Name: Großes Volumen, verhaltensorientierte relevanten Beleuchtung für Optogenetik bei nichtmenschlichen Primaten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Lernen Sie die Herstellung eines großvolumigen Gewebe-Illuminators für Optogenetik bei nichtmenschlichen Primaten. Diese Methode ermöglicht präzise Lichtstimulation mit minimalem Gewebeschaden für neurowissenschaftliche Verhaltensstudien.

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LCA nimmt zur Kenntnis, Finanzierung von einer NDSEG Gemeinschaft, die NSF GRFP und die Freunde des Instituts McGovern. EP nimmt zur Kenntnis, Finanzierung, die Harry und Eunice Nohara UROP Fund, der MIT Klasse von 1995 UROP Fonds, und die MIT UROP Fund. ESB nimmt zur Kenntnis, Finanzierung von NIH 2R44NS070453-03A1, die IET-Harvey-Preis und den New York Stem Cell Foundation-Robertson Award. RD erkennt Finanzierung von NIH EY017292. Michael Williams half dem Team zu organisieren und Vorräte vor Dreharbeiten.

Hinweis: alle tierische Verfahren gemäß den Richtlinien des NIH und wurden genehmigt durch Massachusetts Institute des Technology Committee on Animal Care.
 1. Illuminator Herstellung <ol><li>ein paar der scharfen Schere verwenden, um einen Schnitt von 250 µm Durchmesser Kunststoff-Lichtwellenleiter, die mindestens 10 cm länger als die gewünschte Summe Illuminator ist.</li>
	<li>15-20 cm von Polyethylen Jacke zu entfernen, von einem Ende der Kunststoff-Lichtwellenleiter mit einem 22 Gauge Abisolierzange.</li>
	<li>Sichern die meisten 3-5 cm das abisolierte Ende der Faser in einem Schraubstock Tischklemme distal.</li>
	<li>Halten die doppelwandige Ende der Faser straff in der Hand mit einem konstanten stetigen Zug. Die Faser sollte parallel zum Boden, senkrecht zu den Schraubstock. Pflegen Sie diese konstanten Spannung auf der Faser in der gesamten Heizung und Kühlung (Schritte 1,5 und 1,6 unten), so dass die Faser bleibt gerade und straff wie es lichtet.</li>
	<li>Mit der niedrigsten Einstellung von einer doppelten Temperatur Heißluftpistole (570/1.000 ° F), die abgespeckten Abschnitt der Faser erhitzen, bis es auf einen Durchmesser von 60-100 μm oder über den Durchmesser eines menschlichen Haares ausgedünnt ist.</li>
	<li>Pflegen die konstante Spannung auf der Faser beim erlauben der Faser zu kühlen. Fehlerhafte Wartung Spannung verursachen die Faser zu kräuseln.</li>
	<li>Bestätigen die Durchmesser der ausgedünnten Spitze unter dem sezierenden Mikroskop. Alternativ kann man Bremssättel stattdessen verwenden.
	<ol><li>Die Faser nicht dünn genug ist, wiederholen Sie die Schritte 1,4 bis 1,6 je nach Bedarf die gewünschte Spitzendurchmesser zu erreichen.</li>
		<li>Optional wenn neu ziehen, legen eine kleine Markierung am schmalsten Teil der Faser wenn es wieder erhitzt wird, so dass das Zentrum der Heißluftpistole zielt auf den schmalsten Teil der Faser.</li>
		<li>Wenn die Faser zu dünn ist, von vorne beginnen.</li>
	</ol></li> <li>Sobald die Faser vollständig abgekühlt hat und der gewünschte Durchmesser erreicht wurde, drücken Sie die Faser 3 cm an der schmalsten Stelle auf beiden Seiten. Mit einer schnellen, scharfen ziehen entlang der Achse der Faser, trennen Sie die Seiten um eine kegelförmige Spitze zu erstellen.</li>
	<li>Untersuchen die kegelförmige Spitze unter einem low-Power (z.B. 4 X) auf Dissektion Mikroskop. Wenn die Spitze gegabelt oder ( Abb. 1f gewellt), entsorgen Sie die Faser.</li>
	<li>Vorbereiten, die kegelförmige Spitze Ätzen, indem man ein Stück Klebeband Labor nahe dem Ende der Spitze, so dass die letzte 5 mm ausgesetzt. Das Band schützt die Faser Radierung über die gewünschte Länge der Lichtemission. Diese Spitzenlänge wurde ausgewählt anhand der Dicke der Primas Kortex in der Zielregion. Eine längere oder kürzere Länge könnte abhängig von der gewünschten Länge der Beleuchtung ausgesetzt werden. Wenn ein anderes Etch Spitzenlänge gewünscht wird, der Rand des Bandes Lab kann immer näher gerückt sein, oder weiter entfernt von die kegelförmige Spitze.</li>
