Name: Generation von einem Gen gestört Streptococcus Mutans Belastung ohne Gene Klonen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: Lernen Sie eine schnelle Methode zur Erzeugung von gendeletierten Streptococcus mutans-Stämmen mittels zweistufiger Fusions-PCR und Elektroporation. Diese kostengünstige Technik erleichtert genetische Studien in der Mikrobiologie.

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Diese Arbeit wurde von der Japan Society zur Förderung der Wissenschaften [Grant-Nummern 16 K 15860, T.M und 15 K 15777 N.H] unterstützt.

1. besser gekleideteres Design <ol><li>Primer für 2-stufige Fusion PCR und Überprüfung der gen Störung vorzubereiten. 
	Hinweis: Die Tabelle 1 zeigt der Primer-Sequenzen, die in diesem Protokoll verwendeten. Abbildung 1 zeigt eine schematische Darstellung der 2-stufigen Fusion PCR Methode zur Erzeugung von S. Mutans Δ GtfC.
	<ol><li>Design Primer für den Ersatz der Zielregion im Genom mit Spectinomycin-Resistenz-Gen (Spc R) 7. Dieses Protokoll ersetzt die gesamte kodierende Region des Gens GtfC mit Spc R.</li>
		<li>Gehören Komplementär zu den oberen und unteren Enden der Spc R 15 Stützpunkte an der 5 &#39; Regionen des Up-Reverse und Down-Forward Primer, beziehungsweise. Einfügen, ergänzen das untere Ende der vorgelagerten flankierenden Regionen GtfC und das obere Ende der nachgeschalteten flankierenden Regionen GtfC 15 Stützpunkte an der 5 &#39; Regionen des Spc R-vorwärts und Spc r -Primer, bzw. rückgängig zu machen ( Abbildung 1A). 
		Hinweis: Sequenzen von Up-Reverse, Down-Forward, Spc R - vorwärts und Spc R - reverse Primer werden automatisch in Abhängigkeit vom Ort der Gründung des Konstrukts Störung ermittelt.</li>
		<li>Design die bis nach vorne und nach unten-Reverse Primer umfassen &#62; 1-kb upstream und downstream flankierenden Regionen des Gens GtfC bzw.. Legen Sie die Schmelztemperatur (T m) bis nach vorne und nach unten-Reverse Primer im Einklang mit der Schmelztemperatur des Up-Reverse und Down-Forward Primer, bzw. ( Abbildung 1A). 
		Hinweis: Finden Sie die folgende Formel zur Bestimmung von T m: T m (° C) = 2 (* NA + * NT) + 4 (* NC + * NG) - 5, wo * N entspricht der Anzahl der Grundierung Nukleotide mit der angegebenen Identität (A, T, C oder G).</li>
		<li>Design verschachtelte Primer (N_up-vorwärts und N_up-Reverse) für die 2 Nd PCR ( Abbildung 1 b). 
		Hinweis: Obwohl die äußerste Primerpaar (bis nach vorne und nach unten-Reverse) als Primer für die 2 Nd PCR verwendet werden können, wurden verschachtelte Primer (N_up-vorwärts und N_up-Reverse) in diesem Protokoll entworfen. Verschachtelte Primer sind häufig erforderlich für die 2 Nd PCR, wie beschrieben in den Vertreter Ergebnisse.</li>
		<li>Design Primer spezifisch für Spc R. Die Primer dienen zur Kolonie PCR zum Bildschirm für GtfC Störung.</li>
		<li>Design-Primer für die Überprüfung der GtfC Störung. 
		Hinweis: Die PCR-Produkte verstärkt mit diesen Primer überspannen die Grenze zwischen GtfC oder Spc R und stromaufwärts oder stromabwärts flankierenden Regionen GtfC. Die Primer-Sets &#39; GtfC bis nach vorne und GtfC Up-Reverse &#39; und &#39; GtfC Down-Forward und GtfC Down-Reverse &#39; sind spezifisch für GtfC und &#39; GtfC bis nach vorne und Spc R 2 -umgekehrte &#39; und &#39; Spc R 2-vorwärts und GtfC Down-Reverse &#39; sind spezifisch für Spc R.</li>
	</ol></li></ol> 2. Genomische DNA-Extraktion von S. Mutans <ol><li>Streak Lager S. Tetris s UA159 auf eine Agarplatte Gehirn Herz Infusion (BHI). Die Platte über Nacht bei 37 ° C unter anaeroben Bedingungen auszubrüten.</li>
	<li>Eine einzige Kolonie mit einem sterilen Zahnstocher abholen und in 5 mL BHI-Bouillon zu impfen. Kultur der S. Tetris über Nacht bei 37 ° C unter anaeroben Bedingungen auszubrüten.</li>
	<li>Zentrifuge die bakterielle Zellkultur für 15 min auf 2.000 × g. Aufschwemmen der Zelle Pellet in 5 mL Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS).</li>
	<li>Zentrifuge für 15 min auf 2.000 × g. Aufschwemmen der Zelle Pellet in 200 µL PBS.</li>
	<li>Genomischen DNA aus der Suspension mit einem Wulst-Prügel-Base genomische DNA Extraktion Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers zu extrahieren.
	<ol><li>Übertragung der Aussetzung zu einer Probe 2,0 mL Röhrchen mit Glasperlen (im Kit enthalten). Die Zellsuspension 750 µL Lyse-Lösung (im Kit enthalten) hinzufügen.</li>
		<li>Kappe fest und setzen die Rohre symmetrisch in den Schlauchhalter der Wulst-schlagende Störung Vorrichtung. Prozess mit der maximalen Geschwindigkeit für 5 Minuten. Zentrifuge die Wulst geschlagen Proben 1 min auf 10.000 × g. übertragen den Überstand zum Spin Filter (im Kit enthalten) in einem 2,0 mL Sammelröhrchen und Zentrifuge für 1 min bei 7.000 × g .</li>
