Name: In-vitro- Phagozytose von Myelin Schutt durch Knochenmark stammenden Makrophagen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 27 s
Description: Lernen Sie die Phagozytose von Myelin-Schutt durch Knochenmark-stammende Makrophagen in vitro. Diese Methode ermöglicht die effiziente Analyse immunologischer Reaktionen bei Neurotrauma.

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Die Autoren möchten Glenn Sanger-Hodgson, Medien-Spezialist an der FSU College of Medicine für seine Arbeit in video-Produktion, Bearbeitung und Voice-over zu danken.
Diese Arbeit wurde von der National Institutes of Health (R01GM100474 und R01GM072611) unterstützt.

Die Methoden hier beschrieben und in Abschnitt 2 von der Florida State University institutionelle Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) genehmigt worden und folgt die Vorgaben in der Anleitung zur Pflege und Verwendung von Labortieren,8 Auflage . Alle Tiere, die in diesem in diesem Protokoll verwendeten sind Haus in einem speziellen Labor Tier bis zur Verwendung. Keine in-Vivo -Experimente wurde durchgeführt vor opfern. Tierzahlen beruhten auf experimentelle Notwendigkeit durchschnittliche Zelle und Myelin Sammlungen als Leitfaden verwenden, um die Nutzung zu minimieren.
Hinweis: Dieses Protokoll beschreibt die Generation von Knochenmark stammenden Makrophagen (BMDMs) (Abschnitt 1), die Vorbereitung von Eindringmittel beschrifteten Gehirn abgeleitet Myelin Schutt (Abschnitt 2), das allgemeine Verfahren für die Analyse von Myelin Schutt Phagozytose (Abschnitt 3), und das allgemeine Verfahren für die Analyse der Myelin Schutt Lipid Akkumulation (Abschnitt 4). Reagenz-Vorbereitung, Zelle Ernte und Manipulation, Myelin-Sammlung und Kennzeichnung und Testleistung sollte in einem laminaren Luftstrom Biosafety Kabinett abgeschlossen sein.
1. Generation der primären Knochenmark stammenden Makrophagen
<ol>
	<li>Erstellung von kompletten Makrophagen Kulturmedium (CMCM) Hinweis: Makrophagen-Generation aus dem Knochenmark erfordert den Einsatz von Makrophagen Kolonie-stimulierende Faktor (M-CSF). Dieses Präparat nutzt L929 murine Fibroblasten konditioniert Medien als Quelle für M-CSF.<ol>
		<li>Generieren Sie L929 murine Fibroblasten konditioniert Medien durch Kultivierung Zellen in 145 mm Schalen mit 50 mL des hohen Glukose (4500 mg/L L-Glukose) Dulbecco geändert Eagle Medium (DMEM) für 7 Tage mit 5 % neue geboren Kälberserum (NCS) und Penicillin/Streptomycin ergänzt.</li>
		<li>Sammeln Sie Medien aus Kulturen in 50 mL konische Zentrifuge Röhren und Zentrifuge für 30 Minuten bei 3500 X g, 4 ° C.</li>
		<li>Filtern Sie Überstände durch einen 0,2 µm Spritze Filter in eine neue konische Zentrifugenröhrchen 50 mL. Konditionierte Medien können bis zu 6 Monaten bei-80 ° C aufbewahrt werden.</li>
		<li>Um hohe Glukose DMEM, fügen Sie 5 % Vol/Vol NCS, 15 % Vol/Vol L929 murine Fibroblasten bedingt DMEM und 1 % Penicillin/Streptomycin. Medien können 2-3 Monate bei 4 ° C aufbewahrt werden. Auf 37 ° C vor dem Gebrauch warm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sammlung von primären Knochenmark-Zellen und Makrophagen Induktion 
	Hinweis: Mit diesem Protokoll eine Maus erzeugt etwa 20 Millionen Knochenmark stammenden Makrophagen (BMDMs).<ol>
		<li>Einschläfern Sie die gewünschte Anzahl von 8-10 Wochen alte Mäusen mit CO2 Erstickung Standardrichtlinien durch zervikale Dislokation gefolgt.</li>
		<li>Desinfizieren Sie das Tier mit 70 % Ethanol (Vol/Vol): H2O, das Fell zu sättigen.</li>
		<li>Schneiden Sie eine kleine Öffnung in den Bauch und ziehen Sie vorsichtig wieder die Haut um das darunter liegende Gewebe sichtbar zu machen. Achten Sie darauf, keine Punktion der Bauchhöhle.</li>
		<li>Entfernen Sie beide Hinterbeine an der Hüfte beginnend und endend am Knöchel. Ort der gesammelten Gewebe in eine 100 mm Petrischale mit 5-10 mL sterile Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) ergänzt mit 1 % Penicillin/Streptomycin. 
		Hinweis: Beim Verarbeiten mehrerer Tiere achten, Gerichte auf Eis, Gewebe Abbau zu begrenzen zu halten.</li>
		<li>Entfernen Sie Muskel- und Bindegewebe aus dem Knochen mit einem Skalpell. Nur das Femur und Tibia dienen zur Zellentnahme, die Fibula verworfen werden kann.</li>
		<li>Aussetzen des Knochenmark-Hohlraums der gesammelten Knochen durch einen kleinen Ausschnitt von jedem Ende mit einem Skalpell zu trimmen.</li>
		<li>Mit einer 25g Nadel, spülen Sie das Knochenmark Hohlräume mit CMCM in einem konischen Zentrifugenröhrchen 50 mL. Die Knochen werden weiß angezeigt, sobald sie ausreichend geleert wurden.</li>
		<li>Nach Abschluss der Sammlung agitieren Sie Aspiraten mit einer Nadel 18g für 30-90 s erzeugt eine einzelne Zellsuspension. 
		Hinweis: Ein optionale Erythrozyten (RBC) Lyse Schritt kann zu diesem Zeitpunkt ausgeführt werden. Es wurde vor kurzem vermutet, dass die intrazelluläre Eisengehalt der Auswirkungen von Myelin Schutt auf Makrophagen Polarisation16beeinflussen kann. Informationen über die Einbeziehung von RBC Zerstörung Schritt finden Sie unter Trouplin Et Al. 17.</li>
		<li>Filtern Sie die Aussetzung durch eine 70 µm sterile Zelle Sieb in eine neue konische Zentrifugenröhrchen 50 mL.</li>
