Hydrodynamische Nierenbecken Injektion für nicht-virale Expression von Proteinen in der Niere
8. Januar 2018
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zum Injizieren von Plasmid DNA in der Mausniere über das Nierenbecken, Transgene Ausdruck speziell in der Niere zu produzieren.
Das übergeordnete Ziel dieses chirurgischen Eingriffs ist es, die Proteinexpression aus Plasmid-DNA in der adulten Mausniere zu erzeugen. Diese Methode ist ein neues Werkzeug, um Schlüsselfragen in der Nephrologie zu beantworten, z. B. wie sich die Expression eines interessierenden Proteins auf die adulte Niere auswirkt. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Proteinexpression auf reproduzierbare Weise erzeugt, insbesondere in der Niere, im Gegensatz zu anderen Methoden, die auch in anderen Organen eine Genexpression erzeugen können.
Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Injektion des Nierenbeckens eine sorgfältige Exposition erfordert und schnell erfolgen muss, damit die Plasma-DNA in die Zellen gelangen kann. Beginnen Sie mit der Resuspendierung der Plasmid-DNA im hydrodynamischen Verabreichungspuffer. Legen Sie die Maus auf ein wasserumgewälztes Heizkissen, das mit einem blauen Pad bedeckt ist.
Rasieren Sie mit einem Rasierer, der für die Pflege von Haustieren entwickelt wurde, die linke Seite des Rückens der Maus von der Schulter bis zum Hinterteil und von der Flanke bis zur Wirbelsäule. Reinigen Sie lose Haare und Ablagerungen und tragen Sie Tiersalbe auf beide Augen auf, um eine Austrocknung der Hornhaut zu verhindern. Bereiten Sie nun 100 Mikroliter mit 10 bis 50 Mikrogramm verdünnter Plasmid-DNA in einer separaten Spritze für jede betäubte Maus vor und stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen vorhanden sind.
Die Nadel sollte ohne Sicherung dauerhaft befestigt werden. Leeren Sie vor der Operation sterile chirurgische Instrumente, ohne sie auf ein steriles Tablett zu berühren, das auf dem Wärmekissen platziert ist. Nehmen Sie nun die Maus und platzieren Sie sie in einem beleuchteten Sichtfeld.
Nehmen Sie 3,15 % Chlorhexidingluconat und 70 % Isopropylalkohol Antiseptika aus der Verpackung und legen Sie sie in die Nähe des Tieres. Tragen Sie sterile OP-Handschuhe und tupfen Sie das Tier von der Einschnittstelle aus dreimal in kreisenden Bewegungen mit einem neuen Chlorhexidinalkohol-Tupfer ab. Suchen Sie nun die Inzisionsstelle.
Kneifen Sie die Haut mit einer Pinzette zusammen und schneiden Sie die Hautschicht mit einer Schere etwa einen Zentimeter von der Wirbelsäule entfernt unterhalb des Brustkorbs ab. Machen Sie einen weiteren Zentimeter tiefer in der Muskelschicht. Lokalisieren Sie die Niere und legen Sie sie, ohne sie zu berühren, vorsichtig aus der Bauchhöhle frei, indem Sie mit den Fingern einen gleichmäßigen, sanften Druck auf den Bauch ausüben.
Die Niere freizulegen ist manchmal schwierig. Üben Sie sanften Druck auf den Bauch und die Wirbelsäule aus, um eine Schädigung der Milz zu vermeiden. Wenn andere Organe als die Niere austreten, führen Sie diese bei Bedarf mit einer geschlossenen Pinzette vorsichtig in die Körperhöhle zurück.
Trennen Sie dann die Niere vorsichtig vom umgebenden Fett, gerade so weit, dass das Nierenbecken sichtbar ist, das als kleiner weißer Punkt zu sehen ist. Nachdem Sie das Nierenbecken sichtbar gemacht haben, drücken Sie mit einer geschlossenen Pinzette auf die rechte Seite der Niere, so dass das Nierenbecken im Blick bleibt. Fassen Sie dann die geladene Insulinspritze in der rechten Hand, indem Sie sie parallel zur Arbeitsfläche halten, und führen Sie die Nadel vorsichtig in das Nierenbecken ein.
