Name: Zellfreie biochemische fluorometrisch enzymatische Assays für Hochdurchsatz-Messung der Lipidperoxidation in High-Density Lipoprotein (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: Lernen Sie eine zellfreie fluorometrische Methode zur Hochdurchsatz-Messung der Lipidperoxidation in HDL. Diese biochemische Technik ermöglicht die zuverlässige Bestimmung der HDL-Funktion für kardiovaskuläre und metabolische Forschung.

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Die Autoren erkennen dankbar die Arbeit von Dr. Mohamad Navab, Alan Fogelman und Srinivasa Reddy für ihre Schlüsselrolle bei der Entwicklung der früheren Iterationen dieses Modells. T.A.A. wird unterstützt durch eine RMIT University Vice-Chancellor Postdoctoral Fellowship. AJ und AH werden durch NHMRC Projekt Grant 1108792 unterstützt. TK stützt sich auf NIH gewährt NIH K08AI08272, NIH/NCATS Grant # µL1TR000124.

alle Experimente mit menschlichen biologischen Proben wurden mit Genehmigung der Ethik an der Universität von Kalifornien-Los Angeles, Los Angeles und der Alfred Hospital menschliche Ethik-Kommission, Melbourne durchgeführt.
 Hinweis: Es gibt viele Variationen der Fluorochrom HDL-Funktion Assay (siehe Diskussion) 32. Im folgenden beschreiben wir das Protokoll, das die beständigsten und reproduzierbare Ergebnisse liefert. Eine Übersicht des Tests ist in Abbildung 2 dargestellt.
 1. Probe Verarbeitung <ol><li>Verwendung frischer, nicht hämolysiert Serum (in Serum Separator Rohre gesammelt werden können) oder Citrat-Plasma nach 12-14 Stunden Fasten erhalten. Wenn kryokonservierte Proben verwenden, enthalten entsprechende Steuerung, wie in diesem Protokoll beschrieben.</li>
</ol> 2. Tag 0-Vorbereitung auf den Test <ol><li>Prepare arbeiten Layout des Experiments mit den entsprechenden Kontrollen, Proben und repliziert. Führen Sie jede Probe mindestens im Triplicates. Eine Vertreter 96 gut Layout ist in Abbildung 3 dargestellten.</li>
	<li>Berechnen alle Bände der Reagenzien, die für den Assay, basierend auf der Anzahl von Mustern und Wiederholungen verwendet werden. 
	Hinweis: Enthalten ein zusätzliches Volumen von 10 % in jede Aktie arbeiten, stellen Sie sicher, es gibt genügend Volumen für jedes Reagens für das spezifische Experiment.</li>
	<li>Beschriften Sie alle erforderlichen Rohre für alle Stufen des Assays z. B. für die Trennung von HDL, Messung von HDL-C (optional) und die Fluorochromeassay.</li>
</ol> 3. Tag 1-Vorbereitung von Steuerelementen <ol><li>Vorbereitung der studienspezifischen gepoolten Kontrolle <ol><li>Erstellen einer Kontrollprobe von gepoolten Plasma oder Serum alle Studie Proben. Wenn 20 Proben in jede Platte in dreifacher Ausfertigung ausgeführt, kombinieren Sie 10 µL von jeder Probe in ein Steuerelement 200 µL gebündelt. Geben Sie eine separate Aliquot der gepoolten Kontrolle im klinischen Labor den HDL-C-Wert dieses Steuerelements bestimmen. 
		Hinweis: Verwenden Sie dieses gebündelte Steuerelement Assays zu standardisieren und alle möglichen bekannten entfallen (z.B. Art des Matrix-Serum im Vergleich zu Plasma, Frost-Tau-wechseln, Kryokonservierung) und unbekannte Störfaktoren, die experimentelle Variabilität beeinträchtigen 27 , 28.</li>
	</ol></li> <li>Vorbereitung der Labor-spezifische Qualitätskontrolle (QCs) <ol><li>bereiten einen großen Vorrat an HDL in jedem Labor (z. B. HDL von 5 mL Plasma von 10 gesunden Spendern isoliert) und mehrere Aliquote das Tiefgefrieren Lager, Frost-Tau-Wechseln zu minimieren.</li>
		<li>Nutzung von mindestens 10 verschiedenen repliziert aus diesem Bestand den Durchschnittswert des HDLox zu bestimmen. Ein akzeptablen Bereich des gemessenen HDLox Werte für jede QC-Probe in jedem Assay enthalten innerhalb ist &lt; 15 % von der Variationskoeffizient der durchschnittlichen Wert.</li>
		<li>Geben eine separate Aliquot der gepoolten Kontrolle im klinischen Labor, HDL-C-Wert dieses Steuerelements (z.B. 40 mg/dL) zu bestimmen. 
		Hinweis: Eine detaillierte Vorgehensweise wie Blut von Blutbanken verwenden, um diese Steuerelemente erstellen beschrieben 27 , 28 , 32 bislang. Bei Bedarf zusätzliche QCs verwenden (z.B. eine eines gesunden Spenders bekannt, normale HDL-Funktion und einer von einem Spender bekannt, weitgehend abnormale HDL-Funktion haben.</li>