		<li>Samen Zellen gleichmäßig in 145 mm Zelle Kultur Speisen mit 15-20 mL CMCM gesammelt. Verwenden Sie ca. drei Kultur Gerichte per Mausklick geopfert. Inkubation bei 37 ° C, 5 % CO2Kulturen.</li>
		<li>Nach 72 Stunden Platten einmal mit sterilen PBS waschen, nicht anhaftende Zellen zu entfernen, fügen Sie dann 15-20mL frische CMCM. Weitere 4 Tage bei 37 ° C, 5 % CO2inkubieren Sie Kulturen. Nach 7 Tagen der gesamten Kultur werden die blutbildenden Knochenmarkzellen zunächst isoliert Reifen BMDMs (Abbildung 1).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Generation von Eindringmittel beschrifteten Brain-Derived Myelin Schutt
Hinweis: Alle Reagenzien können bis zu 1 Monat bei 4 ° C aufbewahrt werden.
<ol>
	<li>Vorbereitung von Myelin Schutt Sammlung Reagenzien
	<ol>
		<li>Tris· vorbereiten CL-Pufferlösung.<ol>
			<li>800mL hinzufügen destilliertem entionisiertem H2O (DdiH2O), 20 mL 1 M Tris· CL, pH 7,45 (20 mM Endkonzentration) und 20 mL 100 mm Na2EDTA (2 mM Endkonzentration).</li>
			<li>Stellen Sie ein pH-Wert um 7.45 Uhr. Stellen Sie die Lautstärke auf 1000 mL mit DdiH2O. Filter-Lösung durch einen 0,2 µm Filtrationseinheit.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Bereiten Sie 1 M Saccharoselösung.<ol>
			<li>Auf 100 mL Tris· CL Puffer-Lösung, fügen Sie 68,46 g Saccharose. Lautstärke auf 200 mL mit Tris· CL-Pufferlösung. Filtern Sie die Lösung durch eine Filteranlage von 0,2 µm.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Bereiten Sie 200 mL von 0,32 M Saccharose-Lösung durch Verdünnung der Lösung 1 M mit der Tris· CL-Puffer-Lösung 0.83:0.16 (Vol/Vol).</li>
		<li>Bereiten Sie 150 mL 0,83 M Saccharose-Lösung durch Verdünnung der Lösung 1 M mit der Tris· CL-Puffer-Lösung 0.83:0.16 (Vol/Vol).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sammlung von Brain-derived Rohöl Myelin Schutt 
	Hinweis: Die hier beschriebene Methode der Sammlung ist für die Isolierung von Rohöl Myelin Schutt.<ol>
		<li>Einschläfern Sie 10-12 Mäuse 8-10 Wochen alt mit CO2 Erstickung Standardrichtlinien gefolgt von zervikale Dislokation.</li>
		<li>Sezieren Sie die Gehirne zu und legen Sie sie in eine 100 mm Schale mit 10 mL von 0,32 M Saccharoselösung.</li></ol></li></ol>Halten Sie die Schüssel auf dem Eis.
		<li>Mit sterile chirurgische Schere schneiden die Gehirne in Stücke ca. 5 mm3 in der Größe.</li>
		<li>Übertragen Sie das Gewebe auf einer konischen Zentrifugenröhrchen 50 mL und ca. 30 mL 0,32 M Saccharoselösung.</li>
		<li>Homogenisieren Sie mit einer sterilen Handheld rotary Homogenisator, bis eine glatte Lösung erreicht ist.</li>
		<li>Verdünnen Sie die homogenisierte Gehirne zu einem Endvolumen von 90 mL mit 0,32 M Saccharoselösung.</li>
		<li>Hinzugeben Sie auf sechs 38,5 mL dünnwandigen Polypropylen Ultrazentrifugen Rohre 20 mL 0,83 M Saccharoselösung.</li>
		<li>Fügen Sie sanft die homogenisierte Gehirn-Lösung an die Spitze der 0,83 M Saccharoselösung, kümmert sich nicht um die beiden Schichten zu mischen.</li>
		<li>Jedes Rohr mit den 0,32 M Saccharoselösung auszugleichen.</li>
		<li>Zentrifuge bei 100.000 x g 45 min bei 4° C mit einer geeigneten vorgekühlt Ultrazentrifugen Rotor. Setzen Sie Rotor Beschleunigungs- und Verzögerungswerte auf ihre minimale Werte um Myelin Schutt zu reduzieren.</li>
		<li>Sammeln Sie die Myelin-Trümmer von der Schnittstelle der beiden Saccharose dichten. 
		Hinweis: Schutt erscheint als ein weißes Band in Richtung der Mitte des Rohres.</li>
		<li>Kombinieren Sie die grobe Myelin Trümmer in eine konische Zentrifugenröhrchen 50 mL und stellen Sie die Lautstärke auf ca. 35 mL mit Tris· CL-Pufferlösung.</li>
		<li>Die grobe Myelin Trümmer mit einem sterilen Handheld rotary Homogenisator für 30-60 s zu homogenisieren.</li>
		<li>Unterteilen Sie gleichmäßig den Schwebezustand zwischen 6 saubere Ultrazentrifugen Rohre und Balance mit einem entsprechenden Volumen des Tris· CL-Pufferlösung.</li>
		<li>Zentrifuge bei 100.000 x g 45 min bei 4° C mit einer geeigneten vorgekühlt Ultrazentrifugen Rotor. Rotor Beschleunigungs- und Verzögerungswerte auf ihre maximale Werte einstellen</li>
		<li>Als feste weiße Pellets jetzt sichtbar sein werden, verwerfen Sie den Überstand und wieder auszusetzen Sie, die Pellets in 10-15 mL Tris· CL-Pufferlösung.</li>
		<li>Unterteilen Sie gleichmäßig den Schwebezustand zwischen 2 sauber Ultrazentrifugen Röhren und Balance mit einem entsprechenden Volumen des Tris· CL-Pufferlösung.</li>
		<li>Zentrifuge vorgekühlt wieder bei 100.000 x g 45 min bei 4 ° C mit einer geeigneten Ultrazentrifugen Rotor. Rotor Beschleunigungs- und Verzögerungswerte auf ihre maximale Werte einstellen</li>
		<li>Verwerfen Sie den Überstand und Aufschwemmen Sie der Pellets in 5-6 mL sterile PBS und teilen Sie den Schwebezustand zwischen einer angemessenen Zahl von vorgewogene 1,5 mL Mikro-Zentrifuge Röhren.</li>
		<li>Zentrifuge bei 22.000 x g für 10 min bei 4 ° C.</li>
		<li>Verwerfen Sie den Überstand und bestimmen Sie das Gewicht der Myelin-Schutt-Pellets.</li>
		<li>Wieder aussetzen Sie, die Pellets in PBS, eine Endkonzentration von 100 mg/mL. 
		Hinweis: zehn bis zwölf Gehirne ist genug, um 10-15 mL 100 mg/mL Myelin Schutt zu produzieren. Myelin Trümmer kann Speicher bei-80 ° C für 6 Monate sein.</li>
	