	<li>Ein klein (~ 1 Zoll x 2 Zoll) Quadrat von 5 μm Siliciumcarbid Läppen Blatt Umklappen zwischen Daumen und Zeigefinger. Setzen Sie die Spitze der Verbindungslinie zwischen den beiden Seiten des Blattes Läppen und sanft etch die Faser mit kleinen kreisenden Bewegungen, als ob eine BB zwischen Daumen und Zeigefinger zu Rollen. Häufig drehen Sie die Faser, so dass allen Seiten gleichmäßig geätzt werden. Die Faserspitze erscheint &#8220; aufgerauht &#8221; mit dem bloßen Auge in Bereichen, die geätzt worden, während un-geätzte Flächen in der Regel glatt erscheinen.</li>
	<li>Wiederholen Sie Schritt 1.11 mit einer 3 μm Aluminiumoxid Läppen Blatt.</li>
	<li>Befestigen Sie einen Stecker am Ende des Erleuchters gegenüber der geätzten Spitze. Dies ermöglicht der Illuminator Anschluss an ein optisches Kabel oder Laser. 
	Hinweis: Diese Methode unterscheidet sich die bevorzugte Methode für die Festsetzung von Glas / Kieselsäure Glasfasern in Aderendhülsen. Weil Metall zwinge härter als die Kunststoff-Lichtwellenleiter ist, Polieren der Faser und zwinge als Einheit nach Verklebung beschädigen kann die Kunststoff-Lichtwellenleiter als winzige Scherben aus Metall produziert während des Schleifens kann sich in der Wohnung gespalten Faser einbetten.
	<ol><li>Entfernen der Polyethylen-Jacke von der Gegenseite den Strahler mit einem 22 Gauge Abisolierzange ca. 5 mm.</li>
		<li>Schneiden Sie das gegenüberliegende Ende flach mit einem heißen Messer um die Oberfläche zu glätten.</li>
		<li>Der Gegenseite flach mit sukzessive feiner Läppen Polieren Blätter: 3 µm, 1 µm, 5 µm und 0,3 µm.</li>
		<li>Legen Sie die Wohnung gegenüber Ende in eine 260 µm Innendurchmesser Edelstahl zwinge bis er bündig mit dem Ende der Zwinge ist.</li>
		<li>Visuell bestätigen, dass der Gegenseite mit einem Faser-Mikroskop glatt und gleichmäßig poliert wird.</li>
		<li>Entfernen Sie die Faser aus der Zwinge und kleben die Endhülse vertikal am Rande einer Tabelle mit der Faser, die nach unten zeigenden.</li>
		<li>Füllen Sie eine 1 mL Spritze mit Kunststoff Epoxidharz und befestigen Sie eine stumpfe 18-Gauge-Nadel der Spritze.</li>
		<li>Benutzen Sie die Nadel Epoxy hinunter in die Zwinge anwenden. Füllen Sie die Zwinge komplett mit Epoxy.</li>
		<li>Legen Sie die Faser in der Ferrule.</li>
		<li>Wischen jede überschüssige Epoxidharz aus polierten Oberfläche der Faser mit einer feuchten fusselfreien Tuch vor dem Trocknen, wenn nötig. Andernfalls kann überschüssige Epoxidharz nach 12-24 Uhr entfernt werden</li>
		<li>Die Faser vorsichtig bis zur Kalibrierung lagern und legen Sie eine Staubkappe über die Endhülse.</li>
	</ol></li></ol> 2. Beleuchtung-Kalibrierung und Qualitätskontrolle Hinweis: dieser Methoden für die Kalibrierung zu bewerten, für nicht-Linearität in unterschiedlichen Abständen von der Spitze der Faser Lichtleistung. Ungleichmäßige Lichtverteilung in der Regel ergibt sich aus einem &#8220; holprigen &#8221; oder &#8220; wellig &#8221; taper.
<ol><li>Erstellen, die eine leichte Abschirmung Membran für den oberen Teil der integrierenden Kugel mit Licht absorbierenden Folie ( Abbildung 2). 
	Hinweis: Tragen Sie Handschuhe, wenn Umgang mit Licht absorbierenden Folie, um die Haut zu verhindern, dass Öle aus Licht reflektierende Flecken zu schaffen.
	<ol><li>Falte 2 &#8221; durch 4 &#8221; Stück Licht absorbierenden Folie über auf sich selbst zu bilden eine 2 &#8221; 2 &#8221; Quadrat. eine alternative Methode besteht darin, schneiden Sie einen 2 &#8221; 2 &#8221; Platz mit einem lichtabsorbierenden Seite und einem Licht reflektierenden Seite (d. h. eine Seite von standard Alu-Folie); jedoch die Falte-Over-Methode ist sicherer, weil es eine stumpfe Kante bietet für den Umgang mit der Membran in die nächste Schritt.</li> <li>Falten Lab Klebeband oder Isolierband an den Rändern des Platzes, die Kanten nicht gefaltet zu binden. Dies hält die Seiten zusammen und schützt vor Schnittverletzungen durch scharfe Kanten.</li>
		<li>Ein Loch in der Mitte des Platzes mit einem 26 Gauge-Nadel durchstechen.</li>