		<li>Fügen Sie 1.200 µL DNA-Bindung Puffer (im Kit enthalten), das Filtrat. Transfer 800 µL der Mischung auf die Spin-Spalte (im Kit enthalten) zu einer 2,0 mL Sammelröhrchen und Zentrifuge für 1 min bei 10.000 × g.</li>
		<li>Verwerfen die Durchströmung der Spin Spalte Waschen die Spalte Matrix und Zentrifugieren für 1 min bei 10.000 × g. verwerfen der durchströmten sowie 500 µL Waschpuffer (im Kit enthalten) auf den Spin 200 µL Vorwäsche Puffer (im Kit enthalten) hinzufügen. Spalte, waschen Sie die Spalte Matrix und Zentrifugieren für 1 min bei 10.000 × g.</li>
		<li>Setzen Sie die Spin-Säule zu einem neuen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch und Hinzufügen der Spalte Matrix 100 µL der Elution Buffer (im Kit enthalten).</li>
		<li>Zentrifuge für 30 s bei 10.000 × g, die genomische DNA eluieren. Schätzen Sie den DNA-Konzentration und Reinheit durch Messung der Absorption bei 260 nm und 280 Nmusing einem Spektrophotometer und bestätigen, dass die A 260/a 280 Verhältnis größer als 1,8 ist.</li>
	</ol></li></ol> 3. PCR-Amplifikation <ol><li>Perform 1 St PCR mit S. Tetris s WT Genom und das synthetische Spc R gen als PCR-Vorlagen (siehe Tabelle 1). Verstärken der vorgelagerten flankierenden Region des Gens GtfC, der nachgeschalteten flankierenden Region GtfC gen und das Spc-R-gen mit den drei Sätzen von Primer beschrieben ( Abbildung 1A), als pro Tabelle 2 und Tabelle 3. 
	Hinweis: PCR-Primer, Reagenzien und Verstärkung Zyklen sind zusammengefasst in Tabelle 1, Tabelle 2 und Tabelle 3, bzw..</li>
	<li>Jeder PCR-Produkt auf einem 1 % Agarose-Gel Fraktionieren und Verbrauchsteuern die entsprechenden Bänder mit einem Gel Band Cutter.</li>
	<li>Reinigen jedes amplifizierten DNA-Produkt aus die Gele mit einem Spin Spalte und Silica Gel Membran-basierte Extraktion Kit.
	<ol><li>Übertragung Gel Scheiben zu einer sauberen Microcentrifuge Rohr und mischen mit 500 µL Puffer (im Kit enthalten) zu binden. Die Mischung bei 55 ° C für 15 min inkubieren, bis die Gel Scheiben vollständig gelöst sind.</li>
		<li>Setzen Sie die Spin-Säule (im Kit enthalten) in ein Sammelrohr (im Kit enthalten), laden Sie die Probe auf die Spin-Säule und Zentrifugieren für 30 s bei 11.000 × g. Verwerfen der durchströmten, fügen Sie die 600 µL Waschpuffer (im Kit enthalten) der Spin Spalte Waschen die Kieselsäure-Membran und Zentrifugieren für 30 s bei 11.000 × g.</li>
		<li>Verwerfen die Durchströmung und Zentrifuge für 2 min bei 11.000 × g Kieselsäure Membran trocknen.</li>
		<li>Legen die Spin-Spalte zu einem neuen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch, 50 µL Elution Buffer (im Kit enthalten) und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 2 min.</li>
		<li>Zentrifuge für 2 min bei 11.000 × g, die amplifizierte DNA eluieren. Schätzen Sie den DNA-Konzentration und Reinheit durch Messung der Absorption bei 260 nm und 280 Nmusing einem Spektrophotometer und bestätigen, dass die A 260/a 280 Verhältnis größer als 1,8 ist.</li>
	</ol></li> <li>Perform 2 Nd PCR der 2-stufigen Fusion PCR mit den drei etwa äquimolaren Fragmente als PCR-Vorlagen, gem. Tabelle 2 < RichtlinienintervallRong > und Tabelle 3. 
	Hinweis: Diese Fragmente wurden verstärkt und gespleißt mit verschachtelten Primer &#39; N_up vorwärts- und N_down-Reverse &#39; oder die äußerste Primer &#39; bis nach vorne und nach unten-Reverse &#39; ( Abbildung 1 b). PCR-Primer, Reagenzien und Verstärkung Zyklen sind in Tabelle 1, Tabelle 2 und Tabelle 3, bzw. zusammengefasst.</li>
	<li>Laden ein Zehntel der PCR Reaktionsmischung (5 µL) auf einem 0,8 % Agarose-Gel und vergleichen Sie die verstärkte Bandgröße mit der erwarteten Bandgröße zu bestätigen, die Generierung von entsprechenden Amplifikate ( Abbildung 1).</li>
	<li>Konzentrieren, das verbleibende Endprodukt PCR durch Ethanol Fällung ohne Reinigung.
	<ol><li>Hinzufügen 55 µL ultrareines Wasser zu den restlichen PCR Mischung die gesamte Lautstärke zu 100 µL.Add ein Zehntel-Volumen von 3 M Natriumacetat (10 µL), pH 5,2, gefolgt von 2,5 Bände von 100 % Ethanol (250 µL). Mischen und Einfrieren für 30 min bei-80 ° c</li>
		<li>Zentrifuge für 20 min bei 15.000 × g bei 4 ° C, überprüfen Sie, ob die Kugel auf der Unterseite des Schlauches und den Überstand verwerfen. Das Pellet mit 1 mL 70 % Ethanol, Zentrifuge für 5 min bei 15.000 × g bei 4 ° C zu waschen und entsorgen des Überstands. Das Pellet für etwa 30 min an der Luft trocknen und mit 10 µL ultrareines Wasser auflösen.</li>
	</ol></li></ol> 4. Kompetente Zellen Vorbereitung und Zelle Transformation <ol><li>Streak Lager S. Tetris s UA159 auf eine Agarplatte BHI. Die Platte über Nacht bei 37 ° C unter anaeroben Bedingungen auszubrüten.</li>
