Praktische Überlegungen an einem Studium von metastasierendem Lungenkrebs Besiedlung in Osteosarkom mit pulmonalen Metastasen-Assay

Das übergeordnete Ziel dieses Lungenmetastasen-Assays ist es, das Wachstum von metastasierten Osteosarkomzellen in lebensfähigem Lungengewebe direkt sichtbar zu machen und zu untersuchen. Diese Methode kann helfen, wirklich wichtige Fragen auf dem Gebiet der Osteosarkom-Metastasierung zu beantworten. Zum Beispiel, wie sich metastasierende Osteosarkomzellen in der Mikroumgebung der Lunge anpassen, überleben und vermehren.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine direkte Visualisierung des metastasierten Osteosarkom-Zellwachstums in einer relevanten dreidimensionalen Mikroumgebung ermöglicht. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, aufgrund der technisch anspruchsvollen Schritte der Kanülierung der Luftröhre und der Insufflation der Lunge Schwierigkeiten haben. Die Schwanzveneninjektion von Tumorzellen und die Euthanasie von Mäusen erfolgen nach den üblichen institutionellen Richtlinien.

Legen Sie die euthanasierte Maus nach fünf Minuten in Rückenlage auf ein steriles Pad in einer Laminar-Flow-Haube und verwenden Sie eine kleine, sterile Schere, um das Brustbein vorsichtig hinter dem thorakalen Einlass auf beiden Seiten der Luftröhre zu präparieren, ohne die Lunge zu punktieren. Das Präparieren des gesamten Muskel- und Bindegewebes, das die Luftröhre umgibt, ist für eine erfolgreiche Kanülierung unerlässlich. Verwenden Sie als Nächstes einen 20-Gauge-IV-Katheter, um die Luftröhre vorsichtig zu kanülieren, und verwenden Sie eine sterile Catgut-Naht, um den Katheter und die Luftröhre locker zu sichern.

Befestigen Sie ein IV-Verlängerungsset aus dem Katheter an der 10-Milliliter-Spritze eines Schwerkraft-Profusionsgeräts und gießen Sie 37 Grad Celsius flüssige Agarose, gemischt mit einer mittleren Lösung, in die Spritze. Füllen Sie die Lungen mit der Agaroselösung, bis sie vollständig insuffliert sind. Entfernen Sie dann die Kanüle und binden Sie die Naht fest ab, um ein Auslaufen der Agaroselösung zu verhindern.

Es ist wichtig, die Lunge während der Insufflation intakt zu halten. Eine ordentliche Insufflation mit Agarose und anschließendes Abkühlen des Zupfens hält die Lunge in einem erweiterten Zustand. Entnehmen Sie den Zupfen, die Luftröhre, das Herz und die Lunge und achten Sie darauf, die Lungenoberfläche nicht zu durchstechen oder zu beschädigen.

Legen Sie das Gewebe in 30 Milliliter vorgekühltes PBS, das mit Antibiotika ergänzt wird, und lassen Sie die Agarose sich verfestigen. Den Zupfer 20 Minuten auf Eis legen. Schneiden Sie die Lunge nach 20 Minuten mit einer feinen Schere und einer Pinzette in 3 x 1,5 Millimeter große Stücke und legen Sie die Scheiben in einzelne Vertiefungen einer 6-Well-Platte mit 2 x 2 Zentimeter großen Gelatineschwämmen, die in B-Medium vorgetränkt sind.

Am Tag der Bildgebung werden die Lungenscheiben vorsichtig von der 6-Well-Platte in eine sterile runde 35-Millimeter-Schale mit Glasboden in Säulen entsprechend der Versuchsgruppe überführt. Wählen Sie anschließend an einem Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop das 2,5-fache Objektiv aus und stellen Sie die Bildgebungsparameter so ein, dass der beste Kontrast zwischen den fluoreszierenden Tumorzellen und dem nicht fluoreszierenden Hintergrundgewebe in der Kontrollgewebe-Probengruppe erzielt wird. Stellen Sie alle Proben mit den gleichen Parametern wie für das Kontrollgewebe dar.

Wenn die Software nicht waagenkalibriert ist, bilden Sie ein Mikrometer mit demselben Objektiv wie das Lungengewebe ab, um eine Skalenreferenz zu erhalten, und speichern Sie alle Bilder als TIF-Dateien. Wenn alle Bilder abgerufen wurden, öffnen Sie die erste Datei, um die Bilder in ImageJ zu analysieren. Verwenden Sie das Polygonauswahlwerkzeug, um den gesamten Lungenschnitt zu umreißen und den Bereich des gesamten Lungenschnitts zu bestimmen.