		<li>Entfernen Sie die große Schraube Kappe aus der Ulbricht-Kugel und deckt die Öffnung mit der Membran. Platzieren Sie das Loch in der Mitte. Wenn die Membran mit einem Licht absorbierenden und einem Licht reflektierenden Seite erstellt wurde, legen Sie die lichtabsorbierende Seite oben und das Licht reflektierende Seite nach unten, mit Blick auf das Innere der Ulbricht-Kugel. 
		Hinweis: Zu verhindern, dass Staub und Schmutz in der Ulbricht-Kugel und das Loch zentriert zu halten, sichern die Membran nach außen von der Ulbricht-Kugel mit Lab Klebeband.</li>
	</ol></li> <li>Maßnahme hellen Ausgang entlang der Spitze in Schritten von 500 µm mit einem Mikromanipulator oder stereotaktischen Arm und einer Ulbricht-Kugel. 
	Hinweis: Schutzbrille der entsprechenden Wellenlänge sollte getragen werden, wenn der Laser eingeschaltet ist.
	<ol><li>Verbinden Sie entgegengesetzte Ende der Faser mit einem Laser oder Licht Quelle, sondern lösen keine Licht noch Ausgang.</li>
		<li>Sichern den Strahler an einer stereotaktischen Halter (BAUCRably mit Lab-Band) mit der Spitze 7-10 mm unterhalb der Unterseite des Halters.</li>
		<li>Schraube der stereotaktischen Halter in der stereotaktischen bestückt</li>
		<li>Richten Sie die Spitze des Erleuchters mit dem Loch in der Mitte der Membran. Der Mikromanipulator Null, wenn die Spitze auf dem exakt gleichen Niveau wie das Zwerchfell ist.</li>
		<li>Schalten Sie die Raumbeleuchtung ausschalten und Null die Ulbrichtkugel.</li>
		<li>Auslösen des Lasers (oder andere Lichtquelle) und Messen Sie die Ausgabe der Ulbricht-Kugel mit Licht Gesamtleistung. 
		Hinweis: Verwenden Sie die niedrigste Lichtausbeute möglich zu Testzwecken Kalibrierung.</li>
		<li>Senken die Faser 500 µm in der Integration von Kugel und wiederholen Sie Schritt 2.2.6.</li>
		<li>Weiter Absenken der Faser in der Ulbricht-Kugel und die Messung insgesamt Lichtleistung in Schritten von 500 µm bis die gesamte Lichtleistung Ebenen off 
		Vorsicht: Sobald die gesamte Spitze im Bereich ist, sollte insgesamt Lichtleistung einpendeln. Senken Sie die Faser nicht weiter mehr als 1-2 mm über der geätzten Tipp Länge. Wenn die Spitze die Unterseite der Ulbricht-Kugel berührt, es kann schmelzen und/oder ruinieren die Ulbrichtkugel.</li>
	</ol></li> <li>Bestätigen eine gleichmäßig geätzte Faser durch Plotten insgesamt leichte Leistung wie eine Funktion wie weit der Faser in der Ulbricht-Kugel ist, zur Bestätigung der Linearität gesenkt worden.</li></ol>
 3. in-Vivo-Beleuchtung
 Hinweis: hier werden diese Methoden mit ein Plastikmodell anstatt eines nicht-menschlichen Primaten gezeigt.
<ol><li>Implantat eine 25 mm Durchmesser Aufnahme Kammer über den Bereich des Gehirns von Interesse vor Experimenten implantiert wurde.</li>
	<li>Führen Sie anatomische Magnetresonanz-Bildgebung (MRI) vor dem experimentieren. Platzieren Sie eine benutzerdefinierte Aufnahme-Raster in der Kammer und füllen Sie ihn mit sterilen chirurgischen Schmiermittel für Raster-Visualisierung und Bestimmung des Niveaus der Dura und Ziel Hirnstrukturen ermöglichen.</li>
	<li>Bereiten ein Turm Mikro-Laufwerk vor einzelnen Testphasen.
	<ol><li>Affix klemmt eine 25 Gauge Führungsrohr mit abgeschrägten Spitze in der Mitte und unten auf dem Laufwerk. Zwei Klammern werden verwendet, um sicherzustellen, dass das Führungsrohr gerade bleibt. Beide diese Klemmen können manuell verschoben werden, falls gewünscht. 
		Hinweis: Das Führungsrohr kann geklebt oder gelötet an den Klemmen.</li>
		<li>Sichern den großvolumigen Strahler in die obere Klammer auf dem gleichen Laufwerk. Diese Klemme mit dem Antriebsmotor verbunden ist.</li>
		<li>Gewinde die großvolumigen Beleuchtung durch das Führungsrohr vollständig und bestätigen, dass die Spitze der Illuminator vorbei an die Spitze des Führungsrohres erstreckt sich. 
		Hinweis: Die Länge des Erleuchters, die Vergangenheit erstreckt sich die Spitze des Führungsrohres den Abstand zwischen der Dura am unteren Rand des Gehirns Zielregion, als entspricht bestimmt durch MRI.</li>