	<li>Eine einzige Kolonie mit einem sterilen Zahnstocher abholen und in 5 mL BHI-Bouillon zu impfen. Kultur der S. Tetris über Nacht bei 37 ° C unter anaeroben Bedingungen auszubrüten.</li>
	<li>Kultur der S. Tetris 2 mL auf 50 mL BHI-Bouillon übertragen und inkubieren Sie für 6-8 h bei 37 ° C zu einer optischen Dichte bei 600 nm (OD 600) von 0,2-0,4 unter anaeroben Bedingungen.</li>
	<li>Die Zellen für 15 min bei 2.000 × g bei 4 ° C zentrifugiert, überstand verwerfen und waschen die Zellen zweimal mit 40 mL eiskaltes Wasser, gefolgt von 40 mL 10 % Glycerin. 
	Hinweis: Reststoffe Einfluss auf nachfolgende Elektroporation.</li>
	<li>Aspirieren den Überstand vorsichtig mit einer Pasteurpipette, wie die Einhaltung des Pellet-Zelle in 10 % Glycerin reduziert wird. Aufschwemmen der Zellen in 1 mL frisch 10 % Glycerin, 50 µL der Suspension in jeder 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch zu verzichten und bei-80 ° C bis kurz vor der Verwendung zu speichern.</li>
	<li>Mix der 50 µL Aliquote des eiskalten kompetente Zellen mit 5 µL der Störung Konstrukt oben in Abschnitt 3 beschrieben. Fügen Sie die Mischung zur Elektroporation Küvetten (mit einem 0,2 cm Abstand zwischen den Elektroden). Den Staphylococcus Aureus-Modus beschäftigen (1,8 kV, 600 Ω, 10 µF 1 Impuls) der Elektroporation Vorrichtung, Electroporate.</li>
	<li>Unterbrechen die Zellen in 500 µL der BHI-Bouillon unmittelbar nach Electroporation und Spectinomycin-haltigen BHI-Agarplatten 50 µL der Suspension hinzu. 
	Hinweis: Zusätzliche Inkubation Zeit nach Elektroporation nicht erforderlich ist. Jedoch kann die Inkubation für 1-2 h nach Electroporation Transformationseffizienz verbessern.</li>
	<li>2-6 Tage bei 37 ° C unter anaeroben Bedingungen die Platte inkubieren. 
	Hinweis: S. Mutans Δ GtfB ist aufgebaut wie oben beschrieben. Die gesamte kodierende Region des Gens GtfB wird ersetzt mit dem Erythromycin Widerstand gen 8 in S. Mutans Δ GtfB. Jeder Stamm S. Mutans in BHI Brühe bei 37 ° C unter anaeroben Bedingungen kultiviert wird.</li>
</ol> 5. Überprüfung der Gene Störung und Lagerung <ol><li>Wählen Sie zufällige Kolonien und in die PCR Mischung Kolonie PCR gemäß Tabelle 2 und Tabelle 3 durchführen zu impfen. PCR-Primer, Reagenzien und Verstärkung Zyklen sind in Tabelle 1, Tabelle 2 und Tabelle 3, bzw. zusammengefasst.</li>
	<li>Laden die PCR Reaktionsmischung auf einem 1 % Agarosegel, die Spc R zu bestätigen-spezifischen DNA-Band.</li>
	<li>Wählen Sie die positiven Kolonie mit einem sterilen Zahnstocher und Subkultur Zellen in 10 mL Spectinomycin-haltigen BHI Brühe für 2 Tage bei 37 ° C unter anaeroben Bedingungen.</li>
	<li>Überprüfen die Generation von S. Mutans Δ GtfC.
	<ol><li>Teilen die Zellsuspension gleichermaßen. Genomischen DNA aus den Zellen, die oben beschriebenen zu extrahieren (Schritte 2,3., 2.5.5.). Führen Sie PCR mit genomischer DNA als Vorlage für die PCR, mit Primer für die Überprüfung der GtfC Störungen (Tabelle 1) gemäß Tabelle 2 und Tabelle 3. 
		Hinweis: Die PCR-Primer, Reagenzien und Verstärkung Zyklen sind zusammengefasst in Tabelle 1, Tabelle 2 und Tabelle 3, bzw..</li>
		<li>Laden die PCR-Mischung auf einem 2 % Agarose-Gel und vergleichen Sie die verstärkte Bandgröße mit der erwarteten Bandgröße zu bestätigen, die Generierung von entsprechenden Amplifikate .</li>
		<li>Zentrifugieren verbleibende Zellsuspension für 15 min auf 2.000 × g bei 4 ° c Aufschwemmen der Zelle Pellet in 5 mL PBS.</li>
		<li>Zentrifuge für 15 min auf 2.000 × g bei 4 ° C. Aufschwemmen die Zelle pellet in 1,5 mL BHI-Bouillon mit 25 % Glycerin und speichern in-80 ° ADR-20 ° C.</li>
	</ol></li></ol> 6. Phänotypische Analyse <ol><li>Streifen jedes S. Tetris s Belastung auf eine Agarplatte BHI. Die Platte über Nacht bei 37 ° C unter anaeroben Bedingungen auszubrüten.</li>
	<li>Eine einzige Kolonie mit einem sterilen Zahnstocher abholen und in 2 mL BHI-Bouillon mit oder ohne entsprechenden Antibiotikum zu impfen. Inkubation über Nacht bei 37 ° C unter anaeroben Bedingungen.</li>
	<li>20 µL der Nacht Kultur Suspension in 2 mL BHI-Bouillon mit 1 % oder 5 % Saccharose ohne Antibiotika in ein Reagenzglas zu impfen; mit dem Reagenzglas in eine Schräglage über Nacht bei 37 ° C unter anaeroben Bedingungen Kulturzellen.</li>
	<li>Vortex das Glas Reagenzgläser für 10 s und dekantieren Kultur Suspensionen. Die Reagenzgläser dreimal mit destilliertem Wasser zu waschen. Fügen Sie 1 mL von 0,25 % Coomassie Brilliant blau (CBB) um die Biofilme Fleck auf der Rohrwand und inkubieren dann 1 min.</li>
	<li>Der Färbelösung zu dekantieren, die Reagenzgläser dreimal mit destilliertem Wasser zu waschen und trocknen die Reagenzgläser.</li>
	<li>Farbdichte und Erweiterung des CBB gebeizt-Biofilms visuell zu bestimmen, die Bildung von Biofilm Fähigkeit in eine phänotypische Analyse bewerten.</li>
</ol>

