Großes Volumen, verhaltensorientierte relevanten Beleuchtung für Optogenetik bei nichtmenschlichen Primaten

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, einen großvolumigen Gewebeilluminator zu entwickeln, der sich gut für optogenetische Manipulationen bei nicht-menschlichen Primaten eignet. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Neurowissenschaften zu beantworten, z. B. wie die Populationen von Neuronen in den verschiedenen Hirnregionen zum Verhalten beitragen und wie sich zeitlich spezifische neuronale Feuermuster in einer Region auf eine andere Region auswirken können. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie Licht verwendet und somit die optogenetische Manipulation großer verhaltensrelevanter Gehirnvolumina mit minimaler Gewebeschädigung ermöglicht.

Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich aufgrund der Ähnlichkeiten zwischen dem menschlichen und dem nicht-menschlichen Primatengehirn auf die translationale Medizin. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da es etwas Übung erfordert, beim Ziehen dieser Fasern den richtigen Druck auszuüben. Um diesen Vorgang zu starten, verwenden Sie eine scharfe Schere, um einen Abschnitt aus Kunststoff-Glasfaser mit einem Durchmesser von 250 Mikrometern zu schneiden, der mindestens 10 Zentimeter länger ist als die gewünschte Gesamtlänge des Beleuchtungskörpers.

Entfernen Sie anschließend 15 bis 20 Zentimeter des Polyethylenmantels mit einer 22-Gauge-Abisolierzange von einem Ende der optischen Kunststofffaser. Befestigen Sie dann die distalsten drei bis fünf Zentimeter des abisolierten Endes der Faser in einer Tischschraubstockklemme. Halten Sie das ummantelte Ende der Faser in einer Hand mit einem konstanten, gleichmäßigen Zug straff.

Die Faser sollte parallel zum Boden verlaufen und vom Schraubstock weggezogen werden. Halten Sie diese konstante Spannung auf der Faser während des Erhitzens und Abkühlens aufrecht, damit die Faser beim Verdünnen gerade und straff bleibt. Erhitzen Sie den abgestreiften Abschnitt der Faser mit der niedrigsten Einstellung einer Heißluftpistole mit zwei Temperaturen, bis er auf einen Durchmesser von 60 bis 100 Mikrometern oder etwa den Durchmesser eines menschlichen Haares verdünnt ist.

Halten Sie die Spannung auf der Faser konstant, während Sie sie abkühlen lassen. Wenn die Spannung nicht aufrechterhalten wird oder die Faser überhitzt wird, kann dies dazu führen, dass sich die Faser kräuselt und/oder bricht. Um die Spannung auf der Faser beim Erhitzen konstant zu halten, verwenden Sie Ihre nicht dominante Hand, damit Sie nicht loslassen müssen, wenn Sie die Heißluftpistole verwenden.

Außerdem können Sie die Faser sanft um Ihre Handfläche wickeln, um einen noch besseren Halt zu erhalten. Sobald die Faser vollständig abgekühlt ist und der gewünschte Durchmesser erreicht ist, kneifen Sie die Faser auf beiden Seiten drei Zentimeter von der schmalsten Stelle entfernt zusammen. Trennen Sie mit einem schnellen, scharfen Zug entlang der Achse der Faser die Seiten, um eine sich verjüngende Spitze zu erhalten.

Untersuchen Sie dann die konische Spitze bei geringer Leistung unter einem Präpariermikroskop. Wenn die Spitze gegabelt oder gewellt ist, entsorge die Faser. Selbst mit viel Übung wird etwa ein Drittel der Fasern gegabelte oder gekräuselte Spitzen haben.

Wir werfen diese Fasern einfach weg, anstatt zu versuchen, sie zu reparieren, da es so schnell und kostengünstig ist, eine andere zu ziehen. Bereiten Sie das Ätzen der konischen Spitze vor, indem Sie ein Stück Laborband in die Nähe des Endes der Spitze legen und die gewünschte Spitzenlänge freilegen. Hier werden die letzten fünf Millimeter freigelegt.

Das Band schützt die Faser vor Ätzungen über die gewünschte Länge der Lichtemission hinaus. Falten Sie danach ein kleines Quadrat aus fünf Mikrometer Siliziumkarbid-Läppblech zwischen Daumen und Zeigefinger. Platzieren Sie die Spitze der Faser zwischen den beiden Seiten des Läppblechs und ätzen Sie die Faser vorsichtig mit kleinen kreisenden Bewegungen.

Drehen Sie die Faser häufig, so dass alle Seiten gleichmäßig geätzt werden. Entfernen Sie anschließend etwa fünf Millimeter des Polyethylenmantels mit einer 22-Gauge-Abisolierzange vom gegenüberliegenden Ende der Beleuchtung. Schneiden Sie dann das gegenüberliegende Ende mit einem heißen Messer flach, um die Oberfläche zu glätten.

Befestigen Sie einen Stecker am Ende der Beleuchtung gegenüber der geätzten Spitze. Dadurch kann der Illuminator an ein optisches Kabel oder einen Laser angeschlossen werden. Anschließend polieren Sie das gegenüberliegende Ende flach mit sukzessive feineren Läppblechen.