		<li>Antiseptischen Lösung (z. B. Chlorohexidine) zu sterilisieren das Führungsrohr und Illuminator einziehen.</li>
	</ol></li> <li>Legen Sie ein benutzerdefiniertes sterilisierte Raster innerhalb des sauberen Raumes und auf eine vorgegebene Ausrichtung mit einer Schraube an der Seite der Kammer befestigen. Das hier gezeigte Gitter hat 1 mm Abstand; jedoch kann der Abstand je nach Bedarf angepasst werden. 
	Hinweis: Dies sollte identisch mit dem Raster und Orientierung in der anatomischen MRT verwendet.</li>
	<li>Sichern die stereotaktische Mikro-Laufwerkshalterung auf der Aufnahme Kammer in einer vorher festgelegten Ausrichtung.</li>
	<li>Einfahren durch Ziehen der Illuminator mit sterilen, stumpfen Pinzette den sterilisierten Strahler aus dem Führungsrohr. Die Spitze der Beleuchtung sollte 5-10 mm über der Spitze des Führungsrohres. 
	Hinweis: Die Beleuchtung wird zwischen dem Führungsrohr und der Klemme nach außen beugen. Dies schädigt nicht die flexible Beleuchtung.</li>
	<li>Befestigen Sie das Mikro-Laufwerk an den Halter und das Führungsrohr in Ziel Raster Loch.</li>
	<li>Mikro-Antriebsstufe absenken, bis das Führungsrohr nur durch die Ebene der Dura ist. 
	Hinweis: Falls gewünscht, kann ein zweites Mikro-Laufwerk mit einer Elektrode auf der Bühne platziert und in ein anderes Netz Loch versenkt. Das lokale Feld auf diese Elektrode zeigt eine Distanz-abhängige leichte Artefakt, derer Illuminator Platzierung bestätigen.</li>
	<li>Versuchen der untere Beleuchtung manuell mit der sterilen Pinzette.
	<ol><li>Gibt es keinen Widerstand, Einfahren der Illuminator 5 - 10 mm, warten Sie 10 Minuten um das Gewebe zu begleichen und wiederholen den Vorgang zu ermöglichen.</li>
		<li>Wenn es noch Widerstand beim zweiten Versuch immer, einfahren die Illuminator Spitze in das Führungsrohr, untere der Guide Rohr 0,25 mm, und versuchen Sie es erneut.</li>
		<li>Wiederholen, bis die Beleuchtung Folien durch das Führungsrohr ohne Widerstand.</li>
		<li>Die Beleuchtung zu senken, bis es straff ist. 
		Vorsicht: Drücken Sie den Strahler mit Nachdruck gegen Widerstand nicht. In diesen Fällen hat das Führungsrohr in der Regel nicht die Dura vollständig durchdrungen. Die Faser mit Nachdruck drängen wird dazu führen, dass sich biegen verhindert die Faser vom Betreten des Gehirns und möglicherweise zerstören die Spitze ( Abbildung 1 g).</li>
	</ol></li> <li>Verbinden die Zwinge am anderen Ende von der Beleuchtung mit dem größeren Optik einrichten oder Laser.</li>
	<li>Stellen Sie sicher, dass kein Licht für die nicht-menschlichen Primaten sichtbar ist.
	<ol><li>Verwenden, Black-out-Abschirmung oder Licht absorbierenden Folie vollständig umfassen die Aufnahme Türme.</li>
		<li>Alle optischen Verbindungen in abgeschirmten Umschläge Licht absorbierenden Folie platzieren.</li>
		<li>Schild alle Patchkabel mit entweder Licht absorbierenden Folie oder schwarzes Isolierband.</li>
		<li>Als zusätzliche Vorsichtsmaßnahme, legen Sie eine Lockvogel Light Emitting Diode (LED) Bank der gleichen Farbe in das Experiment hinter der nichtmenschlichen Primaten verwendet und blinken die LEDs kontinuierlich bei 2,5 Hz. Dadurch wird verhindert, dass die Augen vollständig an die Dunkelheit anpassen. Gäbe es unbeabsichtigte Lichtverlust, dieses Blinklicht würde helfen, um zu verhindern, dass das Leck dienen als Verhaltensstörungen Trigger.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Herculano-Houzel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+brain+in+numbers%3A+a+linearly+scaled-up+primate+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Hum+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The human brain in numbers: a linearly scaled-up primate brain.</a> Front Hum Neurosci. 3, 31(2009).</li>
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<li>Cavanaugh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+inactivation+modifies+monkey+visuomotor+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Optogenetic inactivation modifies monkey visuomotor behavior.</a> Neuron. 76 (5), 901-907 (2012).</li>
</ol>