<ol><li>Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+hybrid+genes+without+the+use+of+restriction+enzymes%3A+gene+splicing+by+overlap+extension%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension.</a> Gene. 77 (1), 61-68 (1989).</li>
<li>Horton, R. M., Cai, Z., Ho, S. M., Pease, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+splicing+by+overlap+extension%3A+tailor-made+genes+using+the+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction.</a> BioTechniques. 54 (3), 129-133 (2013).</li>
<li>Kuwayama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR-mediated+generation+of+a+gene+disruption+construct+without+the+use+of+DNA+ligase+and+plasmid+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">PCR-mediated generation of a gene disruption construct without the use of DNA ligase and plasmid vectors.</a> Nucleic Acids Res. 30 (2), E2(2002).</li>
<li>Sakurai, I., Mizusawa, N., Wada, H., Sato, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digalactosyldiacylglycerol+is+required+for+stabilization+of+the+oxygen-evolving+complex+in+photosystem+II%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Digalactosyldiacylglycerol is required for stabilization of the oxygen-evolving complex in photosystem II.</a> Plant Physiol. 145 (4), 1361-1370 (2007).</li>
<li>Aoki, H., Shiroza, T., Hayakawa, M., Sato, S., Kuramitsu, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+a+Streptococcus+mutans+glucosyltransferase+gene+coding+for+insoluble+glucan+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Cloning of a Streptococcus mutans glucosyltransferase gene coding for insoluble glucan synthesis.</a> Infect Immun. 53 (3), 587-594 (1986).</li>
<li>Hanada, N., Kuramitsu, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+the+Streptococcus+mutans+gtfC+gene%2C+coding+for+synthesis+of+both+soluble+and+insoluble+glucans%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of the Streptococcus mutans gtfC gene, coding for synthesis of both soluble and insoluble glucans.</a> Infect Immun. 56 (8), 1999-2005 (1988).</li>
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<li>Lau, P. C., Sung, C. K., Lee, J. H., Morrison, D. A., Cvitkovitch, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR+ligation+mutagenesis+in+transformable+streptococci%3A+application+and+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">PCR ligation mutagenesis in transformable streptococci: application and efficiency.</a> J Microbiol Methods. 49 (2), 193-205 (2002).</li>
<li>Ge, X., Xu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+gene+deletions+in+Streptococcus+sanguinis+by+high+throughput+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Genome-wide gene deletions in Streptococcus sanguinis by high throughput PCR.</a> J Vis Exp. (69), (2012).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