Sobald die Nadel eingeführt ist, injizieren Sie die Lösung schnell, innerhalb von drei Sekunden. Lassen Sie die Nadel etwa 10 Sekunden lang an Ort und Stelle, um einen Rückfluss der Lösung zu verhindern. Entfernen Sie dann langsam und vorsichtig die Nadel und bringen Sie das Organ wieder in die Bauchhöhle zurück, indem Sie die Inzisionsstelle mit einer geschlossenen Pinzette sanft dehnen.
Vernähen Sie nun die Muskelschicht mit resorbierbaren Fünf-O-Nähten und platzieren Sie zwei bis vier unabhängige Knoten. Vernähen Sie die Hautschicht auf ähnliche Weise mit nicht resorbierbaren Nylonnähten mit fünf oder sechs O und setzen Sie zwei bis vier unabhängige Knoten. Um die Transfektionseffizienz zu beurteilen, führen Sie 10 Mikrogramm eines Luziferase-exprimierenden Plasmids in die verdünnte DNA ein, um sie am nächsten Tag zu injizieren, um eine Bildgebung bei lebenden Tieren durchzuführen.
Setzen Sie den ersten Käfig mit den Mäusen in die Kammer und verschließen Sie sie. Nach der Betäubung injizieren Sie jeder Maus intraperitoneal 100 Mikroliter aufgetautes Luciferin und notieren Sie die Zeit. Wählen Sie die richtige Benutzer-ID aus und klicken Sie in der oberen Menüleiste auf Akquisition und wählen Sie automatisch speichern zwei aus dem Dropdown-Menü.
Initialisieren Sie das System, indem Sie auf Initialisieren klicken. Warten Sie, bis die Initialisierung abgeschlossen ist, und ändern Sie das Sichtfeld auf D, um fünf Mäuse abzubilden. Stellen Sie sicher, dass die Tiere in der gewünschten Reihenfolge platziert sind und dass sie mit dem Rücken zur Kamera zeigen, um die Niere sichtbar zu machen.
Drücken Sie dann fünf Minuten nach der Injektion auf Erfassen, um das Bild aufzunehmen. Entfernen Sie die Mäuse nach der Aufnahme aus dem bildgebenden Gerät. Drehen Sie das Gas aus.
Reinigen Sie die Kammer, die Nasenkämme und den Bildgebungstisch. Um die Daten zu analysieren, klicken Sie nach dem Klicken auf ROI-Tools auf das Kreissymbol und wählen Sie eines aus dem Dropdown-Menü aus, um den neuen ROI im Bild zu platzieren, wie durch ein rotes Oval mit vier Quadraten um das Symbol herum angezeigt. Um die Größe des ROI anzupassen, platzieren Sie den Cursor über einem roten Quadrat und ziehen Sie, um den violetten Bereich über der injizierten Niere zu umschließen.
Klicken Sie nun mit der rechten Maustaste auf diesen ROI und wählen Sie "ROI duplizieren" aus, um den ROI im aktuellen Fenster zu duplizieren und ihn auf die nächste Maus zu verschieben. Nachdem Sie alle ROIs aus dem Menü direkt über dem Bild platziert haben, ändern Sie die Einheiten von Zählungen zu Photonen mit Strahldichte. Erstellen Sie abschließend eine Tabelle mit den Messungen, indem Sie die ROI-Daten aus der Werkzeugpalette exportieren, indem Sie auf ROI-Werkzeuge und dann auf das Bleistiftlinealsymbol klicken.
Dargestellt ist die spezifische Genexpression von Reporterplasmiden in der Niere. Allen Mäusen wurde ein pTet-Plasmid injiziert, das eine verstärkte Glühwürmchen-Luziferase exprimierte, während den Mäusen zwei, drei und fünf ebenfalls pEF1-alpha-Tdtomato-Plasmid injiziert wurde, das das rot fluoreszierende Protein tdtomato exprimierte. Im Allgemeinen liegt die Ausstrahlung bei jungen Mäusen innerhalb einer Größenordnung.
Es ist möglich, dass einige Mäuse keine nennenswerte Ausstrahlung zeigen, entweder aufgrund einer geringen Transfektionseffizienz oder des Fehlens des Transgens selbst. Die Injektion von hydrodynamischem Puffer dient als Kontrolle. Es wird keine Plasmidexpression beobachtet, wenn nur der hydrodynamische Puffer verabreicht wird.