	
	<li>Myelin Schutt fluoreszierende Kennzeichnung
	<ol>
		<li>Bereiten Sie die 50 µM Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester (CFSE) Lösung unmittelbar vor der Anwendung.<ol>
			<li>Verwendung von sterilen PBS verdünnen Sie eine 5 mM-Stammlösung von CFSE-mit 100 % Dimethyl Sulfoxid (DMSO), eine Endkonzentration von Arbeiten von 50 µM vorbereitet.</li>
			<li>Filtern Sie Lösung durch einen 0,2 µm Spritze Filter.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Tauen Sie die gewünschte Menge von 100 mg/mL Myelin Schutt und erneut mit einer sterilen 29 g Nadel auszusetzen. 
		Hinweis: Einfrieren den Myelin-Schutt wird dazu führen, dass aus der Lösung erfordern Wiederfreisetzung vor Gebrauch fallen.</li>
		<li>Übertragen Sie Myelin Schutt auf eine vorgewogene 1,5 mL Mikro-Zentrifugenröhrchen.</li>
		<li>Zentrifuge bei 14.800 x g für 10 min bei 4° C. Verwerfen Sie den überstand.</li>
		<li>Aufzuwirbeln Sie die Myelin-Trümmer in 200 µL der CFSE-Lösung pro 100 µL Myelin Schutt pelleted.</li>
		<li>Inkubieren Sie für 30 min bei Raumtemperatur (RT) vor Licht geschützt werden.</li>
		<li>Zentrifuge bei 14.800 x g für 10 min bei 4 ° C. Verwerfen Sie den überstand.</li>
		<li>Das Pellet in 600-800 µL Waschpuffer Aufschwemmen (0,2 µm-Filter sterilisiert 100 mM Glycin mit PBS-Puffer).</li>
		<li>Zentrifuge bei 14.800 x g für 10 min bei 4 ° C. Verwerfen Sie den überstand.</li>
		<li>Wiederholen Sie die Schritte 2.3.8-2.3.9 zweimal mehr.</li>
		<li>Bestimmen Sie nach der letzten Wäsche, das Gewicht des Pellet-Myelin Schutt und wieder auszusetzen Sie bis 100 mg/mL mit sterilen PBS. Bemerkung: Beschriftete Myelin Schutt kann Shop bei-80 ° C für bis zu 6 Monaten.</li>
	</ol>
	</li>