Während optogenetische Werkzeuge weit verbreitet sind, Krankheit und Physiologie bei Nagetieren zu studieren, hat die technische Herausforderung der leuchtenden großes Gehirn Volumen der Nutzung der Optogenetik bei nichtmenschlichen Primaten beschränkt. Bahnbrechende Studien an Affen große leichte Leistungsdichten (~ 100 mW/mm2 bis 20 W/mm2) verwendet, um kleine Mengen, vielleicht beleuchten &#60; 1 mm3und gemeldeten bescheidene Auswirkungen auf das Verhalten mit erregenden Opsins im Kort...

Optogenetische-Tools, die für eine Millisekunde-präzise, lichtgetriebenen neuronale Steuerung ermöglichen werden häufig verwendet, um funktionelle Physiologie und das Verhalten in Nagetieren und Wirbellosen zu studieren. Technische Herausforderungen haben jedoch die Verwendung der Optogenetik im Gehirn von Primaten, begrenzt, die ein Volumen ~ 100 x größer als das Nagetier Gehirn 1hat.
Zur Erleichterung der Optogenetik Studien in nicht-menschlichen Primaten ein Illuminator wurde entwickelt, um zwei konkurrierende Ziele: großvolumige Beleuchtung und minimale Penetration Schaden. Frühere Versuche, Adresse eines dieser Anliegen sind bei den teuren des anderen! Bündel von Fasern Leuchten größere Mengen aber mit größerem Durchmesser und damit Schaden2,3. Konische Glasfasern eindringen Schaden, sondern nur knapp Licht emittierende Flächen reduziert &#60; 100 µm2 4,5. Externe Gehirn Beleuchtung durch ein Fenster in die Dura umgeht die Herausforderung der Durchdringung Schaden und kann für großvolumige Beleuchtung ermöglichen, aber es kann nur für ein paar oberflächliche Gehirn Bereiche6verwendet werden.
Erstellen Sie eine großvolumige, kleine Durchmesser Strahler (Abbildung 1a), geätzt die Spitze eines Kunststoffs optische Faser ist Hitze verjüngt und Kern und Mantel sind (Abbildung 1 bC). Im Gegensatz zu anderen konischen Fasern, das Licht zu einem schmalen Punkt konzentrieren, ermöglicht die Radierung Licht gleichmäßig aus den Seiten der Spitze, also Verteilung von Licht im großen und ganzen über eine große Fläche (Abbildung 1 de) zu entkommen. Weil eindringen Schäden proportional zum Durchmesser Eindringen ist, diese Beleuchtung keine mehr eindringen Schaden als eine herkömmliche Faser hat, aber es hat &#62; 100 x die Licht emittierende Oberfläche und Licht im weiteren Sinne mit 1/100stel der Lichtleistung Dichte in einem Gehirn phantom (1,75 % Agarose) (Abbildung 1e). Eine Monte Carlo-Modell (Abb. 1f) veranschaulicht den Unterschied bei leichten Ausbreitung zwischen einer herkömmlichen Faser und der großvolumige Beleuchtung bei gleicher Lichtleistung dichten als ihr Licht emittierende Flächen haben. Jeder Strahler ist individuell kalibriert mit einer Ulbricht-Kugel (Abb. 2a, b), um gleichmäßige Lichtverteilung entlang der Spitze (Abbildung 2 c) zu gewährleisten.
Diese großvolumige Illuminator ist mit optogenetische Manipulation von Verhalten und neuronale feuern bei nichtmenschlichen Primaten validiert worden. Die Faserlänge Tipp kann jeder Bereich des Gehirns und jedes Tier individuelle rezeptiven Feld Karte angepasst werden. Die Beleuchtung kann mit einem durchdringenden Elektrode für neuronale Aufnahmen gekoppelt werden, die die Länge der Beleuchtung umfassen. Weiter, weil die Faser jede Farbe des sichtbaren Lichts tragen kann, kann es mit einer der verfügbaren optogenetische Moleküle zur Verfügung gekoppelt werden.

