Name: Praktische Überlegungen an einem Studium von metastasierendem Lungenkrebs Besiedlung in Osteosarkom mit pulmonalen Metastasen-Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Erfahren Sie den Pulmonalen-Metastasen-Assay zur Visualisierung metastasierender Osteosarkomzellen im Lungengewebe. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Zellwachstum und Überlebensmechanismen in einer dreidimensionalen Mikroumgebung.

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Wir möchten danken Dr. Arnulfo Mendoza in der PuMA-Technik geschult. Darüber hinaus möchten wir DRS. Chand Khanna, Susan Garfield (NCI/NIH) und Sam Aparicio (BC Cancer Agency) für die Nutzung von ihren Mikroskopen im Laufe dieser Studie anerkennen. Diese Forschung wurde von Intramural Research Program des National Institutes of Health, Center for Cancer Research, Pädiatrische Onkologie-Zweig (teilweise) unterstützt. M.M.L. vom nationalen Instituten der Gesundheit intramuralen Besuch Fellow Programm (Award 15335) unterstützt wurde und wird derzeit von einem Joan-Parker-Stipendium in Metastasen Forschung unterstützt. P.H.S. wird von der British Columbia Cancer Foundation unterstützt.

Alle tierischen Protokolle aus denen Bilddaten stammen wurden mit Genehmigung der Animal Care und Use Committee des National Cancer Institute, National Institutes of Health durchgeführt. Alle tierischen Protokolle diskutiert und dargestellt in dem Artikel video wurden von der University of British Columbia Animal Care Ausschuss genehmigt.
1. Vorbereitung der Tumorzellen für Einspritzung und Materialien für das PuMA-Modell
Hinweis: Die Menge der Lösungen und Zellen werden genug für 1 Maus. Skalieren Sie nach Bedarf, wenn mehr Mäuse in der Studie verwendet werden. Medien-Rezepte finden Sie in Tabelle 1 und Tabelle 2.
<ol><li>Wärmen Sie 5 mL A-Media in einem 15 mL konische Rohr in ein Wasserbad 37 oC vor.</li>
	<li>Die 1,2 % niedrig schmelzende Agarose Lösung (in sterilem Wasser) unter Verwendung der Lab-Mikrowelle zu schmelzen.</li>
	<li>5 mL flüssige Agarose in ein 15 mL konische Röhrchen zu übertragen, und in einem 37 oC Wasserbad warm halten. Sicherstellen Sie, dass die geschmolzene Agarose 37 oC und Flüssigkeit vor der Lunge Insufflation Schritt ist.</li>
	<li>Pre-chill 30 mL der Zellkultur Klasse PBS mit 1 X Pen/Strep in einem Eiskübel ergänzt.</li>
	<li>Pre-Einweichen Sie in einen Brunnen von einem 6-Well-Platte einen Gelatine-Schwamm in 1,5 mL B-Medien. Der Schwamm wird der Support für Anker für die Lunge-Scheiben sein.</li>
	<li>Sicherzustellen, dass die OS-Zellen sind etwa 70-90 % konfluierende am Tag des Verfahrens. Verwenden Sie keine Zellen, die übermäßige Zusammenfluss oder wenn das Medium Orange ist bis gelb, da die Zellen in der Regel betont sind und haben zu diesem Zeitpunkt Lebensfähigkeit vermindert. Für das Osteosarkom-Zell-Linien, MNNG und HOS, wird 5 x 105 in einem Volumen von 100 μl zu injizieren in die Vene Tail 1 Maus verwendet werden. Gehobene entsprechend, wenn mehr Mäuse für die Studie verwendet werden.</li>
	<li>Ernten Sie die Tumorzellen mit 0,25 % Trypsin-EDTA (3 mL für ein T75-Fläschchen oder 2 mL in einer Kulturschale 10 cm). Wenn Zellen beginnen die Platte abheben, neutralisieren Sie die Trypsin-EDTA mit kompletten Medien. Spin-down Zellen und einmal mit Zellkultur Grade PBS abspülen. Aufschwemmen Sie Pellet in 5 mL PBS.</li>
	<li>Führen Sie eine Zellzahl von Standardmethoden. Es ist am besten, um mehr Zellsuspension als was tatsächlich benötigt wird, da Verlust der Zellsuspension oft während der Nadel erarbeiten tritt und Injektion Versuche scheiterten.</li>
	<li>Führen Sie einen Trypan blau-Ausschluss-Assay auf einer Stichprobe von der Zellsuspension auf die Lebensfähigkeit der Zellen zu beurteilen. Gehen Sie nur dann, wenn die Zelle 90 % Rentabilität zeigen oder höher.</li>
	<li>5 x 105 Zellen in einem Volumen von 100 μl zu injizieren. Um ein Übermaß an 2 X dieses Betrags vorzubereiten, sollte 1 x 106 Zellen nach unten gedreht und Nukleinsäuretablette in 0,2 mL HBSS.</li>
	<li>Stelle die Zellsuspension in einem Eiskübel während du die Mäuse für die Injektion.</li>
</ol>(2) tail Vene Einspritzen und Lunge Insufflation
Hinweis: Die Menge der Lösungen und Zellen in diesem Abschnitt werden genug für 1 Maus. Skalieren Sie nach Bedarf, wenn mehr Mäuse in der Studie verwendet werden. Eine Liste von Geräten, Materialien und chirurgische Instrumente verwendet, die in den folgenden Schritten finden Sie in Tabelle 3 und Tabelle 4.