(3) Myelin Schutt Phagozytose Assay
Hinweis: Im folgenden ist die grundlegende Methode zur Beobachtung von Phagozytose Eindringmittel beschrifteten Myelin Schutt. Zusatz von anderen Behandlungen und experimentellen Bedingungen wird durch den Prüfarzt optimiert werden müssen.
<ol>
	<li>Vorbereitung der Behandlung Platten
	<ol>
		<li>Für jede Platte 145 mm Reifen BMDMs in eine 15 mL konische Zentrifugenröhrchen mit 5-6 mL 10 mM Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA) in Dulbeccos Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (dPBS) (pH 7,4) sammeln. 
		Hinweis: Verwenden Sie Trypsin nicht, da es den Aktivierungsstatus der Zellen18verändern kann.</li>
		<li>Jedes Rohr gesammelt Zellen ein gleiches Volumen des vorgewärmten CMCM hinzufügen.</li>
		<li>Zentrifuge bei 180 X g für 8 min bei 20 ° C. Verwerfen Sie den überstand.</li>
		<li>Wieder aussetzen Sie Zellen in CMCM und Count.</li>
		<li>Fügen Sie in jede Vertiefung einer 24-Well-Zelle-Kultur-Platte 1 x 105 Zellen in 1 mL der CMCM hinzu.</li>
		<li>Inkubation bei 37 ° C, 5 % CO2 für 24 h.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Myelin Schutt Behandlung und Analyse
	<ol>
		<li>Fügen Sie 10 µL von 100 mg/mL CFSE Myelin Schutt in jede Vertiefung (1 mg/mL Endkonzentration) beschriftet.</li>
		<li>1-3 Stunden bei 37 ° C, 5 % CO2inkubieren.</li>
		<li>Waschen Sie die Platte 3 Mal mit sterilen PBS, nicht verschlungen Myelin Ablagerungen zu entfernen.</li>
		<li>400 µL 4 % Paraformaldehyd in jede Vertiefung hinzufügen. 30 min bei RT inkubieren</li>
		<li>Waschen Sie Platte 2 Mal mit sterilen PBS.</li>
		<li>Jedes gut 400 µL Hoechst 33258 Lösung hinzufügen. Inkubieren Sie für 5 min bei RT vor Licht geschützt werden.</li>
		<li>Waschen Sie Platten 2 Mal mit sterilen PBS.</li>
		<li>Fügen Sie 200 µL Fluoro-Gel mit Tris-Puffer in jede Vertiefung, Immunofluoreszenz zu reduzieren.</li>
		<li>Zellen mit einem inversen Epi-Leuchtstofflampen in der Lage, Mikroskop. 
		Hinweis: Die Anregung und Emission Wellenlängen des CFSE-sind 494 nm und 521 nm, beziehungsweise.</li>
		<li>Teilen Sie die Anzahl der CFSE-positive Zellen durch die Anzahl der Nukleonen relative Myelin Schutt Aufnahme zu bestimmen.</li>
		<li>Pflegen Sie vor der Bildgebung Platten für bis zu 7 Tage bei 4 ° C, vor Licht geschützt.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
(4) Quantifizierung der intrazellulären Lipide über Öl Färbung rot-O
Hinweis: Im folgenden ist die grundlegende Methode zur Beobachtung von intrazellulären Myelin-Schutt-derived Lipide.Die Verwendung von CFSE beschriftet Myelin Schutt empfiehlt sich nicht für fluoreszierende Quantifizierung von ORO Färbung durch spektrale Überlappung. Zusatz von anderen Behandlungen und experimentellen Bedingungen wird durch den Prüfarzt optimiert werden müssen.
<ol>
	<li>Vorbereitung der Färbung Lösungen
	<ol>
		<li>0,5 % Öl rot-O (ORO) Färbelösung vorzubereiten.<ol>
			<li>Fügen Sie langsam 100 mL 100 % Propylenglykol (1,2-Propandiol) bis 0,5 g Oro (1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol) unter Rühren.</li>
			<li>Erhitzen Sie die Lösung bei 95 ° C für 15 Minuten oder bis alle große Partikel aufgelöst haben. 
			Hinweis: nicht erhitzen über 100 ° C.</li>
			<li>Lösung durch ein Stück Filterpapier während noch warm in einen neuen Container zu filtern.</li>
			<li>Lassen Sie zu, dass Lösung kühlen über Nacht bei RT-Lösung für bis zu 1 Jahr bei RT aufbewahrt werden können</li>
		</ol>
		</li>
		<li>85 % Propylenglykol Lösung ansetzen.<ol>
			<li>15 mL DdiH2O. rühren, bis gemischt fügen Sie 85 mL 100 % Propylenglykol hinzu. Lösung kann bis zu 1 Jahr bei RT gelagert werden</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Vorbereitung der Behandlung Platten
	<ol>
		<li>Bereiten Sie eine 24-Well-Platte nach der in Abschnitt 3 beschriebenen Methode.</li>
		<li>Inkubation bei 37 ° C, 5 % CO2 für 24 h.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Myelin Schutt Behandlung
	<ol>
		<li>Fügen Sie 10 µL von 100 mg/mL Myelin Schutt in jede Vertiefung (1 mg/mL Endkonzentration).</li>
		<li>1-3 h bei 37 ° C, 5 % CO2inkubieren.</li>
		<li>Waschen Sie die Platte 3 Mal mit sterilen PBS, nicht verdaut Myelin Ablagerungen zu entfernen. Hinweis: An dieser Stelle Platten können entweder sofortige Fixierung unterziehen oder frische CMCM kann hinzugefügt werden, und Zellen nach Inkubation für zusätzliche Zeitpunkte zurück.</li>
		<li>400 µL 4 % Paraformaldehyd in jede Vertiefung hinzufügen. 30 min bei RT inkubieren</li>
		<li>Waschen Sie die Platte 2 Mal mit sterilen PBS dann Handlungsschritte zu beflecken.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>ORO Färbung und Analyse
	<ol>
		<li>Waschen Sie feste Platte mit DdiH2O. 3 Mal</li>
		<li>400 µL 100 % Propylenglykol in jede Vertiefung hinzufügen und 5 min bei RT inkubieren 
		Hinweis: Dies reduziert die Übertragung von DdiH2O.</li>
		<li>Aspirieren Sie das Propylenglykol und jedes gut fügen Sie 400 µL ORO-Lösung hinzu.</li>
		<li>8 min bei 60 ° c inkubieren</li>
		<li>Aspirieren Sie die ORO-Lösung. Dann fügen Sie 400 µL von 85 % Propylenglykol in jede Vertiefung und 5 Minumintes bei RT inkubieren</li>
		<li>Waschen der Platte 3 Mal mit DdiH2O.</li>
		<li>Jedes gut 400 µL Hoechst 33258 Lösung hinzufügen. Inkubieren Sie für 5 min bei RT, vor Licht geschützt werden.</li>
		<li>Waschen Sie Platten 2 Mal mit sterilen PBS.</li>
		<li>Fügen Sie 200 µL Fluoro-Gel mit Tris-Puffer in jede Vertiefung.</li>
		<li>Zellen mit einem inversen Epi-Leuchtstofflampen in der Lage, Mikroskop. ORO kann mit einem standard Texas Red oder DsRed Filtersatz abgebildet werden.</li>
		<li>Quantifizieren Sie relative Lipid Aufbewahrung durch Bestimmung der ORO positiven Bereichs in jedem Bildfeld und dividiert sie durch die Anzahl der Nukleonen.</li>
		<li>Pflegen Sie Platten für 7 Tage bei 4 ° C vor Licht geschützt.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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Die Autoren haben keine Angaben.

Die hier beschriebenen Verfahren nutzen frisch isolierte Rohöl CNS Myelin Schutt und primäre Knochenmark stammenden Makrophagen. Um tierische Ausgaben zu reduzieren, empfehlen wir, die beiden Gehirne und Knochenmarkzellen von jeder Maus zum Zeitpunkt des Opfers geerntet werden. Zwei Forscher gemeinsam können beide Materialien gleichzeitig zubereiten. Alternativ können Gehirne bei-80 ° C in PBS mit Antibiotika vor dem Myelin Schutt Isolierung ergänzt gespeichert werden. Es ist gewesen, dass unsere Erfahrung, die Gehirne u...