	</ol></li> <li>Optimierung von Hintergrundsignal und leere Werte (optional) <ol><li>um Hintergrund zu minimieren, fügen Sie die entsprechende Menge an Katalase (1-4 U/mL) Inkubation Mittel-und rasch gebildeten H 2 O entfernen 2 durch spontane Luftoxidation der Puffer. 
		Hinweis: Da die Werte aus den leeren Brunnen (keine HDL) die Werte der HDL Proben abgezogen wird sind und die Ergebnisse werden berichtet relativ zu einem gepoolten Steuerelement (das in der gleichen 96-well-Platte enthalten ist), fanden wir, dass dieser Schritt nicht praktisch Affec tut t die Ergebnisse. So kann Optimierung der Hintergrundsignal mit Katalase verzichtet werden, wenn erforderlich.</li>
	</ol></li></ol> 4. Tag 1-Trennung von HDL-Cholesterin HDL Niederschlag mit Hinweis: verwenden Sie ein handelsübliches standardisierte HDL-Cholesterin auslösenden Reagenz ApoB erschöpft Serum nach Angaben des Herstellers zu isolieren ' s Anweisungen. Diese Reagenzien sind weit verbreitet in farbmetrischen Assays, um HDL-Cholesterin-Werte zu bestimmen.
<ol><li>Plasma oder Serum Probe frisch verwenden (oder Auftauen).</li>
	<li>Mix gleiche Volumina (z.B. 80 µL) Plasma und HDL-Cholesterin Fällung Reagenz (20 % w/V Polyethylenglykol in Glycin Puffer bei pH 10,0 (25 ° C)).</li>
	<li>Mix gut von oben und unten pipettieren.</li>
	<li>Zentrifugieren bei 1000-2000 x g für 10 min.</li>
	<li>Aspirieren den überstand (HDL Bruch).</li>
	<li>Verwenden Sie isolierte HDL im Idealfall sofort für die Fluorochromeassay der Lipidperoxidation HDL. Jedoch wenn mehrere Proben am selben Tag ausgeführt werden und andere Schritte wie Messung der Konzentration von HDL-Cholesterin sind auch getan, dann die isolierte HDL bei 4 ° C lagern und verwenden Sie es am nächsten Tag für die FluorochromeHDL-Funktion Test.</li>
</ol> 5. Tag 1-Bestimmung des HDL-C in isolierte HDL Hinweis: dieser Schritt ist optional, wenn der Wert des HDL-C aus dem klinischen Labor verwendet wird, um HDLox zu normalisieren von HDL-C-Menge.
<ol><li>Quantify das HDL-Cholesterin aus dem Plasma, mit Standard-farbmetrische assays 27. 50 µL Reagenz Cholesterin in jede Vertiefung hinzufügen und bestimmen, Cholesterin-Konzentration mit einer kolorimetrischen Platte-Leser und eine Cholesterin-standard in jedem Kit zur Verfügung gestellt.</li>
</ol> 6. Tag 2-Vorbereitung der Reagenzien <ol><li>bereiten HRP und Cholesterin-Lösungen von HRP 5 U/mL Lösung (Bereich 1-10 U/mL).</li>
	<li>20 mM bereiten Fluorochrom (z. B. Amplex Red) Lösungen: ein Fläschchen Fluorochrom Reagenz und DMSO auf Zimmertemperatur auftauen. Vor dem Gebrauch lösen Sie Fluorochrom Reagenz (1 mg) in 200 µL von DMSO auf. Speichern-Stammlösung auf eingefroren ≤-20 ° C, vor Licht geschützt werden.</li>
	<li>Bereiten Sie positive und negative Kontrollen: benutzen Sie 1 X ' Reaktion Puffer ' Cholesterin und 20 mM H 2 O 2 arbeiten ohne Lösung als negative und positive Kontrolle bzw..</li>
</ol> 7. Tag 2-Fluorochrom Assay <ol><li>hinzufügen 50 µL 1 x Reaktion Puffer als Leerzeichen (Negativkontrolle).</li>
	<li>Optional: positiv-Kontrolle in jeder Platte 20 mM Arbeitslösung von H 2 O 2 Agrega.</li>
	<li>Experimentelle Variabilität zu minimieren und sicherzustellen, dass Zusatz von Reagenzien und Proben werden konsequent durchgeführt und in einer fristgerechten Weise, führen alle Ergänzungen der Proben in einer separaten 96 gut Rundboden, klar, Polystyrol oder Polypropylen Platte (Platte 1). Verwenden Sie dann eine Mehrkanal-Pipette übertragen bestimmte Volumes in 3 96-Well-Platten (Platten 2-4: Polypropylen, flache BotTom, schwarz) (das haben identische Layout) ( Abbildung 2, Abbildung 3).
	<ol><li>Z. B. zunächst 160 µL isolierte HDL in jede gut/Probe der Platte 1 hinzufügen und dann mit dem Einsatz von Mehrkanal-Pipette übertragen 50 µL des HDL-Cholesterins von jeder gut/Probe in der schwarzen 96-Well Platten. Tipps zwischen jeder Zeile/Spalte ändern und verwenden Sie ungefilterte Tipps für alle Transfers.</li>
	</ol></li> <li>Proben in den Brunnen zu verlassen. Nicht wegwerfen. Es gibt keine Wäsche-Stufen zwischen Zugabe von Reagenzien.</li>
	<li>Fügen Sie 50 µL HRP-Lösung 5 U/mL (0,25 U) in jede Vertiefung. 
	Hinweis: Verwenden Sie HRP vor der Zugabe des Reagenz Fluorochrom.</li>
	<li>30 min bei 37 ° c inkubieren Entsorgen Sie Proben nicht nach der Inkubation (keine Wäsche Schritte zwischen Ergänzungen von Reagenzien).</li>
	<li>Fügen Sie 50 µL des Fluorochromereagent für eine Endkonzentration von 300 µM. Zu diesem Zeitpunkt insgesamt Reaktionsvolumen beträgt 150 µL. gut mischen und vor Licht schützen.</li>
