Name: Hydrodynamische Nierenbecken Injektion für nicht-virale Expression von Proteinen in der Niere (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-08T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Erfahren Sie die hydrodynamische Nierenbeckeninjektion zur nicht-viralen Proteinexpression in der Niere von erwachsenen Mäusen. Diese Methode ermöglicht reproduzierbare, nierenspezifische Transgenexpression für die Nephrologieforschung.

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Ein Career Development Award vom Department of Veterans Affairs [BX002797] L.E.W. und die National Institutes of Health [R01-DK095867] American Heart Association [15GRNT25700209] unterstützt und j.c. Die National Institutes of Health [DK093660], Department of Veterans Affairs [BX002190] und der Vanderbilt-Zentrum für Nierenerkrankungen unterstützt M.H.W. Dieses Material ist das Ergebnis der Arbeit mit Ressourcen und Nutzung der Einrichtungen im VA Tennessee Valley Healthcare System unterstützt.

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<li>Crespo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamic+liver+gene+transfer+mechanism+involves+transient+sinusoidal+blood+stasis+and+massive+hepatocyte+endocytic+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamic liver gene transfer mechanism involves transient sinusoidal blood stasis and massive hepatocyte endocytic vesicles.</a> Gene Ther. 12 (11), 927-935 (2005).</li>
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</ol>

Die Autoren haben nichts offen zu legen und kein Interessenkonflikt zu erklären.

In diesem Protokoll wird eine robuste Methode zur Erreichung reproduzierbare Genexpression speziell in der Niere beschrieben. In den Händen eines mäßig erfahrener Chirurgen fanden wir den Prozentsatz der Mäuse, die durch diese Technik im Bereich von 50-100 %, je nach Alter der Maus und die Empfindlichkeit der Anzeige des Transgens transfiziert. Das Niveau der Luciferase-gen-Expression war über Hintergrund für mehrere Monate in den Mäusen erhalten PiggyBac Transposons und für mehrere Wochen bei immungeschwächten ...