<table><tbody><tr><td>Kunststoff-Glasfaser</td><td>Industrielle Faseroptik</td><td>SK-10</td><td>250 Mikron Durchmesser, Super Eska Linie</td></tr><tr><td>Abisolierzange</td><td>Klein Tools</td><td>11047</td><td>22 Gauge</td></tr><tr><td>Schraubstockklemme</td><td>Wilton</td><td>11104</td><td>Generische Tischmontierbare Schraubstockklemme</td></tr><tr><td>Dual-Temperatur-Heißluftpistole</td><td>Milwaukee</td><td>8975-6</td><td>570 / 1.000 &deg; F</td></tr><tr><td>Lab Marker</td><td>VWR</td><td>52877</td><td></td></tr><tr><td>Präpariermikroskop</td><td>VistaVision</td><td>82027-156</td><td>Stereomikroskop mit doppeltem Glühlicht, 2x/4x Vergrößerung, erhältlich bei VWR</td></tr><tr><td>Lab tape</td><td>VWR</td><td>89097-972</td><td>4er Pack violette Farbe; die Farbe des Bandes spielt jedoch keine Rolle</td></tr><tr><td>Silikonkarbid-Läppblech</td><td>ThorLabs</td><td>LF5P</td><td>5 Mikron Körnung, 10er Pack</td></tr><tr><td>Aluminiumoxid-Läppblech</td><td>ThorLabs</td><td>LF3P</td><td>3 Mikron Körnung, 10er Pack</td></tr><tr><td>Aluminiumoxid-Läppblech</td><td>ThorLabs</td><td>LF1P</td><td>1 Mikron Körnung, 10er Pack</td></tr><tr><td>Kalziniertes Aluminiumoxid-Läppblech</td><td>ThorLabs</td><td>LF03P</td><td>0,3 Mikron Körnung, 10er Pack</td></tr><tr><td>Heißmesser</td><td>Industrielle Faseroptik</td><td>IF370012</td><td>60 Watt,</td>Hochleistungs-Faserprüfbereich</tr><tr><td></td><td>ThorLabs</td><td>FS201</td><td>optional</td></tr><tr><td>Edelstahl-Ferrule</td><td>Präzisionsfaseroptik</td><td>MM-FER2003SS-265</td><td>265 Mikron Innendurchmesser</td></tr><tr><td>1 mL Spritze</td><td>BD</td><td>14-823-30</td><td>Luer-Lok-Spitze ist vorzuziehen, um das Risiko von Leckagen zu verringern, ist aber nicht unbedingt erforderlich</td></tr><tr><td>Kunststoff-Epoxidharz</td><td>Industrielle Faseroptik</td><td>40 0005</td><td></td></tr><tr><td>18 Gauge stumpfe Nadel</td><td>BD</td><td>305180</td><td>1,5 Zoll</td></tr><tr><td>Länge Fusselfreies Tuch (KimWipe)</td><td>ThorLabs</td><td>KW32</td><td>von vielen Anbietern erhältlich</td></tr><tr><td>Lichtabsorbierende Folie</td><td>ThorLabs</td><td>BKF12</td><td></td></tr><tr><td>Isolierband</td><td>3M</td><td>Temflex 1700</td><td>Optional, kann andere Marken / Modelle ersetzen</td></tr><tr><td>26 Gauge scharfe Nadel&nbsp;</td><td>BD</td><td>305111</td><td>0,5 Zoll Länge</td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Siskiyou</td><td>70750000E</td><td>kann andere Marken/Modelle ersetzen</td></tr><tr><td>Steretaktischer Arm</td><td>Kopf</td><td>1460</td><td>kann andere Marken/Modelle ersetzen</td></tr><tr><td>Laserschutzbrille</td><td>KenTeK</td><td>KCM-6012</td><td>muss basierend auf der Farbe des verwendeten Lasers ausgewählt werden, Beispiel hier</td></tr><tr><td>angegeben Laser oder andere Lichtquelle</td><td>Vortran</td><td>Stradus 473-50</td><td>Beispiel für blauen Laser</td></tr><tr><td>Ulbrichtsche Kugel</td><td>ThorLabs</td><td>S142C</td><td>Angebauter Leistungsmesser, auch bei ThorLabs erhältlich, Artikel #PM100D</td></tr><tr><td>Ultem Aufnahmekammer</td><td>Crist Instrument Firma</td><td>6-ICO-J0</td><td>Kundenspezifisch mit Ausrichtungskerbe</td></tr><tr><td>Turmmikroantrieb mit Klemmen</td><td>NAN</td><td>DRTBL-CMS</td><td></td></tr><tr><td>Führungsrohr</td><td>Custom</td><td>N/A</td><td>Hergestellt aus 25 Gauge Spinal Needle (BD) oder stumpfen Schläuchen</td></tr><tr><td>NAN</td><td></td><td>NANDrive</td><td></td></tr><tr><td>Kundenspezifisches Gitterdesign</td><td>kundenspezifische</td><td></td><td>Pläne auf Anfrage erhältlich</td></tr><tr><td>Stumpfe Pinzette</td><td>FischerScientific</td><td>08-875-8A</td><td>generische stumpfe Pinzette aus Edelstahl</td></tr><tr><td>Digitale Messschieber</td><td>Neiko</td><td>01407A</td><td>Verfügbar auf amazon.com. Kann einen Messschieber mit feinerer Auflösung für genauere Messungen auswählen.</td></tr><tr><td>Patchkabel</td><td>ThorLabs</td><td>FG200LCC-custom</td><td>Dies ist ein Beispiel für viele mögliche Patchkabel. Solange der Faserdurchmesser kleiner oder gleich dem Faserdurchmesser der großvolumigen Beleuchtung ist und solange die Steckverbinder miteinander verbunden sind, ist jedes Patchkabel (Glas oder Kunststoff, vom Anbieter gekauft oder im Labor hergestellt) für diese Anwendung in Ordnung.</td></tr><tr><td>Klare Staubschutzkappen</td><td>aus Kunststoff ThorLabs</td><td>CAPF</td><td>Packung mit 25</td></tr> geteilten <tr><td>Keramik-Gegenhülsen</td><td>Precision Fiber Products, Inc.</td><td>SM-CS1140S</td><td></td></tr></tbody></table>