In diesem Protokoll sind die Primer für die 1St PCR auszulegen, um ca. 1 kb upstream und downstream flankierenden Regionen der Zielregion im Genom zu verstärken. Solche lange flankierenden Sequenzen sind notwendig, um die Effizienz der homologen Rekombination.
Die Sequenzen der Primer (Up-Reverse, Down-Forward, SpcR-vorwärts und SpcR-rückwärts) in diesem Protokoll wurden automatisch ermittelt basierend auf dem Gelände der Einbeziehung des Kons...

Gen Funktionsanalyse umfasst in der Regel einen phänotypische Vergleich zwischen einem Wildtyp Stamm und einem Stamm, in dem ein bestimmtes Gen des Interesses gestört wurde. Diese gen-Störung-Technik ist für die Funktion von Genanalysen in einer Vielzahl von Taxa, von Bakterien bis zu den Säugetieren verwendet worden. Ein Gen-Störung-Konstrukt ist notwendig für die Generation des Stammes gen gestört; Dieses Konstrukt der Desoxyribonukleinsäure (DNA) besteht aus der Antibiotikaresistenz-Marker-gen mit den vor- und nachgelagerten flankierenden Regionen des Zielgens verschmolzen und ist integriert in das Genom durch homologe Rekombination. Die gen-gestört Belastung kann mithilfe von Selektivmedien mit dem Antibiotikum isoliert sein. Die konventionelle Methode verwendet für den Bau des Stammes gen gestört erfordert komplexe Arbeitsschritte, wie die Verstärkung des Zielgens durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR), Unterbindung des Gens in eine geeignete Plasmid, Verdauung mit Einschränkung Enzyme und Religation Antibiotikaresistenz-Marker-gen eingefügt. Dieser Prozess ist zeitaufwändig, die mehrere Tage bis zu mehreren Wochen, je nach Erfolg der einzelnen Schritte. Darüber hinaus ist das Design der Störung Konstrukte der Beschränkungsenzymsites des Zielgens abhängig. Um diese Probleme zu beheben, wurden DNA-PCR-basierter Spleißen Methoden1,2 für die Gestaltung von gen gestört Mutanten von Dictyostelium Discoideum3 und Synechocystis SP. PCC68034 gemeldet. In der vorliegenden Studie wurde eine Methode entwickelt, um ein Gen gestört Streptokokken Stamm in eine relativ schnelle, einfache und kostengünstige Art und Weise, unter Verwendung einer modifizierten PCR-basierten Methode (2-stufige Fusion PCR bezeichnet) für den Bau der Störung zu erzeugen Konstrukt und Electroporation für gentechnische Transformation.
Die 2-stufige Fusion benötigten PCR genomischer DNA, die Antibiotikaresistenz-Marker-gen als Kopiervorlage PCR und vier Paare von angemessen entworfen Oligonukleotid-Primer. Im ersten Schritt (1St PCR), ein 1-kb upstream flankierenden Region des Zielgens, ein 1-kb downstream flankierenden Region des Ziels werden gen und Antibiotikaresistenz-Marker-gen mittels PCR amplifiziert. Die 5' Regionen der rückwärts-Primer und die forward Primer für Verstärkung von den vorgelagerten und nachgelagerten flankierenden Regionen, bzw. gehören 15 Basen komplementär zu den Enden des Markergens. Die 5' Regionen von forward und reverse Primer für Marker-gen-Amplifikation gehören ebenso 15 Basen komplementär zu der unteren Ende der vorgelagerten flankierenden Region des Zielgens und das obere Ende der nachgeschalteten flankierenden Region des Zielgens, bzw.. Daher enthalten die drei amplifizierten Fragmente überlappende 30 Basenpaare Regionen auf dem Fusion-Gelände. Im zweiten Schritt (2Nd PCR) ist die PCR mit verschachtelten PCR Primer verwenden die drei Fragmente, die durch die 1St PCR als Vorlagen verstärkt durchgeführt. Die komplementäre Regionen der Vorlagen sind zusätzlich über 2Nd PCR miteinander verbunden. Zu guter Letzt wird das Konstrukt für homologe Rekombination der Wildtyp Stamm durch Elektroporation vorgestellt. Erfolgreiche gen Störung kann durch PCR mit spezifischen Primern verifiziert werden. Obwohl die Störung Konstrukt mit High-Fidelity-DNA-Polymerase verstärkt ist, sind zusätzliche enzymatische Reaktionen, wie DNA-Ligatur oder DNA-Verdauung, nicht notwendig, um das Konstrukt zu erzeugen. Darüber hinaus kann eine gelöschte oder erhaltene Region über das Genom nach besser gekleideteres Design flexibel gewählt werden.
In der vorliegenden Arbeit erfolgte Löschung der gesamten kodierenden Region des Gens GtfC , die Glucosyltransferase in Streptococcus Mutanskodiert, um die schnelle, einfache gen Störung Methode in einer Streptokokken-Spezies zu demonstrieren. Darüber hinaus eine GtfB-gestörten Belastung wurde auf die gleiche Weise erzeugt. Die Glucosyltransferases von GtfC und GtfB kodiert tragen zur kariogenen dentale Biofilm Entwicklung5,6. Die Bildung von Biofilm Fähigkeiten der Wildtyp-Stamm (S. Mutans WT), GtfC-Dehnung (S. Mutans ΔGtfC) und GtfBgestört-gestörten Belastung (S. Mutans ΔGtfB) wurden ausgewertet für vergleichende phänotypische Analysen. Dieses Protokoll erweitert die Anwendung eines zweistufigen Verfahrens zur gen Störung einer zusätzlichen Arten und für Studien der Genfunktion in einem breiteren Spektrum von Taxa geändert werden kann.