Die hydrodynamischen Schweif Vene Injektionstechnik ist eine häufig verwendete Möglichkeit, hohe Genexpression in Maus Leber1,2geworden. Die Nieren sind auch durch diese Technik auf einem viel niedrigeren Niveau, etwa 100-fold weniger3transfiziert. Die hydrodynamischen Nierenbecken-Injektion, die hier beschriebenen bietet eine einfache Möglichkeit zu steuern, die Besonderheit der Orgel Ausdruck durch physische Mittel nach den gleichen hydrodynamischen Grundsätzen, die zuvor in Leber,4,5 festgelegt wurden , Muskel-6und andere Organe7,8. Diese Methode transfects Zellen in lebenden Tieren in Vivo durch Druck und Geschwindigkeit zwingen Flüssigkeit enthaltende DNA in die Zellen gleichzeitig induzieren Schäden an das Organ, das schnell gelöst9. Mit etablierten Operationstechniken, um die Niere über eine Flanke Schnitt10 zusammen mit einer einzigen Injektion von Insulin Spritze zu visualisieren, haben wir erfolgreiche Transfektion von verschiedenen Arten von Nierenzellen, vor allem interstitielle Fibroblasten gefunden, Tubuli und sammeln Kanal11. Sezieren von diesen Mäusen haben gezeigt, dass andere Organe nicht auf Ebenen hoch genug, um durch Luciferase bildgebende Techniken11visualisieren transfiziert sind. Da die Technik nicht-viralen ist, gestattet die Verwendung von Plasmid DNA zur Transfektion schnelle und einfache Zubereitung der Reagenzien zur Injektion erforderlich.
Wir haben lokalisierte hydrodynamische Injektionen verwendet, um auszudrücken das Antioxidans Glutathion S-Transferase A4, der Insulin-ähnliche Wachstumsfaktor-1 Rezeptor und das Hormon Erythropoietin in der Niere, alle mit der erwarteten biologischen Wirkungen11, 12 , 13. detaillierte Auswertung der Route der Verwaltung, Einspritzmenge, DNA-Dosierung und Projektträger Wahl wurde durchgeführt11. Darüber hinaus sowohl die PiggyBac Transposon System- und/oder Cyclophosphamid Behandlung unterdrücken die Immunreaktion auf das Transgen haben gezeigt, dass langfristige gen Ausdruck Ergebnisse11zu verbessern. Andere Forscher haben einen renale Vene Ansatz in der Ratte mit Erfolg, eine hohe Transfektion Effizienz für Zeiträume von mehr als einem Monat14verwendet. Genetische Korrektur der Phänotypen imitiert menschlichen Krankheiten werden jedoch in der Regel durchgeführt bei Mäusen zuerst als ein Proof-of-Concept da am meisten Säugetieren genetische Modelle Mausmodellen. Wir renal Vene Injektion zu Nierenbecken Injektion verglichen und festgestellt, dass die Injektion in das Nierenbecken, die renal Vene für die Genexpression (etwa um das zehnfache höher) und überleben11überlegen war. Das Nierenbecken ist eine ideale Route für die Einreise in die Niere, weil es flexibel genug, um Schwankungen in der Urinproduktion zu tolerieren ist und ist oft in der Lage, seine strukturelle Integrität auch wenn während Hydronephrose geweitet. Injektion in das Nierenbecken erlaubt darüber hinaus Zugriff auf die Niere ohne piercing die Niere Kapsel, so dass die eingespritzte Flüssigkeit sichtbar durch die Nieren besser als Intraparenchymal Injektion erhalten bleiben soll. Andere Maus Organe haben keine Route Eintrag nicht das Gefäßsystem, aber der Harn Raum der Niere ist eine ideale Injektionsstelle. Darüber hinaus führte in der renalen Vene Austritt von Blut in die Bauchhöhle. Das gesamte Niere Volumen der Wildtyp Maus Nieren ist geschätzt worden, durch Magnetresonanz-Bildgebung zu ca. 0,2 cm3, so ist das Volumen einer einzelnen Niere annähernd gleich die Menge der Flüssigkeit injiziert durch hydrodynamische Nierenbecken Injektion (100 µL)15. Hier haben wir all die detaillierten Nuancen des hydrodynamischen Nierenbecken Injektion Protokolls, reproduzierbare Transfektion der Niere zu erreichen zur Verfügung.