	<li>Bewerten das fluoreszierende auslesen (im Dunkeln) jede Minute mehr als 120 min bei 37 ° C mit einem fluoreszierenden Platte-Lesegerät (530/590 nm-Filter). 
	Hinweis: Verwenden Sie ein kürzeres 60-Minuten-Intervall mit frische Proben. Wir haben festgestellt, dass 120-Minuten-Test gibt mehr reproduzierbaren Daten mit der Verwendung von kryokonservierten Proben.</li>
	<li>Daten, die mittels geeigneter Software.</li>
</ol> 8. Tag 3-Datenanalyse <ol><li>Fluoreszenz Einheiten (willkürliche Einheiten) 120 Minuten nach Zugabe von Fluorochrom Reagenz für alle Proben einschließlich leere Brunnen aufnehmen und alle Steuerelemente.</li>
	<li>Berechnen Sie den Mittelwert der Fluoreszenz-Einheiten (basierend auf mindestens triplicates) (HDL Ox_sample). Nehmen Sie nicht Ausreißer (&gt; 2 SDs vom Mittelwert) in Betracht.</li>
	<li>Subtrahieren die Hintergrundfluoreszenz mithilfe der folgenden Formel: 
	<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56325/56325eq1.jpg"></li> <li>Normalisierung für HDL-Cholesterin-Betrag (HDL-C): Normalisierung den HDLox Lipid Peroxidation Wert für jede Probe (einschließlich der gepoolten Kontrolle) von HDL-C) (mg/dl). In dem Abschnitt "Ergebnisse" präsentiert sich HDL Ochsen als n (HDL-C) HDLox Maßnahme entsprechend der Einstellung für HDL-C. Verwenden Sie die folgende Gleichung: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56325/56325eq2.jpg"></li> <li>die Expression von HDLox Lipid Peroxidation Wert jeder einzelnen Probe gegen den Wert eines Steuerelements gepoolten zu standardisieren. N (HDL-C) HDLox Lipid Peroxidation Wert für jede Probe (bereinigt um HDL-C) von n (HDL-C) HDLox Lipid Peroxidation Wert des Steuerelements gebündelt zu normalisieren. In dem Abschnitt "Ergebnisse" präsentiert sich HDL Ochsen als nHDL Ochsen Maßnahme entsprechend der Einstellung für experimentelle Variabilität und HDL-C. Verwenden Sie die folgende Gleichung: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56325/56325eq3.jpg"> Hinweis: dieser Ansatz ist ähnlich zu anderen etablierten experimentellen Ansätzen, wie experimentelle Variabilität von Messungen zu reduzieren International normalized Ratio (INR) 44 , 45. Dieser Ansatz wurde in klinischen Studien 32 , 33 , 34 , 35 , 36 validiert , 37 , 38 , 39.</li> <li>Qualitätskontrolle von Versuchsergebnissen mit standard Qualitätskontrolle Proben durchführen. Jedes Labor sollte eigene Qualitätskontrollen (QCs) festlegen. Im Idealfall gibt es einen QC für nHDLox aus einer Stichprobe mit bekannten dysfunktionalen HDL und QC für nHDLox aus einer Stichprobe von gesunden Spendern [z.B. Verwendung gepoolten Probe von jungen Erwachsenen, die etablierten Blutbank Geber und haben keine bekannten Komorbidität und Risikofaktoren für Herz-Kreislauf-Krankheiten, einschließlich Rauchen]. Die letztere Kontrolle standardisiert Ergebnisse unter verschiedenen Labors. Die Durchschnittswerte der diese QCs sind etablierte basierend auf mindestens 5 Wiederholungen (in der Regel verwenden wir für diesen wichtigen Schritt 10 Wiederholungen).
	<ol><li>Check ob gemessene QCs in jeder Probe haben innerhalb des erwarteten Bereichs der Werte schätzt. Angenommen, eine akzeptable maximale experimentelle Variabilität von 15 %, sollten alle experimentellen Messwerte in 15 % der bekannten durchschnittliche Werte von etablierten QC fallen. Verwenden Sie die folgenden Gleichungen: <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/56325/56325eq4.jpg"> <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/56325/56325eq5.jpg"> Hinweis: Wenn entweder die inklusive Qualitätskontrolle Proben ( Normal im Vergleich zu dysfunktionalen HDL) HDLox Werte außerhalb der erwarteten Bereich (gegründet in jedem Labor) gibt, dann wiederholen Sie den Versuch.</li>
	</ol></li> <li>Durchführen Qualitätskontrolle der experimentellen Ergebnisse mit den Variationskoeffizienten (CV), um experimentelle Variabilität zu quantifizieren: wiederholen Sie alle Proben mit CV % &gt; 15 %. Verwenden Sie die folgende Gleichung: <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/56325/56325eq6.jpg"> Hinweis: eine typische Intra-Assay (innerhalb der gleichen Platte) und Inter-Assay (unter verschiedenen Platten) experimentelle Variabilität ist &lt; 15 %. 2) ein typisches Intra-Assay-Lebenslauf ist zwischen 1-7 % und eine typische Interassay Lebenslauf zwischen 3-10 ist %.</li>
</ol>