Wählen Sie Prozess und subtrahieren Sie den Hintergrund. Legen Sie den Radius der rollenden Kugel auf einen Startwert von 50 Pixel fest. Dieser Wert hängt vom Grad der Hintergrundfluoreszenz ab und sollte für jeden Datensatz optimiert werden.

Stellen Sie sicher, dass Sie den hellen Hintergrund deaktivieren. Wählen Sie Bild und Typ aus, 8-Bit, dann Bild und Eigenschaften, geben Sie Pixel ein. Geben Sie unter Längeneinheit den Wert 1 für die Pixelbreite, die Pixelhöhe und die Voxeltiefe ein.

Aktivieren Sie dann global, um diese Parameter auf alle nachfolgenden Bilder anzuwenden. Wählen Sie als Nächstes Bild aus, dann Anpassen und dann Schwellenwert. Markieren Sie Standard und Schwarzweiß und verwenden Sie den Schieberegler, um den Schwellenwert für das Bild so zu verwenden, dass die Mehrheit der Tumorzellen genau hervorgehoben wird.

Klicken Sie einmal auf Anwenden, um die Lunge schwarz und die fluoreszierenden Läsionen weiß zu färben. Klicken Sie dann ein zweites Mal auf Anwenden, um das Bild so umzukehren, dass alle fluoreszierenden Strukturen schwarz werden. Um die Anzahl und Form der Läsionen zu quantifizieren, wählen Sie "Messungen analysieren und festlegen" und "Bereich überprüfen".

Deaktivieren Sie alle anderen Kontrollkästchen. Wählen Sie dann Partikel analysieren und verwenden Sie im Größenfeld den Bereich der kleinsten Läsion, der von ImageJ als einzelne Zelle bestimmt wurde, um den Bereich der Formen festzulegen, den das Programm aufzählt. Verwenden Sie ein Bild aus der Fahrzeuggruppe am Tag Null, um den kleinsten Bereich auszuwählen, der als einzelne Tumorzelle betrachtet wird.

Wenn Sie die untere Grenze festgelegt haben, klicken Sie auf OK. Es öffnet sich ein Ergebnisfenster, in dem alle aufgezählten Formen und Flächenmaße aufgeführt sind. Kopieren Sie dann die Daten aus dem Ergebnisfenster, fügen Sie sie in eine Tabelle ein und verwenden Sie die mathematische Summenfunktion, um alle Bereiche der metastasierten Läsionen für diesen bestimmten Lungenschnitt hinzuzufügen.

Die metastasierende Neigung zu hohen und niedrigen metastasierten Zelllinien ist über progressive Zeitpunkte visuell sichtbar. Genauer gesagt zeigen diese Mikroskopiebilder, dass hochmetastasierte Zellen in der Lage sind, die Lunge effizienter zu besiedeln als niedrig metastasierte Zelllinien. Die Bildanalyse, Quantifizierung und statistische Analyse der Bilddaten bestätigt, dass hochmetastasierende Tumorzellen das Lungengewebe effizient besiedeln können.

Während niedrig metastasierende Zellen überhaupt nicht wachsen können. Die konfokale Fluoreszenzmikroskopie mit hoher Vergrößerung ermöglicht die Visualisierung der Lungenparenchymzellen in großer räumlicher Detailgenauigkeit im Vergleich zu EGFP-exprimierenden Tumorzellen. Außerdem erleichtert sie die Analyse subzellulärer Strukturen, wie z. B. dieser Mitochondrien.

Abhängig von der Anzahl der verwendeten Mäuse kann diese Technik in vier Stunden abgeschlossen werden, wenn sie richtig durchgeführt wird. Bei diesem Eingriff ist es wichtig, daran zu denken, mit sauberen, sterilen chirurgischen Geräten zu arbeiten. Nach ihrer Entwicklung ebnete die Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Krebsforschung, um das Fortschreiten der Metastasierung in der Lunge von Mäusen zu erforschen.

Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie in vitro Zellkultur-Assays und Western Blotting durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu den Auswirkungen von Gen-Knockdown oder medikamentöser Behandlung auf Krebszellen zu beantworten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie einen Lungenmetastasen-Assay durchführen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit menschlichen Krebszellen äußerst gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Eingriffs immer Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten, wie z. B. die Arbeit in einem Labor für Bio-Level-Sicherheit.