<table><tbody><tr><td>AnaSed Xylazin</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-808-1947</td><td>Anästhetikum - Nicht kontrollierte Substanz</td></tr><tr><td>BD Insulinspritze 0,5 mL 29G 1/2 Zoll</td><td>Cardinal Health</td><td>309306</td><td>Erforderliche Spritzen</td></tr><tr><td>Buprenex</td><td>Apotheker/Tierarzt</td><td></td><td>Analgesie - Kontrollierte Substanz</td></tr><tr><td>Dynarex Einweg-Handtuchtuch</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>19-310-671</td><td>Über dem Wärmekissen</td></tr><tr><td>platzieren EndoFree Plasmid Maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td>Nur endotoxinfreie Plasmid-DNA verwenden</td></tr><tr><td>Endosafe Gel-Gerinnsel LAL Schnelle Positivkontrolle</td><td>Charles River</td><td>PC200</td><td>Positivkontrolle für Endotoxin-Test</td></tr><tr><td>Endosafe Gel-Clot LAL Schnelltest-Einzeltestfläschchen</td><td>Charles River</td><td>R13500</td><td>Endotoxin-Test</td></tr><tr><td>Extra feine Mikro-Präparierschere</td><td>Roboz Surgical Instrument</td><td>RS-5882</td><td>Chirurgisches Werkzeug</td></tr><tr><td>Fisherbrand Instant Sealing Sterilisationsbeutel - 9"</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>01-812-51</td><td>Zum Autoklavieren von chirurgischen Instrumenten</td></tr><tr><td>Gaymar Wärmepumpe</td><td>Paragon Medical</td><td>TP-700</td><td>Wasserzirkulierende Wärmepumpe</td></tr><tr><td>Germinator 500</td><td>Roboz Chirurgisches Instrument</td><td>DS-401</td><td>Zur Wiederverwendung von chirurgischen Instrumenten während der Operation</td></tr><tr><td>Graefe Pinzette</td><td>Roboz Chirurgisches Instrument</td><td>RS-5136</td><td>Chirurgisches Werkzeug</td></tr><tr><td>Graefe Gewebezange</td><td>Roboz Chirurgisches Instrument</td><td>RS-5153</td><td>Chirurgisches Werkzeug</td></tr><tr><td>Halsey Nadelhalter, 5" Länge</td><td>Roboz Chirurgisches Instrument</td><td>RS-7841</td><td>Chirurgisches Werkzeug</td></tr><tr><td>Heizkissen - 15" x 21" - benötigen mindestens 3</td><td>Paragon Medical</td><td>TP22G</td><td>Zur Verwendung mit der Gaymar Wärmepumpe</td></tr><tr><td>IsoFlo (Isoflurane, USP)</td><td>Abbott Animal Health</td><td>5260-04-05</td><td>Für Bildgebung und Euthanasie</td></tr><tr><td>Isotec Isoflurane Delivery System Vaporizer</td><td>Smiths Medical</td><td>VCT3K2</td><td>Für Bildgebung und Euthanasie</td></tr><tr><td>Ketamin</td><td>Apotheker/Tierarzt</td><td></td><td>Anästhetikum - Kontrollierte Substanz</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark Professional</td><td>34120</td><td>Laborgewebe</td></tr><tr><td>Lebendbild-Software</td><td>Caliper Life Sciences</td><td></td><td>Für die Bildgebung von lebenden Tieren</td></tr><tr><td>Luciferin</td><td>Perkin Elmer</td><td>122796</td><td>Für die Bildgebung von lebenden Tieren</td></tr><tr><td>Nanodrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-2000-US-CAN</td><td>Spektralphotometer für die DNA-Messung</td></tr><tr><td>Prevantics Tupfer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23-100-110</td><td>Für die Vorbereitung von Hautoperationen</td></tr><tr><td>Prolene 5-0 Nähte Taper 30"</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NC0256891</td><td>Nicht resorbierbare Nähte für die Haut</td></tr><tr><td>Puralube Marke Opthalmic Salbe</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-888-2572</td><td>Um die Augen während der Operation feucht zu halten</td></tr><tr><td>Trans IT - QR Hydrodynamische Verabreichungslösung</td><td>Mirus Bio</td><td>MIR-5240</td><td>Hydrodynamischer Verabreichungspuffer zur Verdünnung von DNA</td></tr><tr><td>Vicryl 5-0 Nähte J303H</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NC9816710</td><td>Resorbierbare Nähte für die Muskelschicht</td></tr><tr><td>Wahl Mini Arco Clipper</td><td>Med-Vet International</td><td>8787-1550</td><td>Rasierer für die Hautvorbereitung</td></tr><tr><td>Xenogen IVIS 200</td><td>Caliper Life Sciences</td><td></td><td>Für die Bildgebung lebender Tiere</td></tr></tbody></table>

hydrodynamische nierenbecken injektion für nicht-virale expression von proteinen in der niere

Hydrodynamic Renal Pelvis Injection for Non-viral Expression of Proteins in the Kidney

Hydrodynamische Injektion schafft eine lokale, Hochdruck-Umfeld, um verschiedenen Geweben mit Plasmid-DNA und anderen Substanzen zu transfizieren. Hydrodynamische Schweif Vene Injektion, ist zum Beispiel eine etablierte Methode, die durch die Leber transfiziert werden kann. Dieses Manuskript beschreibt eine Anwendung der hydrodynamischen Prinzipien durch Injektion von der Mausniere direkt mit Plasmid DNA für Nieren-spezifische Genexpression. Mäuse werden betäubt und die Niere durch eine Flanke Inzision, gefolgt von einer schnellen Injektion ein Plasmid DNA-haltigen Lösung direkt in das Nierenbecken ausgesetzt ist. Die Nadel ist für zehn Sekunden gehalten und Ortsbild Einschnitt vernäht. Am nächsten Tag live Animal Imaging, Western-Blot oder Immunohistochemistry, Genexpression assay verwendet werden oder anderen Assays geeignet, um das Transgen Wahl dienen zur Erkennung des Proteins des Interesses. Veröffentlichten Methoden der Genexpression zu verlängern zählen Transposon-vermittelten Transgen Integration und Cyclophosphamid behandelt, um die Immunantwort auf das Transgen hemmen.