In den ersten Tagen nach der Transfektion wird es wahrscheinlich eine geringe Anzahl von Zellen geben, die positiv für das Transgen gefärbt sind. Diese Zellen sind in Flecken in den Bereichen lokalisiert, die von der Injektionsflüssigkeit infiltriert werden. In diesem Bild stammen die grünen Signale von den proximalen Tubuli, die für Lotus tetragonolobus Agglutinin gefärbt sind, und die roten Signale von den transfizierten Zellen, die das Tdtomato-Reportergen exprimieren.
Sobald die Operation gemeistert ist, kann sie in weniger als 10 Minuten durchgeführt werden, aber die Anästhesie braucht Zeit, um sie einzuleiten und sich davon zu erholen. Zwei geschulte Mitarbeiter, die eng zusammenarbeiten, könnten also nur etwa 10 bis 15 Mäuse pro Tag töten. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, junge Mäuse zu verwenden.
Die hydrodynamische Technik funktioniert bei älteren fibrotischen Organen nicht so gut. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden durchgeführt werden, wie z. B. die Analyse von Blut-, Urin- und Nierengewebeproben, um die Expression des interessierenden Gens zu beurteilen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man das Nierenbecken mit Plasmid-DNA injiziert, um eine nierenspezifische Proteinexpression zu erreichen.
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Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Injektion von Plasmid-DNA in die Mausniere über das Nierenbecken, um die Expression eines Transgens gezielt in der Niere zu erzeugen. Diese Technik ermöglicht eine reproduzierbare Proteingexpression in der Niere erwachsener Mäuse und trägt zur Beantwortung zentraler Fragen der Nephrologie bei.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Nephrologie
- Gen-Therapie
- Molekularbiologie
Hintergrund
- Das Verständnis der Proteingexpression in der Niere ist entscheidend für die nephrologische Forschung.
- Bestehende Methoden können zu Genexpression in mehreren Organen führen.
- Diese Technik konzentriert sich auf eine gezielte Expression in der Niere.
- Eine visuelle Darstellung ist entscheidend für die erfolgreiche Durchführung der Methode.
Zweck der Studie
- Expression von Proteinen aus Plasmid-DNA in der Niere erwachsener Mäuse erzeugen.
- Die Wirkung spezifischer Proteine auf die Nierenfunktion untersuchen.
- Eine zuverlässige Methode für die nephrologische Forschung bereitstellen.
Verwendete Methoden
- Resuspension von Plasmid-DNA im hydrodynamischen Applikationspuffer.
- Platzierung der Maus auf einer mit Wasser durchströmten Heizplatte.
- Injektion von Plasmid-DNA in das Nierenbecken.
- Sorgfältige Exposition und schnelle Durchführung der Injektion.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Transgenexpression in der Niere.
- Reproduzierbarkeit der Proteinexpression nachgewiesen.
- Spezifische Ansteuerung der Niere erreicht.
- Methode validiert für weitere nephrologische Studien.
Schlussfolgerungen
- Diese Methode stellt ein neues Werkzeug für die nephrologische Forschung bereit.
- Sie ermöglicht eine gezielte Genexpression in der Niere.
- Die visuelle Führung verbessert den Erfolg des Verfahrens.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Diese Methode ermöglicht die nieren-spezifische Proteingexpression bei erwachsenen Mäusen und schließt damit eine entscheidende Lücke in der Nephrologieforschung, da systemische Applikationen häufig zu Wirkungen am falschen Ziel führen. Durch die Bereitstellung reproduzierbarer, lokalisierter Transgenexpression unterstützt sie die mechanistische Risikominderung renalwirksamer Zielstrukturen und die Validierung von Signalwegen. Das Verfahren erhöht die Vorhersagesicherheit in der frühen Entdeckungsphase, indem es nieren-spezifische biologische Reaktionen isoliert.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen in einem nieren-spezifischen Kontext, ohne durch organspezifische Expression verursachte Störungen.
- Operationaler Wert: Bietet reproduzierbare Proteingexpression in der Mausniere im Erwachsenenalter und unterstützt somit konsistente Experimente zur Target-Validierung.
