In-vitro- Phagozytose von Myelin Schutt durch Knochenmark stammenden Makrophagen

Wir präsentieren Ihnen Methoden, um die phagocytic Fähigkeit der primären murinen Knochenmark stammenden Makrophagen mit Gewebekulturen beschrifteten Myelin Schutt und intrazellulären Lipid Droplet Färbung bewerten.

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, die aus dem Knochenmark gewonnene Makrophagen-Phagozytose von Myelin-Trümmern aus dem Gehirn zu beurteilen. Dieses Protokoll wurde entwickelt, um Schlüsselfragen auf dem Gebiet des Neurotraumas zu beantworten. Der Vorteil dieser Methode besteht darin, dass sie eine effiziente und relativ kostengünstige Analyse der Makrophagenreaktionen in vitro ermöglicht, insbesondere der phagozytischen Kapazität von Makrophagen aus dem Knochenmark auf Myelintrümmer.

Diese Methode kann leicht angepasst werden, um die Auswirkungen externer Modulatoren zu untersuchen. Nachdem Sie die Maus mit 70% Ethanol gesättigt haben, machen Sie eine Öffnung in der Bauchhaut. Ziehe die Haut zurück, um die Beine zum Sezieren freizulegen.

Achten Sie darauf, die Bauchhöhle während dieses Vorgangs nicht zu punktieren. Sobald sie freiliegen, entfernen Sie die Beine, indem Sie am Knöchel und an der Hüfte schneiden. Legen Sie die Beine in eiskaltes PBS, das mit Antibiotika versetzt ist.

Wiederholen Sie dies für das andere Bein. Waschen Sie das Tuch in frischem, eiskaltem PBS, das mit Antibiotika versetzt wurde, um alle Partikel zu entfernen, die während der Dissektion am Gewebe haften geblieben sein könnten. Eine sanfte Schabebewegung, die am Muskel angewendet wird, löst einen Großteil des unerwünschten Gewebes.

Befreien Sie mit Skalpell und Pinzette das Schienbein vom Muskel- und Bindegewebe. Sobald du dich befreit hast, entferne beide Enden, um die Markhöhle freizulegen. Wiederholen Sie diesen Vorgang für den Oberschenkelknochen.

Befestigen Sie eine 25-Gauge-Nadel an einer 20-Millimeter-Spritze, die mit vollständigem Makrophagenmedium aus dem Knochenmark gefüllt ist. Spülen Sie dann die Knochenmarkhöhle. Der Knochen erscheint weiß, wenn er ausreichend gerötet ist.

Die gesammelten Knochenmarkaspirate werden mit einer 18-Gauge-Nadel 30 bis 90 Sekunden lang gerührt, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten. Anschließend wird die Suspension durch ein steriles Zellsieb mit einer Porengröße von 70 Mikrometern geleitet. Die Zellsuspensionen gleichmäßig in 145 Zentimeter große Zellkulturschalen verteilen.

Jede Maus bietet genug für insgesamt drei Gerichte. Nach siebentägiger Kultivierung sind diese Schalen in der Regel zwischen 70 und 80 % konfluent mit reifen Makrophagen. Um rohe Myelintrümmer aus dem Gehirn zu isolieren, wird eine Reihe von Saccharosegradienten-Ultrazentrifugationsschritten durchgeführt.

Zu Beginn werden 10 bis 12 Gehirne von Mäusen im Alter von acht bis 10 Wochen seziert. Die Gehirne werden dann in 0,32 molaren Saccharoselösung homogenisiert und dann auf ein 0,383 molare Saccharoselösungskissen geschichtet, um einen diskontinuierlichen Gradienten zu erzeugen. Nach der Zentrifugation befinden sich die rohen Myelinreste an der Grenzfläche zwischen den Schichten.

Diese wird gesammelt und in eine Tris-Pufferlösung abgegeben und erneut zentrifugiert, um die Myelinreste zu pelletieren. Das Pellet wird wieder in Tris-Pufferlösung suspendiert und auf zwei Röhrchen aufgeteilt, um eine zusätzliche Zenetrifugation zu ermöglichen. Entfernen Sie zunächst das gesamte Gehirn und legen Sie es in eine Schüssel mit eiskalter 0,32 molaren Saccharoselösung.

Schneiden Sie die gesammelten Gehirne mit einer sterilen chirurgischen Schere in etwa fünf Millimeter große Stücke. Dieser Schritt hilft beim anschließenden Homogenisierungsprozess. Sammle das Gewebe in ein 50-Milliliter-Röhrchen.