Knochenmark stammenden Makrophagen (BMDMs) sind ein wichtiges Bindeglied zwischen der angeborenen und der adaptiven Immunsystem. Als antigenpräsentierende Zellen (APCs) sie können mit Lymphozyten über beide Antigenpräsentation kommunizieren und Cytokine release1,2,3. Ihre primäre Funktion ist jedoch als professionelle Phagozyten, Krankheitserreger, gealterten Zellen und Zelltrümmer1,4löschen. Nach einer Rückenmarksverletzung ("SCI") ist verantwortlich für CNS Axon Myelinisierung5Zelltyp erhebliche Mengen von Myelin Schutt von sterbenden Oligodendrozyten generiert. Wir und andere haben gezeigt, dass Clearance von Myelin Schutt in erster Linie die Verantwortung der Infiltration BMDMs5,6,7. Allerdings wurde in Verletzung des Rückenmarks Websites Engulfment von Myelin Schutt vorgeschlagen, diese normalerweise entzündungshemmenden Zellen auf einer Pro-entzündliche Zustand5,8,9verschoben. Als wichtige Vermittler von Neuroinflammation im verletzten Rückenmark sind BMDMs wichtige klinische Ziele.
Um den Einfluss der BMDMs im verletzten Rückenmark untersuchen zu helfen, haben wir eine in-Vitro -Modell, um direkt zu studieren, wie BMDMs auf Myelin Schmutz reagieren entwickelt. Zur Verbesserung der biologischen Relevanz sind primären murinen BMDMs und frisch isolierte Myelin Ablagerungen in diesen Untersuchungen verwendet. Als solche, die hier vorgestellten Methoden auch detailliert die Isolation und die Kultur der primären murinen BMDMs und eine modifizierte Saccharose gradient Technik, murine CNS isolieren abgeleitet Myelin Schutt10,11,12. Myelin Schmutz kann leicht beschriftet werden, mit einem Fluoreszenzfarbstoff Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester (CFSE-), zu verfolgen, die die Internalisierung von BMDMs. CFSE-für diese Anwendung geeignet ist, denn es ist nicht zytotoxisch und seine schmalen Fluoreszenzspektrum Genehmigungen Multiplexen mit anderen fluoreszierende Sonden13,14. Nach Phagozytose Myelin Schutt Lipide sind durch den Lysosomen transportiert und als neutralen Lipiden in intrazellulären Lipid Tröpfchen5verpackt. Um diese intrazellulären Lipid-Ansammlung zu quantifizieren, präsentieren wir ein Öl rot O (ORO) Färbung Methode optimiert für quantitative Bildanalyse. Diese einfache Färbung Methode produziert robuste reproduzierbare Ergebnisse und Quantifizierung15. Diese Methoden ermöglichen die Untersuchung von Myelin Schutt Phagozytose und Lipid-Aufbewahrung mit begrenzten Spezialausrüstung.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30243.01</td><td>Hoher Glukosegehalt mit L-Glutamin, Natriumpyruvat</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin-Lösung</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td>100X Solution</td></tr><tr><td>New Born Calf Serum (NCS)</td><td>Rocky Mountain Biologics</td><td>NBS-BBT-5XM</td><td>USA Herkunft</td></tr><tr><td>NCTC-Klon 929 [L-Zelle, L-929, Derivat des Stammes L]&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>CCL-1</td><td>L929 Zelllinie mit konditionierten Medien Vorbereitung</td></tr><tr><td>24-Well-Zellkulturplatten</td><td>VWR</td><td>10062-896&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Zellkulturschale</td><td>Greiner Bio-One</td><td>639960</td><td>Polystyrol, 145/20mm</td></tr><tr><td>CFSE Zellproliferationskit</td><td>Thermo Fisher</td><td>C34570</td><td>DMSO zur Rekonstitution</td></tr><tr><td>Bereitgestellt Fluor-Gel mit Tris-Puffer&nbsp;</td><td>Elektronenmikroskopie Wissenschaften</td><td>17985-11</td><td></td></tr><tr><td>Öl Rot O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>O0625</td><td></td></tr><tr><td>Ausrüstung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Materialien<</td><td>>Unternehmen</td><td><>Katalognummer</td><td><>Kommentare</td></tr><tr><td>Ultrazentrifugenröhrchen</td><td>Beckman Coulter</td><td>326823</td><td>Dünnwand, Polypropylen, 38,5 mL, 25 x 89 mm</td></tr><tr><td>SW 32 Ti Ultrazentrifuge Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>369650</td><td>SW 32 Ti Rotor, Ausschwingschaufel, Titan</td></tr><tr><td>Handheld Rotationshomogenisator</td><td>Fisher Science</td><td>08-451-71</td><td></td></tr></tbody></table>

in-vitro- phagozytose von myelin schutt durch knochenmark stammenden makrophagen

In Vitro Phagocytosis of Myelin Debris by Bone Marrow-Derived Macrophages

Knochenmark stammenden Makrophagen (BMDMs) sind reife Leukozyten, die eine wichtige physiologische Rolle als professionelle Phagozyten in der Lage, der clearing-einer Vielzahl von Teilchen dienen. Normalerweise BMDMs werden daran gehindert, das zentrale Nervensystem (ZNS), aber nach einer Verletzung können sie ohne weiteres zu infiltrieren. Einmal eignen sich in das verletzte Gewebe CNS, BMDMs Primärzelle verantwortlich für die Abfertigung von Verletzungen abgeleitet Zelltrümmer, einschließlich große Mengen an Lipid reichen Myelin Schutt. Die neuropathologische Auswirkungen BMDM Infiltration und Myelin Schutt Phagozytose innerhalb des ZNS sind komplex und nicht gut verstanden. Die hier beschriebenen Protokolle ermöglichen die direkten in-vitro- Untersuchung der BMDMs im Rahmen der CNS Verletzung. Wir decken murinen BMDM Isolierung und Kultur, Myelin Schutt Vorbereitung und Tests um BMDM Myelin Schutt Phagozytose zu beurteilen. Diese Techniken robuste quantifizierbare Ergebnisse ohne signifikante spezialisierte Geräte oder Materialien zu produzieren, aber können leicht angepasst werden, um die Bedürfnisse der Forscher.

Behandlung von BMDMs mit CFSE beschriftet Myelin Ablagerungen sollten klare Internalisierung (Abbildung 2) ergeben. Während eine 3-stündigen Interaktionszeit für BMDMs, genügend zusätzlichen Myelin Schutt für robuste nachgelagerten Erkennung phagozytieren ausreicht, kann mit weniger als 1 Stunde von Interaktion intrazelluläre Akkumulation beobachtet werden. Jedoch kann einige Myelin Trümmer nach dem Waschen immer noch auf der Zelloberfläche vorhanden sein. Dies ist möglicherweise aufgrund vo...

