein Streudiagramm für rote und grüne Fluoreszenz erstellt. Die Achse dieses Diagramms ist verschiebbar und steuert das Gating der Detektion.Alle Pixelintensitäten innerhalb des Zellkerns sollten als positive Signale betrachtet werden. Da das Ausmaß der DNA-Modifikationen im Zellkern variiert, nehmen wir zur Berücksichtigung schwacher Signale kein Gate für die Daten vor. Wir sollten hier betonen, dass es umstritten ist, ob die Hintergrundwerte in die Analyse einbezogen werden sollten.Wichtig ist, dass der Überlappungskoeffizient unabhängig von den Unterschieden in der Signalintensität zwischen den beiden Kanälen ist. Während der Personenkorrelationskoeffizient von einer linearen Beziehung zwischen den Signalen ausgeht. Wiederholen Sie nun diesen Vorgang des Umkreisens von Kernen, um den Datensatz zu vervollständigen.Um die Daten zu exportieren, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Tabelle und folgen Sie den Optionen zum Speichern der Daten. Um ein Co-Lokalisierungsbild zu speichern, verwenden Sie den Exportbefehl mit den beiden Optionen, getaggte Bilddatei, Format und Inhalt des Bildfensters mit einem Fenster, Daten, und folgen Sie dann den Optionen zum Speichern der Datei. Die räumliche Verteilung von zwei oxidierten Desirativen von fünf Methylcytosin wurde bei der Differenzierung haphadischer Vorläuferzellen unter Verwendung des beschriebenen Protokolls untersucht.Rote und grüne Signale stehen für die beiden unterschiedlichen DNA-Modifikationen. Die Signale sind gut definiert und überlappen sich nur wenig. Erwartungsgemäß stimmen die Profile der beiden Signalintensitäten und der entsprechenden Zelle nicht stark überein.Das unterschiedliche Muster deutet darauf hin, dass die tap-abhängige Oxidation von fünf Methylcytosin unterschiedliche oxidierte Derivate in spezifischen Chromatinbereichen erzeugen kann. Ein ähnlicher Vergleich der beiden DNA-Modifikationen wurde in Daoy-Medulloblastomzellen und in BXD-Ependymomzellen durchgeführt. Beide Zelllinien stammen von pädiatrischen Hirntumoren.Die Quantifizierung zeigt, dass BXD-Zellen im Vergleich zu Daoy-Zellen signifikant geringere Spiegel beider Signale aufweisen. Als nächstes wurde die Co-Lokalisierung der oxidierten Derivate von 5MC in undifferenzierten hiPSCs untersucht. 24 Stunden nach Induktion der hepatischen Endodermdifferenzierung und hiPSCs.In dieser Analyse veränderte sich die Signalkolokalisation signifikant mit der Induktion der Differenzierung, was möglicherweise auf eine reduzierte Größe von fünf CAC in den undifferenzierten Zellen zurückzuführen ist. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie 2,5D-Intensitätsdiagramme und -profile erstellen und wie Sie Co-Lokalisierungsdaten erstellen. Die hier beschriebenen Bildanalyse- und Visualisierungswerkzeuge tragen zur epigenetischen Forschung bei und bieten eine relativ schnelle Möglichkeit, Signale der verschiedenen DNA-Modifikationen in verschiedenen Versuchsgruppen zu vergleichen.Einmal gemeistert, kann diese Technik in etwa einer Stunde durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Es ist wichtig, eine Überbelichtung zu vermeiden und während der Mikroskopie die gleichen Einstellungen für verschiedene Versuchsgruppen zu verwenden. Luftblasen in der Halterung und unzureichendes Eintauchen können zu lokalem Fluoreszenzverlust führen, daher ist eine visuelle Inspektion des Scanbereichs von entscheidender Bedeutung.Das Verfahren kann weiter automatisiert werden, indem die Zellkerne segmentiert und interessante Regionen mit Zen Blue erstellt werden. Diese Regionen können in Zen Black importiert werden, um eine Co-Lokalisierungsanalyse an mehreren Kernen durchzuführen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur gleichzeitigen Detektion von Histonmodifikationen durch Immunfluoreszenz und DNA-Sequenzen von DNA-FISH durch 3D-Mikroskopie und-Analysen (3D Immuno-DNA FISH) gefolgt.

Kombiniert Immunfluoreszenz und DNA FISH auf 3D erhaltene Interphase Nuclei, um Änderungen in 3D Nuclear Organization Study

Elektronenspektroskopische Bildgebung kann Nukleinsäuren und Proteine mit Nanometerauflösung abbilden und unterscheiden. Es kann mit dem miniSOG-System kombiniert werden, das in der Lage ist, markierte Proteine in Transmissionselektronenmikroskopie-Proben spezifisch zu markieren. Den Einsatz dieser Technologien veranschaulichen wir am Beispiel von Doppelstrangbruch-Reparaturschwerpunkten.

