Generation von einem Gen gestört Streptococcus Mutans Belastung ohne Gene Klonen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Generierung gezielter gendisruptierter Streptococcus mutans-Stämme unter Verwendung einer zweistufigen Fusions-PCR und Elektroporation. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Mikrobiologie zu beantworten, z. B. wie ein Gen von Interesse funktioniert. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass keine andere enzymatische Reaktion als PCR erforderlich ist und eine kompetente Zellvorbereitung für die Elektroporation recht einfach ist. Obwohl diese Methode einen Einblick in die Technik der Genstörung von Streptococcus mutans geben kann, kann sie auch auf andere mikrobielle Spezies wie Staphylococcus aureus angewendet werden. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da sie mit der Wirksamkeit von verschachtelten Primern für die zweite PCR nicht vertraut sind. Das Verfahren wird von Dr. Ayako Okada, einer Forschungsleiterin aus unserem Labor, vorgeführt. Um dieses Verfahren zu beginnen, streichen Sie S.mutans UA159 auf eine Gehirn-Herz-Infusions- oder BHI-Agar-Platte und inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 37 Grad Celsius unter anaeroben Bedingungen. Am nächsten Tag verwenden Sie einen sterilisierten Zahnstocher, um eine einzelne Kolonie zu pflücken und sie in fünf Milliliter BHI-Brühe zu impfen. Inkubieren Sie die S.mutans-Kultur über Nacht bei 37 Grad Celsius unter anaeroben Bedingungen. Als nächstes zentrifugieren Sie die Kultur bei 2000 mal G für 15 Minuten. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in fünf Millilitern PBS. Erneut bei 2000 mal G für 15 Minuten zentrifugieren. Resuspendieren Sie das resultierende Zellpellet in 200 Mikrolitern PBS. Extrahieren Sie genomische DNA aus der Suspension mit einem auf Bead-Beating basierenden genomischen DNA-Extraktionskit. Geben Sie zunächst die Zellsuspension in ein zwei Milliliter fassendes Probenröhrchen mit Glasperlen. Geben Sie dann 750 Mikroliter Lyselösung in die Zellsuspension. Verschließen Sie die Röhrchen fest und legen Sie sie symmetrisch in den Röhrchenhalter der Raupenschlagvorrichtung. Fünf Minuten lang mit maximaler Geschwindigkeit verarbeiten. Die mit Perlen geschlagenen Proben werden eine Minute lang bei 10.000 G zentrifugiert. Der Überstand wird in ein Zwei-Milliliter-Sammelröhrchen in eine Spin-Säule überführt und eine Minute lang bei 7000-fachem G zentrifugiert. Geben Sie 1200 Mikroliter DNA-Bindungspuffer in das Filtrat und geben Sie 800 Mikroliter des Gemisches in einem Zwei-Milliliter-Sammelröhrchen in die Spin-Säule. Eine Minute lang bei 10.000 mal G zentrifugieren. Verwerfen Sie den Durchfluss. Geben Sie 200 Mikroliter Vorwaschpuffer in die Schleudersäule, um die Säulenmatrix zu waschen und eine Minute lang mit 10.000 G zu zentrifugieren. Entsorgen Sie den Durchfluss, geben Sie 500 Mikroliter Waschpuffer in die Schleudersäule, um die Säulenmatrix zu waschen, und zentrifugieren Sie erneut. Setzen Sie jede Spin-Säule in ein neues 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen ein und geben Sie 100 Mikroliter Elutionspuffer in die Säulenmatrix. Zentrifugen bei 10.000 G für 30 Sekunden, um die genomische DNA zu eluieren. Schätzen Sie die DNA-Konzentration und -Reinheit, indem Sie die Extinktion bei 260 Nanometern und 280 Nanometern mit einem Spektralphotometer messen. Die erste PCR wird unter Verwendung des Wildtyp-Genoms von S.mutans und des synthetischen Streptomycin-Resistenzgens als PCR-Templates durchgeführt. Drei Sätze von Primern werden verwendet, um jeweils die stromaufwärts flankierende Region des Glykosyltransferase C- oder gtfC-Gens, die stromabwärts flankierende Region des gtfC-Gens und das Spectinomycin-Resistenzgen zu amplifizieren. Fraktionieren Sie jedes PCR-Produkt auf einem 1%Agarose-Gel. Die Größe jedes Produkts aus der ersten PCR sollte ungefähr ein KB betragen. Verwenden Sie einen Gelbandschneider, um die entsprechenden Banden herauszuschneiden und jedes amplifizierte DNA-Produkt zu reinigen, wie im Textprotokoll beschrieben. Der nächste Schritt besteht darin, die drei ungefähr gleichen molaren Fragmente als PCR-Templates zu verwenden, um die zweite PCR durchzuführen. Diese Fragmente werden amplifiziert und mit geeigneten Primern gespleißt, um das Disruptorkonstrukt herzustellen. Da der Erfolg dieses Verfahrens von der Amplifikation des Störungskonstrukts durch eine zweite PCR abhängt, ist es wichtig, das zweite PCR-Produkt durch Elektrophorese zu bestätigen. Laden Sie 1/10 des PCR-Reaktionsgemisches auf ein 0,8%Agarose-Gel, um zu bestätigen, dass das erzeugte Amplikon die vorhergesagte Bandengröße aufweist. In diesem Beispiel ergaben verschachtelte Primer eine viel bessere Verstärkung. Füllen Sie das restliche PCR-Gemisch in ein neues 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und fügen Sie 55 Mikroliter Reinstwasser hinzu, um das Gesamtvolumen auf 100 Mikroliter einzustellen. Fügen Sie 1/10 Volumen von drei molaren Natriumacetat mit einem pH-Wert von 5,2 hinzu, gefolgt von 2,5 Volumenprozent 100%igem Ethanol und mischen Sie.30 Minuten lang bei minus 80 Grad Celsius einfrieren. Zentrifugieren Sie bei 15.000 mal G bei vier Grad Celsius für 20 Minuten. Wenn die Zentrifugation abgeschlossen ist, prüfen Sie, ob sich das Pellet am Boden des Röhrchens befindet. Entsorgen Sie den Überstand. Waschen Sie das Pellet mit einem Milliliter 70%igem Ethanol und zentrifugieren Sie es fünf Minuten lang bei 15.000 Mal G bei vier Grad Celsius. Entsorgen Sie den Überstand und trocknen Sie das Pellet etwa 30 Minuten lang an der Luft. Zum Schluss lösen Sie das Pellet mit 10 Mikrolitern Reinstwasser auf. Kompetente S.mutans UA159-Zellen wurden zuvor als 50 Mikroliter Aliquote bei minus 80 Grad Celsius hergestellt und gelagert. Mischen Sie jeweils 50 Mikroliter Aliquot eiskalter kompetenter Zellen mit fünf Mikrolitern des Disruptionskonstrukts. Geben Sie die Mischung in Elektroporationsküvetten mit einem Abstand von 0,2 Zentimetern zwischen den Elektroden. Führen Sie die Elektroporation mit dem Staphylococcus aureus-Modus des Elektroporationsgeräts durch. Unmittelbar nach der Elektroporation suspendieren Sie die Zellen in 500 Mikrolitern BHI-Bouillon und geben Sie 50 Mikroliter der Suspension auf spectinomycinhaltige BHI-Agarplatten. Inkubieren Sie die Platten zwei bis sechs Tage lang bei 37