- Prädiktiver Wert: Erleichtert die biologische Entschärfung von Risiken, indem renale Phänotypen isoliert werden und die mechanistische Mehrdeutigkeit bei der Beurteilung von nephrologischen Targets verringert wird.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Erzeugt quantifizierbare Ausgabesignale mittels Luciferase- oder Fluoreszenzreportern zur nachgeschalteten Validierung im Screening.
- Reproduzierbarkeit: Gewährleistet eine gleichmäßige Transfektionseffizienz zwischen Versuchstieren und ermöglicht dadurch zuverlässige Screening-Untersuchungen von Wirkstoffen oder Modulatoren in Modellen von Nierenerkrankungen.
- Plattformnutzen: Ermöglicht die Entwicklung nierspezifischer Assays, die in verschiedenen Kampagnen zur Zielvalidierung wiederverwendet werden können.
Translationale und präklinische Forschung
- Krankheitsrelevanz: Modelliert die humane Nierenpathophysiologie, indem es eine gezielte Expression krankheitsassoziierter Proteine im Nierengewebe ermöglicht.
- Translationale Kontinuität: Verbindet die Entdeckung mit der präklinischen Validierung, indem es ein reproduzierbares System für Funktionsstudien von Proteinen in der Niere bereitstellt.
- Risikoadjustierte Weiterentwicklung: Unterstützt Go/No-Go-Entscheidungen, indem sie nieren-spezifische Zielwirkungen vor umfassenderen phänotypischen Screenings klärt.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in den Entdeckungsprozess von der Testung von Zielhypothesen bis zur präklinischen Validierung ein und ermöglicht insbesondere mechanistische Studien mit Fokus auf die Niere, bevor eine Leitsubstanz identifiziert wird.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und Klärung von Signalwegen durch Einschränkung der Proteinexpression auf die Niere und verringert so systemische Störgrößen.
- Screening: Ermöglicht die Standardisierung von Assays durch reproduzierbare Reporterexpression und erleichtert die quantitative Bewertung renaler Zielstrukturen.
- Analytik: Bietet messbare Ausgangsgrößen wie Biolumineszenz und Fluoreszenz zur Vergleich von Expressionsniveaus unter verschiedenen Bedingungen.
- Translationale Forschung: Verbindet mit präklinischer Forschung, indem nieren-spezifische Proteineffekte in einem physiologisch relevanten Modell validiert werden.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare chirurgische Plattform für mehrere nephrologische Zielstrukturen und reduziert so redundante Modellentwicklungen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht das Vertrauen in die Zielvalidierung, indem Expressionseffekte außerhalb des Zielbereichs in Nierenstudien eliminiert werden.
- Operationaler Wert: Standardisiert die Applikation im Nierenbecken und verbessert so die Reproduzierbarkeit zwischen verschiedenen Laboren und experimentellen Ansätzen.
- Strategischer Wert: Steigert die Kapitaleffizienz, indem fehlgeschlagene Studien aufgrund unspezifischer Expression reduziert werden und die Vorauswahl nephrologischer Zielstrukturen effizienter gestaltet wird.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung renalwirksamer Zielstrukturen durch klarere mechanistische Erkenntnisse aus gewebespezifischen Expressionsdaten der Niere.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert mikrochirurgische Fachkenntnisse zur Exposition und Kanülierung des Nierenbeckens unter Anästhesie.
- Hängt von steriler chirurgischer Ausrüstung, der Zubereitung des hydrodynamischen Applikationspuffers und bildgebenden Systemen zur Beurteilung der Transfektion ab.
- Benötigt eine standardisierte Vorgehensweise über mehrere Fachbereiche hinweg – Chirurgie, Bildgebung und Molekularbiologie – für eine konsistente Durchführung.
- Zu berücksichtigende Anpassungsaspekte sind Variabilitäten in der Nierengröße, dem Fibrosestatus und dem Alter, wobei die besten Ergebnisse bei jungen, nicht fibrotischen Mäusen erzielt werden.
- Praktische Einschränkungen umfassen eine geringere Transfektionseffizienz in älteren oder erkrankten Nieren sowie die Notwendigkeit einer schnellen Injektion, um Rückfluss zu verhindern.