Homogenisieren Sie das Gewebe mit einem rotierenden Homogenisator zu einer glatten Aufschlämmung. Stellen Sie sicher, dass alle großen sichtbaren Festkörper des Gehirns gründlich homogenisiert wurden. In ein Ultrazentrifugenröhrchen mit 20 Millilitern 0,83 molare Saccharoselösung geben und homogenisieren, wobei darauf zu achten ist, dass die Trennung aufrechterhalten wird.

Balancieren Sie jedes Röhrchen vorsichtig mit der 0,32 molaren Saccharoselösung. Wenn Sie fertig sind, geben Sie die Röhrchen in einen geeigneten Zentrifugenrotor und drehen Sie sie 45 Minuten lang bei 100.000-facher Schwerkraft und vier Grad Celsius. Stellen Sie sicher, dass Beschleunigung und Verzögerung auf die Mindestwerte eingestellt sind.

Sobald die Zentrifugation abgeschlossen ist, werden die Myelintrümmer zwischen der Grenzfläche der Saccharosedichte sichtbar sein. Sammeln Sie vorsichtig die Myelinreste. Nach dem Sammeln fügen Sie Tris-Puffer zu den Myelin-Trümmern hinzu.

Homogenisieren Sie erneut mit einem rotierenden Homogenisator. Teilen Sie das Homogenat auf sechs saubere Ultrazentrifugenröhrchen auf und balancieren Sie die Röhrchen nach Bedarf mit zusätzlichem Tris-Puffer aus. Zentrifugieren Sie die gesammelten Myelintrümmer erneut bei der 100.000-fachen Schwerkraft, vier Grad Celsius für 45 Minuten, wobei Beschleunigung und Verzögerung auf ihre Maximalwerte eingestellt werden.

Nach der Zentrifugation wurde das Myelin pelletiert. Mit dem Tris-Puffer das Pellet resuspendieren. Kombinieren Sie die Resuspensionen und die Ultrazentrifuge erneut.

Nach der Zentrifugation bildet sich ein dicht gepacktes Pellet. Dekantieren Sie das Übergeborene. Resuspendieren Sie das Pellet in sterilem PBS.

Teilen Sie die resuspendierten Myelinreste gleichmäßig in vorgewogene Mikrozentrifugenröhrchen auf. Nach 10-minütiger Zentrifugation bei 22.000-facher Schwerkraft das PBS-Supernat entfernen. Nach dem Wiegen des Pellets auf eine Konzentration von 100 Milligramm pro Milliliter mit PBS resuspendieren.

Die dabei entstehenden rohen Myelin-Trümmer eignen sich nun für die Untersuchung der Phagozytose. Die CFSE-Markierung von Myelintrümmern kann verwendet werden, um die frühe Internalisierung sowie den intrazellulären Transport zu verfolgen. Unmarkierte Myelintrümmer sind mit der Oil Red-O-Lipidfärbung kompatibel, um die Speicherung und den Stoffwechsel der internalisierten Lipide zu beurteilen.

Wenn Sie Myelinreste verwenden, die bei minus 80 Grad Celsius gelagert wurden, sollten Sie zuerst mit einer 29-Gauge-Nadel resuspendieren. Resuspendieren Sie 10 Milligramm pelletierte Myelinreste in 200 Mikrolitern PBS. Fügen Sie dann zwei Mikroliter fünf-millimolare CFSE-Lösung hinzu.

Pipette zum Mischen. Nach einer 30-minütigen Inkubation, geschützt vor Licht und anschließendem Waschen, resuspendieren Sie die Myelintrümmer mit PBS auf 100 Milligramm pro Milliliter. Nach der Kultur und Fixierung mit 4 % Paraformaldehyd 100 % Propylenglykol in jede Vertiefung geben.

Nach fünfminütiger Inkubation bei Raumtemperatur geben Sie in jede Vertiefung Oil Red-O-Färbelösung. Acht Minuten lang bei 60 Grad Celsius unter leichtem Rühren inkubieren. Kippen Sie die Platte vorsichtig, damit der Oil Red-O-Fleck vollständig abgesaugt werden kann.

Zu jeder Vertiefung 85% Propylenglykol hinzufügen. Nach fünfminütiger Inkubation bei Raumtemperatur waschen Sie die Vertiefungen mit PBS und färben Sie die Zellen mit einem Kernfarbstoff Ihrer Wahl. Repräsentative lichtmikroskopische Aufnahmen von Knochenmarkzellen während der Kultur.