Wir präsentieren Ihnen Methoden, um die phagocytic Fähigkeit der primären murinen Knochenmark stammenden Makrophagen mit Gewebekulturen beschrifteten Myelin Schutt und intrazellulären Lipid Droplet Färbung bewerten.

In-vitro- Phagozytose von Myelin Schutt durch Knochenmark stammenden Makrophagen

Bone marrow-derived macrophages (BMDMs) are mature leukocytes that serve a critical physiological role as professional phagocytes capable of clearing a ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, die aus dem Knochenmark gewonnene Makrophagen-Phagozytose von Myelin-Trümmern aus dem Gehirn zu beurteilen. Dieses Protokoll wurde entwickelt, um Schlüsselfragen auf dem Gebiet des Neurotraumas zu beantworten. Der Vorteil dieser Methode besteht darin, dass sie eine effiziente und relativ kostengünstige Analyse der Makrophagenreaktionen in vitro ermöglicht, insbesondere der phagozytischen Kapazität von Makrophagen aus dem Knochenmark auf Myelintrümmer.Diese Methode kann leicht angepasst werden, um die Auswirkungen externer Modulatoren zu untersuchen. Nachdem Sie die Maus mit 70% Ethanol gesättigt haben, machen Sie eine Öffnung in der Bauchhaut. Ziehe die Haut zurück, um die Beine zum Sezieren freizulegen.Achten Sie darauf, die Bauchhöhle während dieses Vorgangs nicht zu punktieren. Sobald sie freiliegen, entfernen Sie die Beine, indem Sie am Knöchel und an der Hüfte schneiden. Legen Sie die Beine in eiskaltes PBS, das mit Antibiotika versetzt ist.Wiederholen Sie dies für das andere Bein. Waschen Sie das Tuch in frischem, eiskaltem PBS, das mit Antibiotika versetzt wurde, um alle Partikel zu entfernen, die während der Dissektion am Gewebe haften geblieben sein könnten. Eine sanfte Schabebewegung, die am Muskel angewendet wird, löst einen Großteil des unerwünschten Gewebes.Befreien Sie mit Skalpell und Pinzette das Schienbein vom Muskel- und Bindegewebe. Sobald du dich befreit hast, entferne beide Enden, um die Markhöhle freizulegen. Wiederholen Sie diesen Vorgang für den Oberschenkelknochen.Befestigen Sie eine 25-Gauge-Nadel an einer 20-Millimeter-Spritze, die mit vollständigem Makrophagenmedium aus dem Knochenmark gefüllt ist. Spülen Sie dann die Knochenmarkhöhle. Der Knochen erscheint weiß, wenn er ausreichend gerötet ist.Die gesammelten Knochenmarkaspirate werden mit einer 18-Gauge-Nadel 30 bis 90 Sekunden lang gerührt, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten. Anschließend wird die Suspension durch ein steriles Zellsieb mit einer Porengröße von 70 Mikrometern geleitet. Die Zellsuspensionen gleichmäßig in 145 Zentimeter große Zellkulturschalen verteilen.Jede Maus bietet genug für insgesamt drei Gerichte. Nach siebentägiger Kultivierung sind diese Schalen in der Regel zwischen 70 und 80 % konfluent mit reifen Makrophagen. Um rohe Myelintrümmer aus dem Gehirn zu isolieren, wird eine Reihe von Saccharosegradienten-Ultrazentrifugationsschritten durchgeführt.Zu Beginn werden 10 bis 12 Gehirne von Mäusen im Alter von acht bis 10 Wochen seziert. Die Gehirne werden dann in 0,32 molaren Saccharoselösung homogenisiert und dann auf ein 0,383 molare Saccharoselösungskissen geschichtet, um einen diskontinuierlichen Gradienten zu erzeugen. Nach der Zentrifugation befinden sich die rohen Myelinreste an der Grenzfläche zwischen den Schichten.Diese wird gesammelt und in eine Tris-Pufferlösung abgegeben und erneut zentrifugiert, um die Myelinreste zu pelletieren. Das Pellet wird wieder in Tris-Pufferlösung suspendiert und auf zwei Röhrchen aufgeteilt, um eine zusätzliche Zenetrifugation zu ermöglichen. Entfernen Sie zunächst das gesamte Gehirn und legen Sie es in eine Schüssel mit eiskalter 0,32 molaren Saccharoselösung.Schneiden Sie die gesammelten Gehirne mit einer sterilen chirurgischen Schere in etwa fünf Millimeter große Stücke. Dieser Schritt hilft beim anschließenden Homogenisierungsprozess. Sammle das Gewebe in ein 50-Milliliter-Röhrchen.Homogenisieren Sie das Gewebe mit einem rotierenden Homogenisator zu einer glatten Aufschlämmung. Stellen Sie sicher, dass alle großen sichtbaren Festkörper des Gehirns gründlich homogenisiert wurden. In ein Ultrazentrifugenröhrchen mit 20 Millilitern 0,83 molare Saccharoselösung geben und homogenisieren, wobei darauf zu achten ist, dass die Trennung aufrechterhalten wird.Balancieren Sie jedes Röhrchen vorsichtig mit der 0,32 molaren Saccharoselösung. Wenn Sie fertig sind, geben Sie die Röhrchen in einen geeigneten Zentrifugenrotor und drehen Sie sie 45 Minuten lang bei 100.000-facher Schwerkraft und vier Grad Celsius. Stellen Sie sicher, dass Beschleunigung und Verzögerung auf die Mindestwerte eingestellt sind.Sobald die Zentrifugation abgeschlossen ist, werden die Myelintrümmer zwischen der Grenzfläche der Saccharosedichte sichtbar sein. Sammeln Sie vorsichtig die Myelinreste. Nach dem Sammeln fügen Sie Tris-Puffer zu den Myelin-Trümmern hinzu.Homogenisieren Sie erneut mit einem rotierenden Homogenisator. Teilen Sie das Homogenat auf sechs saubere Ultrazentrifugenröhrchen auf und balancieren Sie die Röhrchen nach Bedarf mit zusätzlichem Tris-Puffer aus. Zentrifugieren Sie die gesammelten Myelintrümmer erneut bei der 100.000-fachen Schwerkraft, vier Grad Celsius für 45 Minuten, wobei Beschleunigung und Verzögerung auf ihre Maximalwerte eingestellt werden.Nach der Zentrifugation wurde das Myelin pelletiert. Mit dem Tris-Puffer das Pellet resuspendieren. Kombinieren Sie die Resuspensionen und die Ultrazentrifuge erneut.Nach der Zentrifugation bildet sich ein dicht gepacktes Pellet. Dekantieren Sie das Übergeborene. Resuspendieren