Führen Sie anschließend das flache gegenüberliegende Ende in eine Edelstahlhülse mit einem Innendurchmesser von 260 Mikrometern ein, bis es bündig mit dem Ende der Aderendhülse abschließt. Bestätigen Sie visuell, dass das gegenüberliegende Ende glatt und gleichmäßig poliert ist, indem Sie ein Fasermikroskop verwenden. Kleben Sie die Zwinge senkrecht an die Tischkante, wobei die kleinere Öffnung der Zwinge nach unten zeigt.

Füllen Sie dann eine Ein-Milliliter-Spritze mit Kunststoff-Epoxidharz und befestigen Sie eine stumpfe 18-Gauge-Nadel an der Spritze. Tragen Sie anschließend mit der Nadel Epoxidharz nach unten in die Ferrule auf. Füllen Sie die Zwinge vollständig mit Epoxidharz.

Führen Sie die Faser so in die Aderendhülse ein, dass sie bündig mit der Unterseite der Aderendhülse abschließt. Wischen Sie bei Bedarf überschüssiges Epoxidharz von der polierten Oberfläche der Faser mit einem feuchten, fusselfreien Tuch ab, bevor Sie sie trocknen. Bereiten Sie in diesem Schritt vor jeder Testsitzung ein Tower-Mikrolaufwerk vor.

Befestigen Sie dann ein 25-Gauge-Führungsrohr mit abgeschrägter Spitze an der unteren Klemme am Antrieb. Befestigen Sie die großvolumige Beleuchtung in der oberen Klemme am selben Antrieb. Diese Klemme wird am Antriebsmotor befestigt.

Fädeln Sie anschließend die großvolumige Beleuchtung vollständig durch das Führungsrohr und vergewissern Sie sich, dass die Spitze der Beleuchtung über die Spitze des Führungsrohrs hinausragt. Alternativ kann Laborband auf die Faser aufgebracht werden, so dass das Band und nicht die Faser selbst geklemmt wird, um die Faser zu schützen. Weichen Sie anschließend das Führungsrohr und den Illuminator zur Sterilisation in einer antiseptischen Lösung ein.

Platzieren Sie ein speziell sterilisiertes Gitter mit einem Lochabstand von einem Millimeter in der Reinkammer und befestigen Sie es mit der Schraube an der Seite der Kammer in einer vorgegebenen Ausrichtung. Ziehen Sie die sterilisierte Beleuchtung aus dem Führungsrohr zurück, indem Sie die Beleuchtung mit einer sterilen, stumpfen Pinzette nach oben ziehen. Die Spitze des Illuminators sollte fünf bis 10 Millimeter über der Spitze des Führungsrohrs liegen.

Befestigen Sie das Mikrolaufwerk an der Halterung und setzen Sie das Führungsrohr in das Zielgitterloch ein. Senken Sie dann die Mikroantriebsstufe ab, bis das Führungsrohr gerade durch das Niveau der Dura hindurch ist. Senken Sie gleichzeitig die Beleuchtung manuell mit einer sterilen Pinzette ab.

Wenn es einen Widerstand gibt, ziehen Sie die Beleuchtung fünf bis 10 Millimeter ein, warten Sie 10 Minuten und versuchen Sie es erneut. Wenn beim zweiten Versuch immer noch Widerstand vorhanden ist, ziehen Sie die Beleuchtungsspitze in das Führungsrohr ein, senken Sie das Führungsrohr um 0,25 Millimeter ab und versuchen Sie es erneut. Verbinden Sie die Ferrule am anderen Ende der Beleuchtung mit der größeren Optik oder dem Laser.

Diese Abbildung zeigt, dass die Fehlerquoten mit der Beleuchtung deutlich anstiegen. Und die Rasterdiagramme hier zeigen die Hemmung von Neuronen, die sich über die 2,5 Millimeter Dicke des Kortex erstrecken. Und das lokale Feldpotential, das das Lichtartefakt mit einer Spannweite von 4,5 Millimetern zeigt.

Einmal gemeistert, kann mit dieser Technik in 10 bis 15 Minuten plus Epoxidtrocknungszeit ein großvolumiger Strahler gebaut werden. Die Kalibrierung dauert noch etwa eine halbe Stunde, so dass wir zur Maximierung der Effizienz in der Regel mehrere Beleuchtungen gleichzeitig herstellen. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, dass viele der Beleuchtungen die Qualitätskontrollstandards nicht erfüllen.

Das ist okay. Wenn sie die Spitzeninspektion nicht bestehen, entsorgen wir sie. Wenn sie jedoch die Kalibrierung nicht bestehen, polieren wir sie in der Regel neu und wiederholen die Kalibrierung.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik Forschern auf dem Gebiet der Neurowissenschaften den Weg, die Optogenetik zu nutzen, um das neuronale Feuern zu unterdrücken und das Verhalten bei nicht-menschlichen Primaten zu modulieren. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man einen großvolumigen Gewebeilluminator konstruiert.