24 Stunden nach der ersten Aussaat sind nur wenige adhärente Zellen vorhanden. In Gegenwart des Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktors M-CSF beginnen die Leukozyten-Vorläuferzellen jedoch eine Differenzierung zu durchlaufen. Nach siebentägiger Kultivierung in Gegenwart von M-CSF sind die Vorläuferzellen vollständig zu reifen Makrophagen aus dem Knochenmark differenziert, die zur Phagozytose fähig sind.

Mit dieser Methode liefert eine einzelne acht bis 10 Wochen alte C57-Black-6J-Maus in der Regel 18 bis 24 Millionen Knochenmarkmakrophagen. Um die Internalisierung sichtbar zu machen, werden CFSE-markierte Myelin-Trümmer zu Makrophagenkulturen aus dem Knochenmark hinzugefügt. Die Zellen wurden eine Stunde lang mit einem Milligramm pro Milliliter CFSE-markierten Myelin-Trümmern behandelt, bevor sie gewaschen und mit 4 % Paraformaldehyd fixiert wurden.

Interinternalisierte Myelintrümmer können mit Standard-GFP-Filtersets an einem epifluoreszenzfähigen Mikroskop sichtbar gemacht werden. Um zu zeigen, wie sich die Myelinlipidakkumulation im Laufe der Zeit verändert, wurden Makrophagen 90 Minuten lang mit unmarkierten Myelinresten behandelt, dann gewaschen und zu verschiedenen Zeitpunkten fixiert. Unmittelbar nach dem Waschen sind nur wenige Lipidtröpfchen sichtbar.

Im Laufe der Zeit werden jedoch mehr Lipidtröpfchen sichtbar, die etwa 24 Stunden nach dem Waschen ein Maximum erreichen. Makrophagen beginnen mit dem Stoffwechsel für den Ausfluss zu den Lipidspeichern, wodurch die Anzahl der färbbaren Tröpfchen reduziert wird. Um die Ölrot-O-Färbung zu quantifizieren, wurden fünf zufällig erhaltene Bilder von jeder Probe zu einem bestimmten Zeitpunkt mit einem epifluoreszenzfähigen Mikroskop aufgenommen.

Das mit Oil Red-O gefärbte Gebiet wurde für jedes Bohrloch anhand von Bildern bestimmt, die im DsRed-Kanal aufgenommen wurden. Die Gesamtzahl der Zellen wird bestimmt, indem die Anzahl der in jedem Feld vorhandenen Zellkerne gezählt wird. Diese Grafik zeigt die resultierende Quantifizierung

Typisch ist ein stetiger Anstieg des Oil Red-O-positiven Signals, da die aus dem Knochenmark stammenden Makrophagen internalisierte Myelinlipide in neutrale Lipide umwandeln. Eine Abnahme des Oil Red-O-positiven Signals folgt dem Höhepunkt nach 24 Stunden, wenn Makrophagen beginnen, die Lipide zu verstoffwechseln oder auszuscheiden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie eine gute Vorstellung davon haben, wie Sie primäre Makrophagen aus dem Knochenmark isolieren und kultivieren und wie Sie ihre Wechselwirkung mit frisch isolierten Myelinresten aus dem Gehirn untersuchen können.

Der wichtigste Teil dieser Verfahren ist die ordnungsgemäße Wartung der aseptischen Technik zu jeder Zeit. Da Makrophagen robust auf kleine Mengen von pathogenassoziierten Molekülen reagieren können, ist es wichtig, mögliche Wechselwirkungen, die die Ergebnisse verzerren können, zu minimieren. Der Hauptvorteil dieser Techniken besteht darin, dass sie aus biologisch relevanten Primärzellen und frischen Myelinresten bestehen, während die Menge an Spezialgeräten entfällt.

Darüber hinaus können diese Methoden mit einer gewissen Benutzeroptimierung leicht angepasst werden, um eine Vielzahl von Fragen zur Reaktion von Makrophagen aus dem Knochenmark auf Myelintrümmer zu beantworten. Durch die Verwendung sowohl von fluoreszenzmarkierten Myelin-Trümmern als auch von Öl-Rot-O-Färbungen myelinisierter Makrophagen ist es möglich, mögliche therapeutische Interventionen für Patienten mit einer Vielzahl von Neurotraumata zu untersuchen. Das übergeordnete Ziel dieser Arbeit ist die Fernbeseitigung von zellulären Trümmern aus der Ferne, um die Auflösung von Entzündungen zu fördern.