Visualisierung von miniSOG Tagged DNA Reparaturproteine ​​in Kombination mit Electron spektroskopischen Bildgebung (ESI)

Laser Microirradiation ist ein nützliches Werkzeug für Studien zur DNA-Reparatur in lebenden Zellen. Ein methodischer Ansatz für die Nutzung der UVA Laser induzieren verschiedene DNA-Läsionen wird angezeigt. Wir haben eine Methode zur lokalen Microirradiation optimiert, die den normalen Zellzyklus unterhält; so fahren Sie bestrahlte Zellen durch Mitose.

Fortgeschrittene Mikroskopiertechniken der konfokalen zur Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen und die Kinetik bei DNA-Läsionen

Reparatur von Doppel-Strang DNA-Brüchen ist ein dynamischer Prozess, erfordern nicht nur Bildung von Reparatur-komplexen in den Pausen, sondern auch deren Auflösung nach die Läsion gerichtet ist. Hier verwenden wir Immunfluoreszenz-Mikroskopie für vorübergehende und dauerhafte Doppelstrang-Brüche als Werkzeug dieses Genom-Wartung-Mechanismus zu sezieren.

Charakterisierung von DNA-Reparaturprozesse bei Transienten und langlebige Doppel-Strang DNA-Brüchen durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie

Die strahlungsinduzierte DNA-Schadensreaktion, die durch Neutronen-Mischstrahl aktiviert wird, das in der Bor-Neutronen-Capture-Therapie (BNCT) verwendet wird, ist nicht vollständig etabliert. Dieses Protokoll bietet ein schrittweises Verfahren zum Nachweis von strahlungsinduzierten Brennpunkten (RIF) von Reparaturproteinen durch Immunfluoreszenzfärbung in menschlichen Darmkrebszelllinien nach Bestrahlung mit dem Neutronenmischstrahl.

Immunfluoreszenz Bildgebung von DNA-Schäden und Reparatur-Fozien in menschlichen Darmkrebszellen

Nach DNA-Schäden aktivieren menschliche Zellen wichtige Reparaturwege, um die Integrität ihres Genoms wiederherzustellen. Hier beschreiben wir die Methode der indirekten Immunfluoreszenz als Mittel, um DNA-Reparaturproteine zu erkennen, ihre räumliche und zeitliche Rekrutierung zu analysieren und die Protein-Protein-Interaktion an den Stellen von DNA-Schäden zu begutachten.

Visualisierung der DNA-Reparaturproteine Interaktion durch Immunfluoreszenz

Im vorliegenden Protokoll demonstrieren wir, wie die DNA-Doppelstrang-Endsektion während der S/G2-Phase des Zellzyklus mit einer immunfluoreszenzbasierten Methode visualisiert werden kann.

Bewertung der globalen DNA-Doppelstrang-Endsektion mittels BrdU-DNA-Markierung in Verbindung mit Cell Cycle Discrimination Imaging

Das vorliegende Protokoll beschreibt Methoden zur Bewertung von DNA-Schadensreparaturproteinen in von Patientinnen stammenden Ovarialkarzinom-Organoiden. Dazu gehören umfassende Plattierungs- und Färbemethoden sowie detaillierte, objektive Quantifizierungsverfahren.

Visualisierung von Proteinen zur Reparatur von DNA-Schäden in patienteneigenen Ovarialkarzinom-Organoiden mittels Immunfluoreszenz-Assays

Das vorliegende Protokoll zeigt eine modifizierte Methode zum Nachweis und zur Quantifizierung von DNA-Protein-Crosslinks (DPCs) und deren posttranslationalen Modifikationen (PTMs), einschließlich Ubiquitylierung, SUMOylierung und ADP-Ribosylierung, die durch Topoisomerase-Inhibitoren und Formaldehyd induziert werden, wodurch die Bildung und Reparatur von DPCs und ihren PTMs untersucht werden kann.

Quantitativer Nachweis von DNA-Protein-Vernetzungen und deren posttranslationale Modifikationen

Die Aufrechterhaltung der Integrität des Eizellgenoms ist notwendig, um die genetische Genauigkeit des resultierenden Embryos zu gewährleisten. Hier stellen wir ein genaues Protokoll zum Nachweis von DNA-Doppelstrangbrüchen in weiblichen Keimzellen von Säugetieren vor.

Nachweis von DNA-Doppelstrangbrüchen in Maus-Eizellen

Diese Methode beschreibt ein Immunfluoreszenzprotokoll und eine Quantifizierungspipeline zur Bewertung der Proteinverteilung mit unterschiedlichen Kernorganisationsmustern in humanen T-Lymphozyten. Dieses Protokoll bietet eine Schritt-für-Schritt-Anleitung, beginnend bei der Probenvorbereitung über die Durchführung halbautomatischer Analysen in Fidschi bis hin zur Datenverarbeitung durch ein Google Colab-Notebook.

Eine vielseitige Pipeline für die Analyse dynamischer Veränderungen in Kernkörpern in einer Vielzahl von Zelltypen

Lernen Sie eine computergestützte Methode zur Analyse räumlicher Verteilung und Signalintensität von DNA-Modifikationen in Zellkernen mittels Immunfärbung und konfokaler Mikroskopie.

Immunostaining für DNA-Modifikationen: computergestützte Analyse der konfokalen Bilder

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