Prostata-Krebs Zelle Modellgeneration des Widerstandes gegen die Anti-mitotische Agent Docetaxel

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, experimentelle Modelle für Docetaxel-resistente Krebszellen zu generieren, um molekulare Mechanismen zu untersuchen, die die Resistenz gegen antimitotische Therapien antreiben. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen in der Krebszellbiologie und im genomatischen Bereich zu beantworten, wie z. B. die Identifizierung der Signalwege, die zum Fortschreiten der Krankheit beitragen, und die Bestimmung potenziell zielgerichteter Strategien. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie neben der Verwendung von Tumorproben und Tiermodellen eine zuverlässige und einfache Möglichkeit ist, experimentelle Modelle zur Untersuchung der Reaktionen auf Krebsmedikamente zu erstellen.

Das Verfahren wird von Lisa Mohr, einer Postdoktorandin aus meinem Labor, und Jungreem Woo, einer weiteren Postdoktorandin in unserem Team, demonstriert. Zu Beginn dieses Verfahrens werden die Zellen DU145 oder 22Rv1 in die 150 Zentimeter großen quadratischen Kolben mit 20 Millilitern Medium plädiert. Nach 24 Stunden, wenn die Zellen bei etwa 70 bis 80 % Konfluenz sind, fügen Sie Docetaxel bei fünf Nanomolaren hinzu.

Nach 72 Stunden aspirieren Sie das arzneimittelhaltige Medium und fügen Sie frisches Docetaxel-freies Medium hinzu. Wechseln Sie das Medium alle drei bis vier Tage. Warten Sie ein bis zwei Wochen, bis Klone im Kolben erscheinen.

Das Medium wird aspiriert, die Zellen vorsichtig mit 15 Millilitern PBS gewaschen und drei bis fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius mit vier Millilitern 0,05 %igem Trypsin-EDTA inkubiert, um die Zellen von der Kolbenoberfläche zu lösen. Dann werden die trypsinisierten Zellen mit acht Millilitern frischem Medium wieder aus dem Kolben suspendiert. Die Zellen werden aus allen behandelten Kolben entnommen und durch Zentrifugation pelletiert.

Entfernen Sie anschließend die Superna-den, suspendieren Sie das Zellpellet wieder in 20 Millilitern frischem Medium und plattieren Sie die Zellen in 150 Zentimeter großen quadratischen Kolben. Nach 24 Stunden, wenn die Zellen bei etwa 70 bis 80 % Konfluenz sind, fügen Sie erneut fünf nanomolare Docetaxel hinzu. Wiederholen Sie die Verfahren wie zuvor gezeigt, bis die Klone im Kolben erscheinen.

Dann die Zellen wieder in 150 Zentimeter quadratische Kolben füllen. Nach 24 Stunden, wenn die Zellen bei etwa 70 bis 80 % Konfluenz sind, behandeln Sie sie mit 10 nanomolaren Docetaxel. Wiederholen Sie die gleichen Schritte in der Art und Weise der Dosissteigerung von Docetaxel und sammeln Sie die überlebenden Klone nach jeder Konzentrationsbehandlung.

Am Ende des Prozesses erhalten Sie einen Pool resistenter Zellen, die für den experimentellen Einsatz bereit sind. Bei diesem Verfahren werden 2.000 Zellen mit 2 Millilitern Medium pro Vertiefung in die sechs Vertiefungsplatten eingeteilt. Nach 24 Stunden fügen Sie steigende Konzentrationen von Docetaxel sowohl für DU145- als auch für 22Rv1-Zelllinien hinzu.

Geben Sie DMSO nur in eine Vertiefung als Kontrolle mit der gleichen Lautstärke, die für die höchste Docetaxel-Dosis verwendet wird. Nach 72 Stunden aspirieren Sie das arzneimittelhaltige Medium und fügen Sie frisches Docetaxel-freies Medium hinzu. Inkubieren Sie die Platten ein bis zwei Wochen lang, bis die Kolonien unter dem Mikroskop sichtbar sind.

Um die Kolonien zu färben, waschen Sie sie vorsichtig mit zwei bis drei Millilitern PBS. Inkubieren Sie sie mit zwei bis drei Millilitern kristallvioletter Lösung für 20 Minuten in der Gewebekulturhaube oder einem Abzug. Entfernen Sie anschließend die stehende Lösung und waschen Sie die Platten mit zwei bis drei Millilitern Wasser.

Entfernen Sie dann das Wasser und trocknen Sie die Platten an der Luft. Machen Sie digitale Bilder der Platten für die Darstellung von Figuren. Analysieren Sie das Ergebnis, indem Sie die Vertiefungen visualisieren und die Völker mit Hilfe eines Markierungsstifts manuell zählen.

Und stellen den Prozentsatz der Zellviabilität in einem Diagramm dar. Hier ist ein Diagramm, das die Bestimmung des Docetaxel IC50 in den elterlichen Prostatakrebs-Zelllinien DU145 und 22Rv1 darstellt. Die erwarteten Prozentsätze der Zellviabilität in den erforderlichen Docetaxel-Dosis-eskalierenden Konzentrationen sind hier dargestellt.

Und hier sind die repräsentativen Hellfeldmikroskopie-Aufnahmen von DU145- und 22Rv1-Zellen zu den angegebenen Zeitpunkten während der Erzeugung von Docetaxel-Resistenzen. Rote Pfeile zeigen einen Docetaxel-resistenten Klon an, nachdem das Protokoll abgeschlossen wurde. Hier sind die repräsentativen Koloniebildungsassays dargestellt, die der funktionellen Validierung der Docetaxel-resistenten Zellen entsprechen.

Die Zellen wurden steigenden Docetaxel-Konzentrationen ausgesetzt und das Überleben wurde durch Kristallviolett-Färbung bewertet. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie arzneimittelresistente Zelllinien generieren und validieren können, die dann für Untersuchungen und Verfahren Ihrer Wahl wie Genexpressionsanalysen und genetische Manipulationen verwendet werden können. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.