Sie das Pellet in sterilem PBS.Teilen Sie die resuspendierten Myelinreste gleichmäßig in vorgewogene Mikrozentrifugenröhrchen auf. Nach 10-minütiger Zentrifugation bei 22.000-facher Schwerkraft das PBS-Supernat entfernen. Nach dem Wiegen des Pellets auf eine Konzentration von 100 Milligramm pro Milliliter mit PBS resuspendieren.Die dabei entstehenden rohen Myelin-Trümmer eignen sich nun für die Untersuchung der Phagozytose. Die CFSE-Markierung von Myelintrümmern kann verwendet werden, um die frühe Internalisierung sowie den intrazellulären Transport zu verfolgen. Unmarkierte Myelintrümmer sind mit der Oil Red-O-Lipidfärbung kompatibel, um die Speicherung und den Stoffwechsel der internalisierten Lipide zu beurteilen.Wenn Sie Myelinreste verwenden, die bei minus 80 Grad Celsius gelagert wurden, sollten Sie zuerst mit einer 29-Gauge-Nadel resuspendieren. Resuspendieren Sie 10 Milligramm pelletierte Myelinreste in 200 Mikrolitern PBS. Fügen Sie dann zwei Mikroliter fünf-millimolare CFSE-Lösung hinzu.Pipette zum Mischen. Nach einer 30-minütigen Inkubation, geschützt vor Licht und anschließendem Waschen, resuspendieren Sie die Myelintrümmer mit PBS auf 100 Milligramm pro Milliliter. Nach der Kultur und Fixierung mit 4 % Paraformaldehyd 100 % Propylenglykol in jede Vertiefung geben.Nach fünfminütiger Inkubation bei Raumtemperatur geben Sie in jede Vertiefung Oil Red-O-Färbelösung. Acht Minuten lang bei 60 Grad Celsius unter leichtem Rühren inkubieren. Kippen Sie die Platte vorsichtig, damit der Oil Red-O-Fleck vollständig abgesaugt werden kann.Zu jeder Vertiefung 85% Propylenglykol hinzufügen. Nach fünfminütiger Inkubation bei Raumtemperatur waschen Sie die Vertiefungen mit PBS und färben Sie die Zellen mit einem Kernfarbstoff Ihrer Wahl. Repräsentative lichtmikroskopische Aufnahmen von Knochenmarkzellen während der Kultur.24 Stunden nach der ersten Aussaat sind nur wenige adhärente Zellen vorhanden. In Gegenwart des Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktors M-CSF beginnen die Leukozyten-Vorläuferzellen jedoch eine Differenzierung zu durchlaufen. Nach siebentägiger Kultivierung in Gegenwart von M-CSF sind die Vorläuferzellen vollständig zu reifen Makrophagen aus dem Knochenmark differenziert, die zur Phagozytose fähig sind.Mit dieser Methode liefert eine einzelne acht bis 10 Wochen alte C57-Black-6J-Maus in der Regel 18 bis 24 Millionen Knochenmarkmakrophagen. Um die Internalisierung sichtbar zu machen, werden CFSE-markierte Myelin-Trümmer zu Makrophagenkulturen aus dem Knochenmark hinzugefügt. Die Zellen wurden eine Stunde lang mit einem Milligramm pro Milliliter CFSE-markierten Myelin-Trümmern behandelt, bevor sie gewaschen und mit 4 % Paraformaldehyd fixiert wurden.Interinternalisierte Myelintrümmer können mit Standard-GFP-Filtersets an einem epifluoreszenzfähigen Mikroskop sichtbar gemacht werden. Um zu zeigen, wie sich die Myelinlipidakkumulation im Laufe der Zeit verändert, wurden Makrophagen 90 Minuten lang mit unmarkierten Myelinresten behandelt, dann gewaschen und zu verschiedenen Zeitpunkten fixiert. Unmittelbar nach dem Waschen sind nur wenige Lipidtröpfchen sichtbar.Im Laufe der Zeit werden jedoch mehr Lipidtröpfchen sichtbar, die etwa 24 Stunden nach dem Waschen ein Maximum erreichen. Makrophagen beginnen mit dem Stoffwechsel für den Ausfluss zu den Lipidspeichern, wodurch die Anzahl der färbbaren Tröpfchen reduziert wird. Um die Ölrot-O-Färbung zu quantifizieren, wurden fünf zufällig erhaltene Bilder von jeder Probe zu einem bestimmten Zeitpunkt mit einem epifluoreszenzfähigen Mikroskop aufgenommen.Das mit Oil Red-O gefärbte Gebiet wurde für jedes Bohrloch anhand von Bildern bestimmt, die im DsRed-Kanal aufgenommen wurden. Die Gesamtzahl der Zellen wird bestimmt, indem die Anzahl der in jedem Feld vorhandenen Zellkerne gezählt wird. Diese Grafik zeigt die resultierende Quantifizierung.Typisch ist ein stetiger Anstieg des Oil Red-O-positiven Signals, da die aus dem Knochenmark stammenden Makrophagen internalisierte Myelinlipide in neutrale Lipide umwandeln. Eine Abnahme des Oil Red-O-positiven Signals folgt dem Höhepunkt nach 24 Stunden, wenn Makrophagen beginnen, die Lipide zu verstoffwechseln oder auszuscheiden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie eine gute Vorstellung davon haben, wie Sie primäre Makrophagen aus dem Knochenmark isolieren und kultivieren und wie Sie ihre Wechselwirkung mit frisch isolierten Myelinresten aus dem Gehirn untersuchen können.Der wichtigste Teil dieser Verfahren ist die ordnungsgemäße Wartung der aseptischen Technik zu jeder Zeit. Da Makrophagen robust auf kleine Mengen von pathogenassoziierten Molekülen reagieren können, ist es wichtig, mögliche Wechselwirkungen, die die Ergebnisse verzerren können, zu minimieren. Der Hauptvorteil dieser Techniken besteht darin, dass sie aus biologisch relevanten Primärzellen und frischen Myelinresten bestehen, während die Menge an Spezialgeräten entfällt.Darüber hinaus können diese Methoden mit einer gewissen Benutzeroptimierung leicht angepasst werden, um eine Vielzahl von Fragen zur Reaktion von Makrophagen aus dem Knochenmark auf Myelintrümmer zu beantworten. Durch die Verwendung sowohl von fluoreszenzmarkierten Myelin-Trümmern als auch von Öl-Rot-O-Färbungen myelinisierter Makrophagen ist es möglich, mögliche therapeutische Interventionen für Patienten mit einer Vielzahl von Neurotraumata zu untersuchen. Das übergeordnete Ziel dieser Arbeit ist die Fernbeseitigung von zellulären Trümmern aus der Ferne, um die Auflösung von Entzündungen zu fördern.