großes volumen, verhaltensorientierte relevanten beleuchtung für optogenetik bei nichtmenschlichen primaten

Large Volume, Behaviorally-relevant Illumination for Optogenetics in Non-human Primates

Dieses Protokoll beschreibt eine großvolumige Illuminator, die für optogenetische Manipulationen im Gehirn von Primaten entwickelt wurde. Der Illuminator ist eine modifizierte Kunststoff-Lichtwellenleiter mit geätzten Spitze so, dass die lichtemittierenden Fläche &#62; 100 x, die einer herkömmlichen Faser. Neben der Beschreibung des Bau der großvolumigen Illuminator, beschreibt dieses Protokoll die Qualitätskontrolle Kalibrierung verwendet, um gleichmäßige Lichtverteilung zu gewährleisten. Dieses Protokoll beschreibt weiter, Techniken für das einsetzen und Herausnehmen der großvolumigen Illuminator. Oberflächliche und tiefe Strukturen können beleuchtet werden. Diese großvolumigen Beleuchtung muss nicht physisch an einer Elektrode gekoppelt werden und weil die Beleuchtung aus Kunststoff, nicht Glas besteht, es einfach beugt sich unter Umständen beim traditionellen Lichtleitfasern zerbrechen würde. Weil dieser Strahler Licht über verhaltensorientierte relevanten Gewebe Volumen (≈ 10 mm3) ohne größere Marktdurchdringung Schaden als eine herkömmliche optische Faser liefert, erleichtert es Verhaltensstudien mit Optogenetik bei nichtmenschlichen Primaten.

Die Beleuchtung des großen Gehirn Volumen bei nichtmenschlichen Primaten ermöglicht die verhaltensrelevanten relevanten optogenetische Manipulation. Acker Et al. (2016) verwendet diese großvolumigen Strahler mit der rot-verschoben Halorhodopsin, Jaws 7 , den zeitlichen Beitrag des Feldes frontalen Auge (FEF), Speicher-geführte Sakkaden in zwei Rhesus-Affen zu studieren. Insbesondere wurden FEF Neuronen mit viralen Vektoren mit Jaws injiziert und dann beleuchtet mit Rotlicht mit den großvo...

Ein Protokoll, ein Gewebe eindringende Hilfslicht für die Bereitstellung von Licht über große Mengen mit minimalem Durchmesser bauen wird vorgestellt.

Großes Volumen, verhaltensorientierte relevanten Beleuchtung für Optogenetik bei nichtmenschlichen Primaten

This protocol describes a large-volume illuminator, which was developed for optogenetic manipulations in the non-human primate brain. The illuminator is a ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, einen großvolumigen Gewebeilluminator zu entwickeln, der sich gut für optogenetische Manipulationen bei nicht-menschlichen Primaten eignet. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Neurowissenschaften zu beantworten, z. B. wie die Populationen von Neuronen in den verschiedenen Hirnregionen zum Verhalten beitragen und wie sich zeitlich spezifische neuronale Feuermuster in einer Region auf eine andere Region auswirken können. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie Licht verwendet und somit die optogenetische Manipulation großer verhaltensrelevanter Gehirnvolumina mit minimaler Gewebeschädigung ermöglicht.Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich aufgrund der Ähnlichkeiten zwischen dem menschlichen und dem nicht-menschlichen Primatengehirn auf die translationale Medizin. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da es etwas Übung erfordert, beim Ziehen dieser Fasern den richtigen Druck auszuüben. Um diesen Vorgang zu starten, verwenden Sie eine scharfe Schere, um einen Abschnitt aus Kunststoff-Glasfaser mit einem Durchmesser von 250 Mi

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Research

Forschung

JoVE Journal

Behavior

Verhalten

Adult-geboren Neuronen des Bulbus kann optogenetically gesteuert werden mit Channelrhodopsin2-exprimierenden lentiviralen Injektion in den rostralen wandernde Bach und chronischen Photostimulation mit einem implantierten Mini-LED.

Selektive Viral Transduktion von Adult-geboren olfaktorischen Neuronen für chronische In vivo Optogenetische Stimulation

Die jüngste Entwicklung der Neurowissenschaften Tools, die Genetik und Optik zu kombinieren, die als "Optogenetik", ermöglicht die Kontrolle über die neuronalen Schaltkreis-Aktivität mit einem beispiellosen Maß an räumlicher und zeitlicher Auflösung. Hier bieten wir ein Protokoll für die Integration von In-vivo-Aufnahme mit optogenetischen Manipulation von genetisch definierte Untergruppen von präfrontalen kortikalen und subicular Pyramidenzellen.

Eine Methode zur High Fidelity optogenetische Kontrolle der Einzelpyramidenzellen<em&gt; In-vivo-</em

Optogenetik ist zu einem mächtigen Werkzeug für den Einsatz in verhaltensneurowissenschaftlichen Experimenten geworden. Dieses Protokoll bietet eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für das Design und die Einrichtung von Lasersystemen und bietet ein vollständiges Protokoll für die Durchführung mehrerer und gleichzeitiger optogenetischer In-vivo-Stimulationen, die mit den meisten Verhaltenstestparadigmen von Nagetieren kompatibel sind.