<table><tbody><tr><td>Streptococus mutans</td><td>Stammstamm im Labor.</td><td></td><td>Wildtyp-Stamm (Stamm UA159)</td></tr><tr><td>Genomisches DNA-Extraktionskit</td><td>Zymo Research</td><td>D6005</td><td></td></tr><tr><td>Bead-Beating-Disruptionsapparat</td><td>Taitec</td><td>GM-01</td><td></td></tr><tr><td>Synthetische Gene</td><td>Eurofins Genomics</td><td>Kundenspezifische</td><td>Spectinomycin- und Erythromycin-Resistenz-Gene</td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>Astec</td><td>PC-708</td><td></td></tr><tr><td>PCR-Primer</td><td>Eurofins Genomics</td><td>Kundenspezifische Bestellung</td> mit <td>35 Basen in der Länge</td></tr><tr><td>DNA-Polymerase</td><td>Takara</td><td>R045A</td><td>High-Fidelity DNA-Polymerase</td></tr><tr><td>Gel-Extraktionskit</td><td>Nippon Genetics</td><td>FG-91202</td><td>DNA-Extraktion aus Agarose-Gel</td></tr><tr><td>Gel-Bandschneider</td><td>Nippon Genetics</td><td>FG-830</td><td></td></tr><tr><td>Spektralphotometer</td><td>Beckman Coulter</td><td>DU 800</td><td></td></tr><tr><td>Elektroporator</td><td>Bio-rad</td><td>1652100</td><td></td></tr><tr><td>Elektroporationsküvette</td><td>Bio-rad</td><td>1652086</td><td>0,2 cm Spalt</td></tr><tr><td>Anaeropack</td><td>Mitsubishi Gas Chemical</td><td>A-03</td><td>Anaerobes Kultursystem</td></tr><tr><td>Gehirn Herz Infusionsbrühe</td><td>Becton, Dickinson</td><td>237500</td><td>Bakterielle Nährmedien</td></tr><tr><td>Spectinomycin</td><td>Wako</td><td>195-11531</td><td>Antibiotika</td></tr><tr><td>Erythromycin</td><td>Wako</td><td>057-07151</td><td>Antibiotika</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Wako</td><td>196-00015</td><td>Für die Biofilmentwicklung</td></tr><tr><td>CBB R-250</td><td>Wako</td><td>031-17922</td><td>Für die Biofilmfärbung</td></tr></tbody></table>

generation von einem gen gestört streptococcus mutans belastung ohne gene klonen

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Typische Methoden für die Aufklärung der Funktion eines bestimmten Gens beinhalten vergleichende phänotypische Analysen der Wildtyp Stamm und einem Stamm, in dem das gen des Interesses gestört wurde. Ein Gen-Störung DNA-Konstrukt mit einer geeigneten Antibiotika-Resistenz-Markergen eignet sich für die Erzeugung von gen gestört Stämme in Bakterien. Jedoch mit herkömmlichen Bauweisen, die Gene Klonen Schritte erfordern, komplexe und zeitraubende Protokolle verbunden. Hier ist eine relativ einfache, schnelle und kostengünstige Methode zur gezielten gen Störung in Streptococcus Mutans beschrieben. Die Methode nutzt eine 2-stufige Fusion Polymerase-Kettenreaktion (PCR), die Störung Konstrukt und Electroporation für gentechnische Transformation zu generieren. Diese Methode erfordert keine enzymatische Reaktion als PCR, und bietet zudem mehr Flexibilität hinsichtlich der Gestaltung des Konstrukts Störung. Beschäftigung von Electroporation erleichtert die Vorbereitung der kompetenten Zellen und verbessert die Transformationseffizienz. Das vorliegende Verfahren kann für die Generierung von gen gestört Stämme verschiedener Arten angepasst werden.

Abbildung 2 zeigt, dass die Größe der einzelnen Produkte von der 1St PCR, war wie auf dem 1 % Agarosegel beobachtet, in guter Übereinstimmung mit der prognostizierten Größe von ca. 1 kb. Abbildung 3 zeigt die Gel-Elektrophorese Analyse der Produkte der 2Nd PCR. Abbildung 4 zeigt S. Mutans Kolonien mit der Störung-Konstrukt und ein Gel-Elektrophorese Analyse der Kolonie-...

Wir beschreiben eine einfache, schnelle und relativ kostengünstige Methode zur Erzeugung von gen gestört Streptococcus Mutans Stämme; Diese Technik kann für die Generierung von gen gestört Stämme verschiedener Arten angepasst werden.