Dieses Protokoll und Test sind relevant für das patent PCT/US2015/018147.

Das hier beschriebene Protokoll bietet ein robustes Werkzeug um wichtige Forschungsfragen bezüglich der Rolle von HDL-Funktion bei Arteriosklerose und menschliche Krankheit zu beantworten. Der Assay quantifiziert den HDL Lipid Peroxid Inhalt pro mg HDL-C enzymatische Verstärkung (HRP). Dieser Ansatz vermeidet bekannte Einschränkungen der vorherige HDL-Funktion-Assays (z. B. Cholesterin-Efflux-Assay) einschließlich erhebliche Heterogenität in Bezug auf Arten der verwendeten Zellen, Art der Anzeige gemeldet, fehlende Stand...

Arteriosklerotische Herz-Kreislauf-Erkrankungen (CVD) ist die führende Ursache des Todes weltweit1,2. Epidemiologische Studien haben gezeigt, dass geringe Mengen an High-density-Lipoprotein (HDL) Cholesterin in der Regel umgekehrt das Risiko für die Entwicklung von Atherosklerose1,2zugeordnet sind. Obwohl einige Studien eine Atheroprotective Rolle für HDL1,2unterstützen, ist der Mechanismus, mit dem HDL die Initiierung und Progression der Atherosklerose dämpft, komplex 3,4. So wurde vermutet, dass die komplexe Struktur und Funktion des HDL statt absolute Ebene Atherosklerose 5,6,7,8genauer vorhersagen können. Mehreren Veränderungen HDL Protein- und Lipid kompositorischen, die HDL-Funktion beeinträchtigen in entzündlichen Zuständen wie Arteriosklerose. Diese i) reduzieren seinen Cholesterin Efflux potenzielle 9, Ii) verringern Sie anti-entzündliche und Erhöhung der HDL-assoziierten entzündungsfördernde Proteine 6,7, (Iii) Abnahme Antioxidans Faktorstufen und Aktivität und HDLs Fähigkeit zur Hemmung der Oxidation von Low Density Lipoprotein (LDLox)10 und iv) Lipid Hydroperoxid Inhalt und Redox-Aktivität (HDLox)9,11zu erhöhen. Robust-Assays, die die Pleotropic Funktionen des HDL (z. B. Cholesterin Efflux, antioxidative Funktion) auswerten können Bestimmung des HDL-HDL-C in der Klinik ergänzen.
HDL-Funktion wird in der Regel durch Zell-basierte Methoden wie das Cholesterin Efflux Assay8,12,13,14bewertet. Diese Methoden haben wesentliche Einschränkungen einschließlich erhebliche Heterogenität in Bezug auf Arten der verwendeten Zellen, Art der Anzeige gemeldet, fehlende Standardisierung und verwirrende Effekte von Triglyceriden 7,15. Diese Nachteile aufwerfen Schwierigkeiten für große klinische Studien16. Zellfreie Assays können robustere Maßnahmen der HDL-Funktion im Vergleich zu zellbasierte Assays geben. Der Cholesterin-Efflux ist eine der wichtigsten Funktionen von HDL, aber es kann nur durch zellbasierte Assays ermittelt werden. Andere Ansätze zur HDL-Funktion wie Proteomics17,18,19,20,21,22,23zu bestimmen, 24 und zellbasierte Monocyte Chemotaxis-Assays HDL Funktion 17,22,25 nicht standardisiert wurden und nicht in großem Maßstab Studien am Menschen verwendet werden.
HDL hat bedeutende antioxidative Atheroprotective Effekt5,6,7,8. Die antioxidative Funktion von HDL wurde im Beisein von LDL in vorherigen Zelle frei fluorometrischen Assays 26bestimmt. Diese biochemischen fluorometrischen Methoden der HDL antioxidative Funktion wurden ursprünglich von Mohamad Navab und Alan Fogelman und ihre Kollegen26entwickelt. Obwohl viele Studien am Menschen diese Methoden verwendet haben, um festzustellen, HDL Funktion 17,18,19,20,21,22,23 ,24, Lipid (HDL)-Lipid (LDL) und Lipid-Fluorochrom Interaktionen begrenzen Reproduzierbarkeit dieser Zelle frei nicht-enzymatische biochemischen Assays HDL Funktion27,28.
Vor kurzem Interesse konzentriert sich auf die funktionellen Konsequenzen der HDL-Oxidation, die das Ergebnis der Oxidation von Lipiden und Proteinen innerhalb von HDL 27,29,30. Frühere Studien haben gezeigt, dass Oxidation von HDL HDL Funktion 27,29,30beeinträchtigt. HDL hat eine Hauptrolle in Lipid Peroxid Transport und hohes Maß an Lipid-Peroxide bezieht sich auf abnormale HDL-Funktion. Somit kann HDL Lipid Peroxid Inhalte zur Bestimmung der HDL-Funktion 9,17,20,31 und angesichts der bekannten Grenzen der vorherige Assays von HDL-Funktion7, 15,27,32, wir entwickelt alternatives fluorometrisch Verfahren, das HDL Lipid Peroxid Inhalt (HDLox) 32quantifiziert. Diese Methode basiert auf der Enzym-Meerrettich-Peroxidase (HRP) und Fluorochrom Amplex Red, die (ohne Cholesterin Oxidase) Peroxid Fettgehalt pro mg von HDL-C 32quantifizieren können. Die biochemische Prinzip des Tests ist in Abbildung 1dargestellt. Wir haben gezeigt, dass diese Fluoreszenz basierenden Ansatz nicht die Grenzen der vorherige HDL Funktion Assays27,28. Dieser Assay wurden weiter verfeinert und in unserem Labor standardisiert, so dass es in großem Maßstab Studien am Menschen selbst mit kryokonservierten Plasma 32,33,34, zuverlässig genutzt werden kann 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42. das Auslesen dieser Assay ist verbunden mit Anzeigen von validierten zellbasierte Assays, Surrogat Maßnahmen der Herz-Kreislauf-Krankheit, systemische Entzündung, Immun-Dysfunktion und damit verbundene Risiko für Herz-Kreislauf- und Stoffwechselerkrankungen Phänotypen 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39. hier beschreiben wir diese einfache, aber robuste Methode zur Messung der HDL Peroxid Lipidgehalt (HDLox). Dieser Assay kann als Werkzeug verwendet werden, um wichtige Forschungsfragen bezüglich der Rolle von HDL-Funktion in der menschlichen Krankheit zu beantworten wo systemische Entzündung, oxidativer Stress und oxidierten Lipide haben eine wichtige Rolle (z.B. Arteriosklerose)32.