In vivo optogenetische Stimulation des Nager Central Nervous System

Hier beschreiben wir unsere Strategie, um stabile, gut isolierte Einzelaufnahmen von identifizierten inhibitorischen Interneuronen in der anästhesierten Mausrinde zu erhalten. Neuronen, die ChR2 exprimieren, werden durch ihre Reaktion auf blaues Licht identifiziert. Die Methode verwendet standardmäßige extrazelluläre Aufzeichnungsgeräte und dient als kostengünstige Alternative zur Kalziumbildgebung oder visuell gesteuerten Pflasterung.

Ein Leitfaden zur In vivo Single-Unit-Aufnahme von Optogenetically Identifizierte kortikalen inhibitorischen Inter

Dieses Protokoll beschreibt die Schritte und Datenanalysen, die für eine erfolgreiche Durchführung der optogenetischen funktionellen Magnetresonanztomographie (ofMRT) erforderlich sind. ofMRT ist eine neuartige Technik, die die Hochfeld-fMRT-Auslesung mit optogenetischer Stimulation kombiniert und so eine zelltypspezifische Kartierung funktioneller neuronaler Schaltkreise und ihrer Dynamik im gesamten lebenden Gehirn ermöglicht.

Optogenetische Functional MRI

Hier zeigen wir Magnetresonanz (MR)-geführte Konvektions-verstärkte Abgabe (CED) von viralen Vektoren in den Kortex als effizienten und vereinfachten Ansatz zur Erzielung optogenetischer Expression über große kortikale Bereiche im Makakenhirn hinweg.

Konvektion Verbesserte Lieferung von optogenetischen Adeno-assoziierten Viral vektor an den Cortex von Rhesus Macaque unter Anleitung von Online-MRT-Bildern

Mit optogenetischer Manipulation bestimmter neuronaler Populationen oder Hirnregionen kann das Verhalten bei frei beweglichen Tieren mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung verändert werden. Durch den Einsatz verschiedener optogenetischer Werkzeuge in Kombination mit chronisch implantierten optischen Fasern kann eine Vielzahl neuronaler Modulationen und Verhaltenstests durchgeführt werden.

Optogenetische Manipulation der neuronalen Aktivität, um das Verhalten bei frei beweglichen Mäusen zu modulieren

Die nachstehende Methode zielt darauf ab, ein umfassendes Protokoll für die Herstellung der nichtmenschlichen Primaten-Neurochirurgie (NHP) mit einer neuartigen Kombination aus dreidimensionalen (3D) Druckverfahren und MRT-Datenextraktion bereitzustellen.

Eine MRT-basierte Toolbox für neurochirurgische Planung bei nichtmenschlichen Primaten

Wie derzeit implementiert, erfordert die Optogenetik bei nichtmenschlichen Primaten die Injektion viraler Vektoren in das Gehirn. Eine optimale Injektionsmethode sollte zuverlässig sein und für viele Anwendungen in der Lage sein, einzelne Stellen beliebiger Tiefe anzuvisieren, die in der postmortalen Histologie leicht und eindeutig identifiziert werden können. Ein Injektionsverfahren mit diesen Eigenschaften wird vorgestellt.

Injektionen von AAV-Vektoren für die Optogenetik in anästhesiertem und wach verhaltendem nicht-menschlichem Primatengehirn

Biolumineszenz-Licht, das von einem Luciferase-Enzym emittiert wird, das ein niedermolekulares Substrat, ein Luciferin, oxidiert, kann genutzt werden, um photosensorische Proteine zu aktivieren, wodurch der Lichtstimulation eine weitere Dimension hinzugefügt und die Manipulation einer Vielzahl von lichtvermittelten Funktionen in Zellen über zeitliche und räumliche Skalen hinweg ermöglicht wird.

Biolumineszente Optogenetik 2.0: Nutzung der Biolumineszenz zur Aktivierung photosensorischer Proteine in vitro und in vivo

In diesem Artikel werden automatisierte Prozesse für die neurochirurgische Planung von nichtmenschlichen Primaten auf der Grundlage von Magnetresonanztomographie (MRT)-Scans beschrieben. Diese Techniken verwenden Verfahrensschritte in Programmier- und Designplattformen, um ein maßgeschneidertes Implantatdesign für NHPs zu unterstützen. Die Gültigkeit jeder Komponente kann dann anhand von dreidimensionalen (3D) gedruckten lebensgroßen anatomischen Modellen bestätigt werden.

Eine Toolbox für das Design neuronaler Implantate für nichtmenschliche Primaten

Lernen Sie die Herstellung eines großvolumigen Gewebe-Illuminators für Optogenetik bei nichtmenschlichen Primaten. Diese Methode ermöglicht präzise Lichtstimulation mit minimalem Gewebeschaden für neurowissenschaftliche Verhaltensstudien.

Großes Volumen, verhaltensorientierte relevanten Beleuchtung für Optogenetik bei nichtmenschlichen Primaten

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