Generation von einem Gen gestört Streptococcus Mutans Belastung ohne Gene Klonen

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Generierung gezielter gendisruptierter Streptococcus mutans-Stämme unter Verwendung einer zweistufigen Fusions-PCR und Elektroporation. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Mikrobiologie zu beantworten, z. B. wie ein Gen von Interesse funktioniert. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass keine andere enzymatische Reaktion als PCR erforderlich ist und eine kompetente Zellvorbereitung für die Elektroporation recht einfach ist. Obwohl diese Methode einen Einblick in die Technik der Genstörung von Streptococcus mutans geben kann, kann sie auch auf andere mikrobielle Spezies wie Staphylococcus aureus angewendet werden. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da sie mit der Wirksamkeit von verschachtelten Primern für die zweite PCR nicht vertraut sind. Das Verfahren wird von Dr. Ayako Okada, einer Forschungsleiterin aus unserem Labor, vorgeführt. Um dieses Verfahren zu beginnen, streichen Sie S.mutans UA159 auf eine Gehirn-Herz-Infusions- oder BHI-Agar-Platte und inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 37 Grad Celsius unter anaeroben Bedingungen. Am nächsten Tag verwenden Sie einen sterilisierten Zahnstocher, um eine einzelne Kolonie zu pflücken und sie in fünf Milliliter BHI-Brühe zu impfen. Inkubieren Sie die S.mutans-Kultur über Nacht bei 37 Grad Celsius unter anaeroben Bedingungen. Als nächstes zentrifugieren Sie die Kultur bei 2000 mal G für 15 Minuten. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in fünf Millilitern PBS. Erneut bei 2000 mal G für 15 Minuten zentrifugieren. Resuspendieren Sie das resultierende Zellpellet in 200 Mikrolitern PBS. Extrahieren Sie genomische DNA aus der Suspension mit einem auf Bead-Beating basierenden genomischen DNA-Extraktionskit. Geben Sie zunächst die Zellsuspension in ein zwei Milliliter fassendes Probenröhrchen mit Glasperlen. Geben Sie dann 750 Mikroliter Lyselösung in die Zellsuspension. Verschließen Sie die Röhrchen fest und legen Sie sie symmetrisch in den Röhrchenhalter der Raupenschlagvorrichtung. Fünf Minuten lang mit maximaler Geschwindigkeit verarbeiten. Die mit Perlen geschlagenen Proben werden eine Minute lang bei 10.000 G zentrifugiert. Der Überstand wird in ein Zwei-Milliliter-Sammelröhrchen in eine Spin-Säule überführt und eine Minute lang bei 7000-fachem G zentrifugiert. Geben Sie 1200 Mikroliter DNA-Bindungspuffer in das Filtrat und geben Sie 800 Mikroliter des Gemisches in einem Zwei-Milliliter-Sammelröhrchen in die Spin-Säule. Eine Minute lang bei 10.000 mal G zentrifugieren. Verwerfen Sie den Durchfluss. Geben Sie 200 Mikroliter Vorwaschpuffer in die Schleudersäule, um die Säulenmatrix zu waschen und eine Minute lang mit 10.000 G zu zentrifugieren. Entsorgen Sie den Durchfluss, geben Sie 500 Mikroliter Waschpuffer in die Schleudersäule, um die Säulenmatrix zu waschen, und zentrifugieren Sie erneut. Setzen Sie jede Spin-Säule in ein neues 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen ein und geben Sie 100 Mikroliter Elutionspuffer in die Säulenmatrix. Zentrifugen bei 10.000 G für 30 Sekunden, um die genomische DNA zu eluieren. Schätzen Sie die DNA-Konzentration und -Reinheit, indem Sie die Extinktion bei 260 Nanometern und 280 Nanometern mit einem Spektralphotometer messen. Die erste PCR wird unter Verwendung des Wildtyp-Genoms von S.mutans und des synthetischen Streptomycin-Resistenzgens als PCR-Templates durchgeführt. Drei Sätze von Primern werden verwendet, um jeweils die stromaufwärts flankierende Region des Glykosyltransferase C- oder gtfC-Gens, die stromabwärts flankierende Region des gtfC-Gens und das Spectinomycin-Resistenzgen zu amplifizieren. Fraktionieren Sie jedes PCR-Produkt auf einem 1%Agarose-Gel. Die Größe jedes Produkts aus der ersten PCR sollte ungefähr ein KB betragen. Verwenden Sie einen Gelbandschneider, um die entsprechenden Banden herauszuschneiden und jedes amplifizierte DNA-Produkt zu reinigen, wie im Textprotokoll beschrieben. Der nächste Schritt besteht darin, die drei ungefähr gleichen molaren Fragmente als PCR-Templates zu verwenden, um die zweite PCR durchzuführen. Diese Fragmente werden amplifiziert und mit geeigneten Primern gespleißt, um das Disruptorkonstrukt herzustellen. Da der Erfolg dieses Verfahrens von der Amplifikation des Störungskonstrukts durch eine zweite PCR abhängt, ist es wichtig, das zweite PCR-Produkt durch Elektrophorese zu bestätigen. Laden Sie 1/10 des PCR-Reaktionsgemisches auf ein 0,8%Agarose-Gel, um zu bestätigen, dass das erzeugte Amplikon die vorhergesagte Bandengröße aufweist. In diesem Beispiel ergaben verschachtelte Primer eine viel bessere Verstärkung. Füllen Sie das restliche PCR-Gemisch in ein neues 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und fügen Sie 55 Mikroliter Reinstwasser hinzu, um das Gesamtvolumen auf 100 Mikroliter einzustellen. Fügen Sie 1/10 Volumen von drei molaren Natriumacetat mit einem pH-Wert von 5,2 hinzu, gefolgt von 2,5 Volumenprozent 100%igem Ethanol und mischen Sie.30 Minuten lang bei minus 80 Grad Celsius einfrieren. Zentrifugieren Sie bei 15.000 mal G bei vier Grad Celsius für 20 Minuten. Wenn die Zentrifugation abgeschlossen ist, prüfen Sie, ob sich das Pellet am Boden des Röhrchens befindet. Entsorgen Sie den Überstand. Waschen Sie das Pellet mit einem Milliliter 70%igem Ethanol und zentrifugieren Sie es fünf Minuten lang bei 15.000 Mal G bei vier Grad Celsius. Entsorgen Sie den Überstand und trocknen Sie das Pellet etwa 30 Minuten lang an der Luft. Zum Schluss lösen Sie das Pellet mit 10 Mikrolitern Reinstwasser auf. Kompetente S.mutans UA159-Zellen wurden zuvor als 50 Mikroliter Aliquote bei minus 80 Grad Celsius hergestellt und gelagert. Mischen Sie jeweils 50 Mikroliter Aliquot eiskalter kompetenter Zellen mit fünf Mikrolitern des Disruptionskonstrukts. Geben Sie die Mischung in Elektroporationsküvetten mit einem Abstand von 0,2 Zentimetern zwischen den Elektroden. Führen Sie die Elektroporation mit dem Staphylococcus aureus-Modus des Elektroporationsgeräts durch. Unmittelbar nach der Elektroporation suspendieren Sie die Zellen in 500 Mikrolitern BHI-Bouillon und geben Sie 50 Mikroliter der Suspension auf spectinomycinhaltige BHI-Agarplatten. Inkubieren Sie die Platten zwei bis sechs Tage lang bei 37

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Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Systematische, groß angelegte synthetische genetische (Gen-Gen-oder Epistase) Interaktion Bildschirme können verwendet werden, um genetische Redundanz und Weg cross-talk zu erkunden. Hier haben wir eine High-Throughput-quantitative synthetischen genetischen array Screening-Technologie beschreiben, bezeichnet ESGA dass wir für die Aufklärung epistatische Beziehungen und erforschen genetische Interaktion Netze in den...