<table><tbody><tr><td>Experimentelle Reagenzien</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HDL PEG (Polyethylenglykol) Fällungsreagenz</td><td>Pointe Scientific</td><td>H7511</td><td></td></tr><tr><td>Amplex Red Reagenz.</td><td>Life Technologies, Grand Island, NY</td><td>A12216</td><td>Amplex Assay-Kit für rotes Cholesterin. &bull; &le; &ndash; 20°; C & Bulle; Trockenmittel & Bulle Vor leichtem</td></tr><tr><td>DMSO schützen.</td><td>Life Technologies, Grand Island, NY</td><td>A12216</td><td>Amplex Assay-Kit für rotes Cholesterin. &bull; &le; &ndash; 20°; C & Bulle; Trockenmittel & Bulle Vor leichter</td></tr><tr><td>Meerrettichperoxidase (HRP) schützenLife</td> <td>Technologies, Grand Island, NY</td><td>A12216</td><td>Amplex Rotes Cholesterin-Assay-Kit. &bull; &le; &ndash; 20°; C & Bulle; Trockenmittel & Bulle Vor leichter</td></tr><tr><td>Cholesterinesterase schützen.</td><td>Life Technologies, Grand Island, NY</td><td>A12216</td><td>Amplex Assay-Kit für rotes Cholesterin. &bull; &le; &ndash; 20°; C & Bulle; Trockenmittel & Bulle Schutz vor Licht</td></tr><tr><td>Cholesterin-Referenzstandard</td><td>Life Technologies, Grand Island, NY</td><td>A12216</td><td>Amplex Rotes Cholesterin-Assay-Kit. &bull; &le; &ndash; 20°; C & Bulle; Trockenmittel & Bulle Schutz vor Licht</td></tr><tr><td>Resorufin-Fluoreszenz-Referenzstandard</td><td>Life Technologies, Grand Island, NY</td><td>A12216</td><td>Amplex Red Cholesterol Assay Kit. &bull; &le; &ndash; 20°; C & Bulle; Trockenmittel & Bulle Vor Licht schützen</td></tr><tr><td>5x Reaktionspuffer.</td><td>Life Technologies, Grand Island, NY</td><td>A12216</td><td>Amplex Assay-Kit für rotes Cholesterin. &bull; &le; &ndash; 20°; C & Bulle; Trockenmittel & Bulle Vor Licht schützen</td></tr><tr><td>HDL-Cholesterin Automatisiertes Reagenz</td><td>ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA.</td><td>TR39601</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Unternehmen</td><td>Katalognummer</td><td>Kommentare</td></tr><tr><td>Plasticware</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Platten (Polypropylen, flacher Boden, klar).</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M0687</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Platten (Polypropylen, flacher Boden, schwarz).</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M9936</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL Eppendorf Röhrchen</td><td>Eppendorf</td><td>0030 125.150</td><td></td></tr><tr><td>ClipTip 200, steril</td><td>ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA.</td><td>14-488-058</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Mehrkanalpipetten, 8 Kanäle, 125&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific Co., San Jose, Kalifornien, USA.</td><td>&nbsp; 14-387--955<</td><td></td></tr><tr><td>strong>Name</td><td>Company</td><td>Katalognummer<</td><td>strong>Kommentare<</td></tr><tr><td>strong>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gen5 2.01 Software</td><td>Biotek, Vermont, USA</td><td>NA</td><td></td></tr><<tr><td>strong>Name</td><td> Company</td><td>Katalognummer</td><td>Kommentare</td></tr><tr><td>Ausrüstung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gen5 Plattenleser</td><td>Biotek, Vermont, USA</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

zellfreie biochemische fluorometrisch enzymatische assays für hochdurchsatz-messung der lipidperoxidation in high-density lipoprotein

Cell-free Biochemical Fluorometric Enzymatic Assay for High-throughput Measurement of Lipid Peroxidation in High Density Lipoprotein