in-vitro-phagocytosis-myelin-debris-bone-marrow-derived

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Makrophagen sind seit langem als eine kritische Komponente der angeborenen und erworbenen Immunantworten erkannt. Die jüngste Explosion des Wissens im Zusammenhang mit evolutionären, genetischen und biochemischen Aspekte der Interaktion zwischen Makrophagen und Mikroben hat die wissenschaftliche Aufmerksamkeit auf Makrophagen erneuert. Dieser Artikel beschreibt eine Methode, um Makrophagen aus Knochenmark der Maus zu unterscheiden.

Knochenmark-abgeleiteten Makrophagen-Produktion

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

Studium der Biogenese Phagolysosom im Live-Makrophagen

Wir beschreiben, wie Makrophagen C. visualisieren neoformans (Cn) Interaktionen in Echtzeit, wobei ein besonderer Schwerpunkt auf den Prozess der nicht-lytischen Exozytose mit digitalen Lichtmikroskopie. Unter Verwendung dieser Technik einzeln infizierten Makrophagen untersucht, um verschiedene Aspekte dieses Phänomens festzustellen ist.

Visualisierung nichtlytischen Exozytose Cryptococcus neoformans Von Makrophagen mit digitalen Lichtmikroskopie

Hier präsentieren wir ein Protokoll Mikroglia aus postnataler Maus Welpen (Tag 1) für in - vitro - Experimente zu isolieren. Diese improvisierte Isolierungsmethode erzeugt sowohl hohe Ausbeute und Reinheit, einen bedeutenden Vorteil gegenüber alternativen Methoden, die für die Zwecke der Erläuterung Mikroglia biology breites Spektrum Experimente ermöglicht.

Schnelle und Refined CD11b Magnetic Isolierung von primären Mikroglia mit erhöhter Reinheit und Vielseitigkeit

Wir beschreiben hier eine einfache und schnelle Methode zur Isolierung von Salmonella Typhimurium-mit Phagosom von Makrophagen durch die Beschichtung der Bakterien mit Biotin und Streptavidin.

Isolierung von Salmonella Typhimurium-mit Phagosom von Makrophagen

Hier beschreiben wir Methoden mit Spinning Disk konfokalen Mikroskopie zu Bild phagocytic Einzelveranstaltungen durch Maus resident peritonealen Makrophagen. Die Protokolle können auf andere phagocytic Zellen ausgedehnt werden.

Time-Lapse 3D-Bildgebung der Phagozytose durch Makrophagen der Maus

Neurodegenerative Erkrankungen sind mit dysregulierten Mikrogliafunktionen verbunden. Dieser Artikel beschreibt einen In-vitro-Assay der Phagozytose von Neuroblastomzellen durch iPSC-Makrophagen. Quantitative Mikroskopie-Auslesungen werden sowohl für die Zeitraffer-Bildgebung mit lebenden Zellen als auch für die High-Content-Bildgebung mit festen Zellen beschrieben.

In vitro Quantitative Imaging Assay für Phagozytose toter Neuroblastomzellen durch iPSC-Makrophagen

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Isolierung und Kultivierung von aus dem Knochenmark gewonnenen Makrophagen aus Mäusen.

Isolierung und Kultivierung von Makrophagen aus dem Knochenmark aus Mäusen

Dieses Protokoll beschreibt eine nicht-enzymatische und unkomplizierte Methode zur Isolierung von 7-9 Tage alten neonatalen Knochenmarkzellen der Maus und zur Erzeugung differenzierter Makrophagen unter Verwendung eines Überstands von L929-Zellen als Quelle für den Granulozyten-Kolonie-stimulierenden Faktor (M-CSF). Die aus dem Knochenmark stammenden Makrophagen wurden weiterhin auf die Oberflächenantigene F4/80, CD206, CD11b und funktionelle Kompetenz analysiert.

Isolierung und Aufbereitung von Knochenmarkmakrophagen aus Knochenmark bei Neugeborenen

Das vorliegende Protokoll wurde entwickelt, um die Wirkung der repetitiven Magnetstimulation auf die Fähigkeit der Mikroglia zur Phagozytose von Myelintrümmern zu bewerten. Zu diesem Zweck wurde ein In-vitro-Co-Kultursystem für Mikroglia und Myelintrümmer eingerichtet.

Beurteilung der mikroglialen Phagozytose von Myelintrümmern in vitro unter wiederholter Magnetstimulation

Lernen Sie die Phagozytose von Myelin-Schutt durch Knochenmark-stammende Makrophagen in vitro. Diese Methode ermöglicht die effiziente Analyse immunologischer Reaktionen bei Neurotrauma.

In-vitro- Phagozytose von Myelin Schutt durch Knochenmark stammenden Makrophagen

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