Mapping Bakterielle Functional Netzwerke und Pathways in<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Verwendung von Synthetic Genetic Arrays

Eine effiziente genomweiten Gen-Mutation Methode ermittelt...

Genomweiten Gen-Deletionen in<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Von High Throughput PCR

Quelle: Lea-Smith, D. J., et al. Generierung von markierten und markerlosen Mutanten in Modell-Cyanobakterienarten. J. Vis. Exp. (2016)Das Video zeigt eine Methode zur Erzeugung von Antibiotika-markierten Mutanten in Cyanobakterien. Das Protokoll beginnt mit der Kultivierung von Cyanobakterien, gefolgt von Zentrifugations- und Waschschritten, bei denen die Oberflächen-Pili erhalten bleiben. Anschließend wird ein Plasmid eingeführt, das ein Antibiotikaresistenzgen trägt, das von homologen...

Generierung von Antibiotika-markierten Mutanten in Cyanobakterien durch homologe Rekombination

Source: Saragliadis, A., et al. Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates the phage-mediated transfer of donor DNA carrying an excisable antibiotic resistance cassette into Escherichia coli. The integrated cassette replaces the target gene via homologous recombination, resulting in a stable gene deletion.

Generating Gene Deletions in E. coli via Phage-Mediated Transfer of an Excisable Antibiotic Cassette

Enterobacter sp. Ysu wächst in Glucose-Minimalsalzmedium. Auxotrophe werden durch Transformation mit einem transposome die zufällig fügt sich in das Wirtsgenom erzeugt. Mutanten werden durch Replika-Plattierung aus komplexen Medium, um Minimalmedium gefunden. Unterbrochen Gene durch Gen Rettungs- und Sequenzierung identifiziert.

Erzeugung Enterobacter Sp. Ysu Auxotrophe Mit Transposon-Mutagenese

Das Einbringen mehrerer genomischer Veränderungen in Cyanobakterien ist ein wesentliches Werkzeug bei der Entwicklung von Stämmen für industrielle und Grundlagenforschungszwecke. Wir beschreiben ein System zur Generierung unmarkierter Mutanten in der Modell-Cyanobakterienspezies Synechocystis sp. PCC6803 und markierten Mutanten in Synechococcus sp. PCC7002.

Erzeugung von Marked und Markerless Mutants in Modell Cyanobakterienarten

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Verwendung von bereits bestehenden antibiotische Resistenz-Kassette Löschung Konstrukte als Grundlage für die Herstellung von Löschung Mutanten in anderen E. Coli -Stämme. Solche Löschung Mutationen können mobilisiert und in den entsprechenden Locus eines Empfängers Stamm mit P1 Bakteriophagen Transduktion eingefügt.

Herstellung von Gen-Deletionen in Escherichia coli durch P1 Transduktion mit verbrauchsteuerpflichtigen Antibiotikaresistenz Kassetten

Beschrieben hier ist eine einfache Methode zur Reinigung eines Genprodukts in Streptococcus mutans. Diese Technik kann bei der Reinigung von Proteinen, insbesondere Membranproteinen und Proteinen mit hoher Molekularmasse, von Vorteil sein und kann mit verschiedenen anderen Bakterienarten verwendet werden.

Reinigung eines hochmolekularen Proteins in Streptococcus mutans

Hier beschreiben wir ein einfaches und reproduzierbares Protokoll des Mausmodells der Infektion, um die Dämpfung der genetisch veränderten Stämme von Pseudomonas aeruginosa im Vergleich zur von der United States Food and Drug Administration (FDA) zugelassenen Escherichia coli für kommerzielle Anwendungen zu bewerten.

Generierung von In-Frame-Gen-Deletion Mutanten in Pseudomonas aeruginosa und Tests auf VirulenzDämpfung in einem einfachen Mausmodell der Infektion

Hier wird eine Methode zur gezielten, markerlosen Genlöschung bei Chlamydia trachomatis mit Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenese, FLAEM beschrieben.

Markerless Gene Deletion von Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis

Hier beschreiben wir die Konstruktion von Nullmutanten von Aeromonas in spezifischen Glykosyltransferasen oder Regionen, die Glykosyltransferasen enthalten, die Motilitätsassays und die Flagellenreinigung, die durchgeführt wurden, um die Beteiligung und Funktion ihrer kodierten Enzyme bei der Biosynthese eines Glykans zu bestimmen, sowie die Rolle dieses Glykans in der bakteriellen Pathogenese.

Erzeugung von Nullmutanten zur Aufklärung der Rolle bakterieller Glykosyltransferasen in der bakteriellen Motilität

Lernen Sie eine schnelle Methode zur Erzeugung von gendeletierten Streptococcus mutans-Stämmen mittels zweistufiger Fusions-PCR und Elektroporation. Diese kostengünstige Technik erleichtert genetische Studien in der Mikrobiologie.

Generation von einem Gen gestört Streptococcus Mutans Belastung ohne Gene Klonen

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