Niedrige High-density-Lipoprotein-Cholesterin (HDL-C) Ebenen sind einer der leistungsstärksten unabhängigen negative Prädiktoren für arteriosklerotische Herz-Kreislauf-Erkrankungen (CVD). Die Struktur und Funktion von HDL statt HDL-C können Arteriosklerose genauer vorherzusagen. Mehreren Veränderungen HDL Protein- und Lipid kompositorischen, die HDL-Funktion beeinträchtigen in entzündlichen Zuständen wie Arteriosklerose. HDL-Funktion richtet sich normalerweise nach zellbasierte Assays wie Cholesterin-Efflux-Assay, aber diese Tests haben zahlreiche Nachteile fehlende Standardisierung. Zellfreie Assays können robustere Maßnahmen der HDL-Funktion im Vergleich zu zellbasierte Assays geben. HDL-Oxidation beeinträchtigt HDL-Funktion. HDL hat eine Hauptrolle in Lipid Peroxid Transport und hohes Maß an Lipid-Peroxide bezieht sich auf abnormale HDL-Funktion. Lipid-Sonde Interaktionen sollten als Interpretation der Ergebnisse der nicht-enzymatische Fluoreszenz Tests zur Messung der Lipid oxidativen Status berücksichtigt werden. Dies hat uns motiviert, entwickeln eine zellfreie biochemische enzymatische Methode zur HDL Peroxid Lipidgehalt (HDLox) zu ermitteln, die zur HDL Dysfunktion beiträgt. Diese Methode basiert auf der Enzym-Meerrettich-Peroxidase (HRP) und Fluorochrom Amplex Red, die (ohne Cholesterin Oxidase) Peroxid Fettgehalt pro mg von HDL-c quantifizieren kann Hier ist ein Protokoll Describedfor Bestimmung des HDL-Lipid Peroxidation verwenden das Fluorochrom-Reagenz. Assay-Variabilität kann durch strikte Standardisierung der experimentellen Bedingungen reduziert werden. Höhere HDLox Werte sind verringerte HDL antioxidative Funktion zugeordnet. Das Auslesen dieser Assay ist verbunden mit Anzeigen von validierten zellbasierte Assays, Surrogat Maßnahmen von kardiovaskulären Erkrankungen, systemische Entzündung, Immun-Dysfunktion und damit verbundene Risiko für Herz-Kreislauf- und Stoffwechselerkrankungen Phänotypen. Dieser technische Ansatz ist eine robuste Methode zur HDL-Funktion in der menschlichen Krankheit zu beurteilen, wo systemische Entzündung, oxidativer Stress und oxidierten Lipide eine wichtige Rolle (z.B. Arteriosklerose haben).

50 µL jeder HDL-Probe werden in jedem Brunnen wie in Schritt 7.3 hinzugefügt. 50 µL HRP-Lösung 5 U/mL (0,25 U) werden dann in jedem Brunnen wie in Schritt 7,5 hinzugefügt. Proben sind für 30 min bei 37 ° C wie in Schritt 7.6 inkubiert. 50 µL Reagenz Fluorochrom sind dann in jedem Brunnen wie in Schritt 7,7 (Endkonzentration von 300 µM) hinzugefügt. Das fluoreszierende auslesen (im Dunkeln) wird dann jede Minute mehr als 120 Minuten bei 37 ° C mit einem fluoreszierenden Platte-Lesegerät (5...

Wir beschreiben hier ein fluorometrisch zellfreie biochemischen Assays zur Bestimmung von HDL-Lipidperoxidation. Dieser schnellen und reproduzierbaren Assay kann zur HDL-Funktion in groß angelegte Studien zu bestimmen und zu unserem Verständnis der HDL-Funktion in der menschlichen Krankheit beitragen kann.

Zellfreie biochemische fluorometrisch enzymatische Assays für Hochdurchsatz-Messung der Lipidperoxidation in High-Density Lipoprotein

Low high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) levels are one of the most powerful independent negative predictors of atherosclerotic cardiovascular ...