Die Chirurgie und Injektion Technik sind einfach durchzuführen, einmal gemeistert, erfordert keine große Ausrüstung oder teuren Materialien. Wenn neue zur Flanke-Schnitt Niere Chirurgie, einen Trainingstag auf mehrere Mäuse geplant für Euthanasie dürfen in denen die Mäuse sind nicht wiederhergestellten nach der Operation, weil der erste Versuch dieser Operation wesentlich länger als normal dauern kann. Alternativ können Forscher mit ähnlichen Techniken vertraut ganz einfach finden. Befolg...

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zum Injizieren von Plasmid DNA in der Mausniere über das Nierenbecken, Transgene Ausdruck speziell in der Niere zu produzieren.

Hydrodynamische Nierenbecken Injektion für nicht-virale Expression von Proteinen in der Niere

Hydrodynamic injection creates a local, high-pressure environment to transfect various tissues with plasmid DNA and other substances. Hydrodynamic tail ...

Das übergeordnete Ziel dieses chirurgischen Eingriffs ist es, die Proteinexpression aus Plasmid-DNA in der adulten Mausniere zu erzeugen. Diese Methode ist ein neues Werkzeug, um Schlüsselfragen in der Nephrologie zu beantworten, z. B. wie sich die Expression eines interessierenden Proteins auf die adulte Niere auswirkt. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Proteinexpression auf reproduzierbare Weise erzeugt, insbesondere in der Niere, im Gegensatz zu anderen Methoden, die auch in anderen Organen eine Genexpression erzeugen können.Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Injektion des Nierenbeckens eine sorgfältige Exposition erfordert und schnell erfolgen muss, damit die Plasma-DNA in die Zellen gelangen kann. Beginnen Sie mit der Resuspendierung der Plasmid-DNA im hydrodynamischen Verabreichungspuffer. Legen Sie die Maus auf ein wasserumgewälztes Heizkissen, das mit einem blauen Pad bedeckt ist.Rasieren Sie mit einem Rasierer, der für die Pflege von Haustieren entwickelt wurde, die linke Seite des Rückens der Maus von der Schulter bis zum Hinterteil und von der Flanke bis zur Wirbelsäule. Reinigen Sie lose Haare und

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Forschung

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Biologie

Quelle: Gupta, K. et al. Intrarenale Injektion von Escherichia coli in einem Rattenmodell der Pyelonephritis.  J. Vis. Exp. (2017).Dieses Video demonstriert die intrarenale Injektion von E. coli in das Nierenbecken einer anästhesierten Ratte, um eine lokale Niereninfektion auszulösen, und modelliert eine akute Pyelonephritis. Sie hebt wichtige chirurgische Schritte und aseptische Techniken hervor, die notwendig sind, um ein reproduzierbares In-vivo-Infektionsmodell für die nachgelagerte Analyse...

Intrarenale Injektion von E. coli in das Nierenbecken einer Ratte

Source: Van Lidth de Jeude, et al. A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates the process of producing viral particles through transfection of embryonic kidney cells with plasmid–polyethylenimine complexes, which leads to viral genome expression, particle assembly, and virus collection in the medium.

Polyethylenimine-Mediated Transfection of Embryonic Kidney Cells for Recombinant Virus Production

In diesem Video präsentieren wir das Protokoll für die hydrodynamische Injektion von Plasmiden in das Nierenbecken der Mausniere zur Nukleinsäuretransfektion. Diese Technik ermöglicht die organspezifische Abgabe von Plasmiden, indem sie das Prinzip des hohen hydrostatischen Drucks nutzt, der die Plasmide gewaltsam in die spezifische Stelle treibt, ohne Gewebeverletzungen zu verursachen.