Das übergeordnete Ziel dieser experimentellen Methode ist es, die Funktion von Lipoproteinen hoher Dichte mit Hilfe eines biochemischen zellfreien Assays zu bestimmen, der den Lipidperoxidgehalt einer bestimmten Menge HDL misst. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen in verschiedenen Bereichen der Medizin zu beantworten, wie z. B. die Rolle der HDL-Funktion bei Stoffwechselanomalien bei Herz-Kreislauf-Erkrankungen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass es sich um eine zellfreie biochemische Methode handelt, mit der die HDL-Funktion zuverlässig bestimmt werden kann.Obwohl diese Methode einen Einblick in die Rolle der HDL-Funktion bei Herz-Kreislauf-Erkrankungen und Stoffwechselanomalien geben kann, kann sie auch auf andere Studien über Krankheiten, wie z. B. entzündliche Erkrankungen, angewendet werden. Zu Beginn dieses Verfahrens bereiten Sie das Arbeitslayout für die 96-Well-Platte vor, einschließlich der entsprechenden Kontrollen, Proben und Replikate, wie im Textprotokoll beschrieben. Berechnen Sie das Volumen der benötigten Reagenzien basierend auf der Anzahl der Proben und Replikate.Beschriften Sie die Röhrchen mit einem Permanentmarker für jeden Schritt des Assays. Kombinieren Sie als Nächstes 10 Mikroliter aus jeder Probe, um eine gepoolte Kontrollprobe zu erstellen. Erstellen Sie eine zweite gepoolte Kontrollprobe für das klinische Labor, um den HDL-C-Wert zu bestimmen.Nachdem Sie einen großen HDL-Vorrat vorbereitet haben, kryokonservieren Sie mehrere Aliquots, um die Auftauzyklen beim Einfrieren zu minimieren. Fassen Sie mindestens 10 verschiedene Replikate zusammen, um eine gepoolte Qualitätskontrolle zu erstellen. Bestimmen Sie dann den Durchschnittswert von HDLox, wie im Textprotokoll beschrieben.Erstellen Sie eine zweite gepoolte Qualitätskontrolle für das klinische Labor, um den HDL-C-Wert zu bestimmen. Tauen Sie zunächst eine frische Plasma- oder Serumprobe auf. Mischen Sie gleiche Volumina Plasma- und HDL-Cholesterin-Fällungsreagenz.Pipettieren Sie mehrmals auf und ab, um gut zu mischen. Bei einer Geschwindigkeit zwischen 1000 und 2000 mal G für 10 Minuten zentrifugieren. Danach wird der Überstand abgesaugt.Lagern Sie das isolierte HDL bei vier Grad Celsius, bis es für die Durchführung des Fluorochrom-HDL-Funktionsassays bereit ist. Wenn der HDL-C-Wert des klinischen Labors zur Normalisierung von HDLox verwendet wird, quantifizieren Sie den HDL-C-Wert aus dem Plasma, wie im Textprotokoll beschrieben. Mischen Sie zunächst Cholesterin und HRP, so dass die vorbereiteten Lösungen fünf Einheiten pro Milliliter HRP enthalten.Tauen Sie ein Fläschchen mit dem Fluorochromreagenz und ein Fläschchen mit DMSO auf Raumtemperatur auf. Nach dem Auftauen lösen Sie ein Milligramm Fluorochrom-Reagenz in 200 Mikrolitern DMSO. Lagern Sie diese Lösung bei einer Temperatur unter minus 20 Grad Celsius und dabei vor Licht geschützt.Geben Sie anschließend 50 Mikroliter 1X-Reaktionspuffer als Negativkontrolle in die Probenplatte. Geben Sie 50 Mikroliter 20 millimolare Wasserstoffperoxid-Arbeitslösung als Positivkontrolle hinzu. Stellen Sie danach eine frische 96-Well-Platte mit rundem Boden bereit, die als Vorbereitungsplatte verwendet werden soll.Geben Sie 200 Mikroliter isoliertes HDL in jede Vertiefung dieser Vorbereitungsplatte. Übertragen Sie mit einer Mehrkanalpipette 50 Mikroliter HDL von der Präparationsplatte auf die Versuchsplatten, wie im Textprotokoll beschrieben, wobei die Anzahl der Versuchsplatten der Anzahl der Replikate im Assay entspricht. Geben Sie danach 50 Mikroliter vorbereitete HRP-Lösung in jede Vertiefung.Inkubieren Sie 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius und geben Sie dann 50 Mikroliter Fluorochrom-Reagenz in jede Vertiefung, was ein Gesamtvolumen von 150 Mikrolitern pro Vertiefung ergibt. Gut mischen und vor Licht schützen. Bewerten Sie mit einem Fluoreszenzplatten-Lesegerät die Fluoreszenzanzeige bei 37 Grad Celsius im Dunkeln jede Minute für 120 Minuten.Zeichnen Sie die Daten mit einer geeigneten Software auf und berechnen Sie dann den Mittelwert der Fluoreszenzeinheiten, wie im Textprotokoll beschrieben. In dieser Studie wird ein zellfreier biochemischer fluorometrischer Assay entwickelt, um den HDL-Lipidperoxidgehalt pro Milligramm HDL-C zu quantifizieren. Dies wird durch enzymatische Amplifikation mittels HRP erreicht.Ein Fluoreszenzplatten-Reader wird dann verwendet, um die Fluoreszenz im Dunkeln 120 Minuten lang jede Minute zu messen. Repräsentative Daten für einen Patienten, von dem bekannt ist, dass er eine dysfunktionale HDL hat, sind hier im Vergleich zur gepoolten Kontrolle dargestellt. Es wird festgestellt, dass das dysfunktionale HDL einen doppelt so hohen Lipidperoxidspiegel aufweist wie im gepoolten HDL von gesunden Teilnehmern.Anschließend wird der HDL isoliert und HDLox bei 50 gesunden Probanden und 100 HIV-infizierten Patienten bestimmt. Es wird festgestellt, dass die HIV-infizierten Patienten im Durchschnitt einen um 60 % höheren HDL-Peroxid-Gehalt pro Milligramm HDL-C aufweisen als die gesunden Probanden. Einmal gemeistert, kann diese Technik in weniger als sechs Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, alle Reagenzien und Kontrollen im Voraus vorzubereiten, konsistent und präzise zu sein und immer die entsprechende experimentelle Kontrolle in jede Versuchsplatte aufzunehmen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie das HDL isolieren, den Lipidperoxidgehalt einer bestimmten Menge HDL bestimmen und unsere HDL-Funktion beeinträchtigen können. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Bioproben äußerst gefährlich sein kann und bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie Handschuhe getroffen werden sollten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

De novo Lipogenese und β-Oxidation von Fettsäuren bilden Schlüsselstoffwechselwege in Hepatozyten, Wege, die in mehreren Stoffwechselstörungen, einschließlich Fettleber gestört werden. Hier zeigen wir Isolierung von Maus primären Hepatozyten und zu beschreiben, die Quantifizierung der β-Oxidation von Fettsäuren und Lipogenese.

Bestimmung der Fettsäureoxidation und Lipogenese in Maus primären Hepatozyten

Wir beschreiben einen fluoreszenzbasierten Assay zur Messung von Phospholipid-Scrambling in großen unilamellären Liposomen, die mit Opsin rekonstituiert wurden.