Hydrodynamische Injektion des Nierenbeckens: Eine Technik zur direkten Abgabe von DNA in Nierenzellen des Mausmodells

In diesem Video demonstrieren wir die intrarenale Verabreichung von Medikamenten bei Ratten über die Nierenarterie. Diese Methode ist vorteilhaft bei der Verbesserung des Wirkstoff-Targetings, der Wirkstoffwirksamkeit und der Minimierung der systemischen Toxizität.

Intrarenale Verabreichung von Medikamenten bei Ratten: Eine Methode zur Verabreichung von therapeutischen Arzneimitteln in die Rattenniere durch intraarterielle Injektion

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Verwendung von Schicksalskarten und Abstammungsverfolgungen, um gezielte Injektionen in einzelne Blastomere durchzuführen, aus denen die Niere von Xenopus laevis-Embryonen entsteht.

Technik auf Zielmikroinjektions an die Entwicklungs<em&gt; Xenopus</em&gt; Kidney

Renal Verletzungen von Nephrotoxinen entstehen, die Medikamente im Bereich von Antibiotika zu Chemotherapeutika gehören, können in komplexen Erkrankungen, deren Pathogenese zur Folge bleibt unvollständig verstanden. Dieses Protokoll zeigt, wie Zebrabärbling für Krankheitsmodelle dieser Bedingungen verwendet werden, die zur Identifizierung von renoprotektive Maßnahmen angewendet werden können.

Nephrotoxin Mikroinjektion in Zebrabärbling akuten Nierenschädigung zu Modell

Die Verabreichung von Medikamenten für die Wiederherstellung der Nierenfunktion erfordert die Kontrolle der Lokalisierung und Verteilung der therapeutischen Verbindung. Hier beschreiben wir im Detail eine einfache Technik für intrarenalen Abgabe von Arzneimitteln in Ratten. Dieses Verfahren kann ohne Mortalität und hoher Reproduzierbarkeit leicht durchgeführt werden.

Die intravaskuläre Lieferung von Biologics zur Rattenniere

Dieses Manuskript beschreibt ein chirurgisches Modell der Pyelonephritis bei Ratten unter Verwendung einer direkten intrarenalen Infektion durch Escherichia coli in das Nierenbecken. Das experimentelle Verfahren kann genutzt werden, um die Pathogenese der Pyelonephritis sowie die damit einhergehende Entzündung und Fibrose zu untersuchen.

Intrarenale Injektion von Escherichia coli In einem Rattenmodell der Pyelonephritis

Dieses Manuskript beschreibt eine Methode zur gezielten Abgabe an eine einzelne Niere über einen Katheter, der in der infraroten Bauchaorta in der Maus platziert ist.

Direkte Medikamentenabgabe an die Niere über die Nierenarterie

In dieser Arbeit bringen wir exogene künstlich synthetisierte miRNA-Nachahmungen in die Niere durch Schwanzveneninjektion eines nicht-viralen Vektors und Polyethylenimin-Nanopartikel in verschiedenen Mausmodellen für Nierenerkrankungen. Dies führte zu einer signifikanten Überexpression der Ziel-miRNA in der Niere, was in mehreren Mausmodellen zu einer Hemmung des Fortschreitens der Nierenerkrankung führte.

Abgabe von exogenen künstlich synthetisierten miRNA-Nachahmungen an die Niere unter Verwendung von Polyethylenimin-Nanopartikeln in verschiedenen Mausmodellen für Nierenerkrankungen

Dieser Bericht beschreibt die lokalisierte Injektionsmethode von AAV-Vektoren über das Nierenbecken für einen effektiven und sicheren Gentransfer in die Mausniere.

Effektive und sichere Genabgabe an die Mausniere durch langsame retrograde Injektion von Adeno-assoziierten Virusvektoren in das Nierenbecken

Erfahren Sie die hydrodynamische Nierenbeckeninjektion zur nicht-viralen Proteinexpression in der Niere von erwachsenen Mäusen. Diese Methode ermöglicht reproduzierbare, nierenspezifische Transgenexpression für die Nephrologieforschung.

Hydrodynamische Nierenbecken Injektion für nicht-virale Expression von Proteinen in der Niere

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