Ein Fluoreszenz-basierte Assay von Phospholipid Scramblase Activity

Dieses Protokoll bietet einen effizienten Ansatz zur Messung von LDL-Cholesterin-Aufnahme mit Real-Time Zustrom Raten mit einem live Cell imaging-System in verschiedenen Zelltypen. Diese Technik bietet eine Plattform die pharmakologische Aktivität von Verbindungen beeinflussen LDL Zustrom während der Überwachung für Zellmorphologie und damit potenzielle Zytotoxizität auf dem Bildschirm.

LDL-Cholesterin-Aufnahme-Assay mit Live Cell Imaging-Analyse mit Zelle Systemüberwachung

Messung der in-vitro-Cholesterin Efflux Fähigkeit, Serum oder Plasma in Makrophagen Zellmodellen ist ein viel versprechendes Instrument als Biomarker für Atherosklerose. In der vorliegenden Studie wir optimieren und standardisieren eine fluoreszierende NBD-Cholesterin-Efflux-Methode und eine Hochdurchsatz-Analyse mit 96-Well Platten zu entwickeln.

Hochdurchsatz-Nitrobenzoxadiazole-Label Cholesterin-Efflux-Assay

Hier wird ein quantitatives Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktionsprotokoll zur Bestimmung des nativen Mikro-RNA-Gehalts (absolute/relativ) von Lipoprotein-Partikeln vorgestellt. Darüber hinaus wird eine Methode zur Erhöhung des Mikro-RNA-Niveaus sowie eine Methode zur Bestimmung der zellulären Aufnahmevorrate von Lipoprotein-Partikeln demonstriert.

Anreicherung von Ureinium Lipoprotein-Partikeln mit Mikro-RNA und anschließender Bestimmung ihrer Absolute/Relative MicroRNA-Inhalte und ihrer Celluläre Transferquote

Hier wird ein sensitiver Fluoreszenztest zur Überwachung der Apolipoprotein-N-Acyltransferase-Aktivität unter Verwendung von Diacylglycerylpeptid und Alkin-Phospholipiden als Substrate mit Klickchemie vorgestellt.

Klickchemischer fluorometrischer Assay für Apolipoprotein-N-Acyltransferase von der Enzymcharakterisierung bis zum Hochdurchsatz-Screening

Hier beschreiben wir Protokolle mit fluoreszierenden Lipidsensoren und Liposomen, um festzustellen, ob ein Protein Phosphatidylserin oder Phosphatidylinositol-4-phosphat in vitroextrahiert und transportiert.

Fluoreszenzbasierte Messungen des Phosphatidylserin/Phosphatidylinositol-4-Phosphat-Austauschs zwischen Membranen

Degenerative Augenerkrankungen, die die retinale Pigmentepithelschicht des Auges betreffen, sind monogenen und polygenen Ursprungs. Mehrere Krankheitsmodelle und eine Softwareanwendung, LipidUNet, wurden entwickelt, um Krankheitsmechanismen sowie mögliche therapeutische Interventionen zu untersuchen.

LipidUNet-Machine-Learning-basierte Methode zur Charakterisierung und Quantifizierung von Lipidablagerungen unter Verwendung von iPSC-abgeleitetem retinalem Pigmentepithel

Wir beschreiben ein Verfahren zur Verwendung von Cyclodextrin, um den Austausch zwischen Lipiden der Plasmamembran und exogenen Lipiden zu vermitteln. Diese Technik kann mit Experimenten kombiniert werden, in denen Transmembranproteine untersucht werden, die sich in Lipid-Raft-ähnlichen Umgebungen anders verhalten als in nicht-Raft-ähnlichen Umgebungen.

Lipidaustausch-Assay in lebenden Zellen

Dieses Protokoll beschreibt einen in vitro Assay zur Messung der zellulären Lipidaufnahme in Endothelzellen nach Stimulation mit BODIPY-C12 und BODIPY-C16 fluoreszierenden Analoga von langkettigen und sehr langkettigen gesättigten Fettsäuren. Diese Methode ist effizient und an andere Zelltypen anpassbar und bietet einen nützlichen Ansatz zur Untersuchung des Fettstoffwechsels.

Quantifizierung der endothelialen Fettsäureaufnahme mit Hilfe von fluoreszierenden Fettsäureanaloga

Darin beschreiben wir die Protokolle zur Messung der Menge an fluoreszierendem Phospholipid, die spezifisch aus Lipidspenderpartikeln durch High-Density-Lipoprotein (HDL) entfernt wird, das im gesamten menschlichen Plasma oder Serum vorhanden ist. Wir haben gezeigt, dass diese Metrik der HDL-Funktionalität das Auftreten von Herz-Kreislauf-Erkrankungen vorhersagt.

High-Density-Lipoprotein-spezifischer Phospholipid-Efflux-Assay

Lernen Sie eine zellfreie fluorometrische Methode zur Hochdurchsatz-Messung der Lipidperoxidation in HDL. Diese biochemische Technik ermöglicht die zuverlässige Bestimmung der HDL-Funktion für kardiovaskuläre und metabolische Forschung.

Zellfreie biochemische fluorometrisch enzymatische Assays für Hochdurchsatz-Messung der Lipidperoxidation in High-Density Lipoprotein (Video) | JoVE Journal

Zellfreie biochemische fluorometrisch enzymatische Assays für Hochdurchsatz-Messung der Lipidperoxidation in High-Density Lipoprotein

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