<ol><li>Wärmen Sie eine weibliche Maus (Alter 6-8 Wochen) unter eine Wärmelampe für 5 min um ihre Rute Vene deutlicher ersichtlich zu machen. Verwenden Sie für murine K7M2 oder K12 Zellen Balb/c Mäuse. Verwenden Sie für menschliche MG63.3, MG63, MNNG und HOS Zellen Severe Combined Immunodeficiency Mäuse.</li>
	<li>Sicherstellen Sie, dass die Zellsuspension einheitlich ist, durch das Rohr vorsichtig schütteln. Erarbeiten Sie sorgfältig die Zellsuspension in 1 mL Spritze ohne Nadel. Kappe der Spritze mit einer 27 gauge Nadel. Stellen Sie sicher, dass die Nadel Abschrägung auf der gleichen Seite wie die Volumen-Markierungen auf der Nadel ist.</li>
	<li>Platzieren Sie den Mauszeiger in die Restrainer, und wischen Sie die Rute mit einem Alkohol abwischen.</li>
	<li>Gehen Sie zum Durchführen einer Rute Vene Injektion und injizieren die 100 μL der Zellsuspension. 5 min nach der Injektion, platzieren Sie den Mauszeiger in einer CO-2 -Kammer und der Euthanasie Standardarbeitsanweisung (als Umriss Ihres institutionellen Tierpflege-Ausschusses) beginnen. Zervikale Dislokation sollte nicht als Mittel zur Sterbehilfe verwendet werden, da das Verfahren die Luftröhre beschädigt wird.</li>
	<li>Sobald die Maus eingeschläfert ist, beginnen Sie die Vorbereitung der Laminar-Flow-Haube für Insufflation der Maus-Lunge mit der Agarose/A-Media-Lösung. Innerhalb der Laminar-Flow-Haube einen Arbeitsbereich mit Ihrem sterilen Pad eingerichtet. Auf diese Unterlage platzieren Sie Ihre sterilisierte Instrumente, IV Katheter IV Erweiterungssatz und Schwerkraft Perfusion Apparat (siehe ergänzende Abbildung1).</li>
	<li>Platzieren Sie den Mauszeiger im dorsalen Recumbancy. Sezieren Sie mit sterilen kleine Schere sorgfältig aus dem Brustbein, die Brusthöhle verfügbar zu machen. Achten Sie darauf, nicht die Lunge punktieren, da eine Agarose/A-Media-Lösung verwendet wird, um die Lunge zu insufflieren.</li>
	<li>Wenn aus dem Brustbein zu sezieren, zerlegen Sie vorbei an den thorakalen Einlass auf beiden Seiten der Luftröhre. Setzen Sie die Luftröhre durch sezieren entfernt das umliegende Weichgewebe.</li>
	<li>Cannulate der Luftröhre mit einem 20 Gauge-IV-Katheter. Verknoten Sie locker chirurgische Verwendung steril Darmsaite Naht um die kanülierte Luftröhre.</li>
	<li>Legen Sie ein IV Erweiterungssatz von katheterisiert Luftröhre zu 10 mL Spritze der Schwerkraft Perfusion Vorrichtung.</li>
	<li>Kombinieren Sie die vorgewärmte 37 oC Agarose (5 mL) und A-Media (5 mL) in ein 1:1-Gemisch. Gießen Sie die flüssige Agarose/A-Media-Lösung in 10 mL Spritze von der Schwerkraft Perfusion Gerät. Sicherzustellen Sie vor Insufflation der Lungen mit Agarose/A-Media-Lösung, dass die gesamte Länge der Erweiterungssatz mit Agarose/A-Media, damit unbeabsichtigte Insufflation von Proben der Lunge mit Luft zu negieren grundiert worden ist.</li>
	<li>Füllen Sie die Lunge die Agarose/A-Media-Lösung, bis die Lunge voll insuffliert wird.</li>
	<li>Sobald die Lunge voll insuffliert, entfernen der Kanüle und fest binden Sie den chirurgischen Knoten Auslaufen der Agarase/A-Media-Lösung durch die Luftröhre zu verhindern.</li>
	<li>Fahren Sie mit der zupfen (Luftröhre, Herz und Lunge) aus der Brusthöhle zu sezieren. Achten Sie darauf, keine Punktion oder die Oberfläche der Lunge schädigen.</li>
	<li>Ort der zupfen (in keine bestimmte Ausrichtung) in die vorgekühlt 30 mL PBS mit 1 X Pen/Strep ergänzt und ermöglichen die Agarose/A-Media für 20 min zu festigen.</li>
	<li>Verwendung von feinen Scheren und Pinzetten, Schneide kleine Stücke der Lunge (3 x 1,5 mm), wie in Figur 1Agezeigt. Kleinere Lunge Scheiben können leicht mit einem 2,5 X Objektiv abgebildet werden. Mehrere Scheiben ist in der Regel 4 bis 10 Scheiben pro Gruppe pro Versuchsbedingung, kürzbar. Hinweis: Für jede Versuchsgruppe, legen Sie die Lunge Scheiben in einen separaten Brunnen (6-Well-Platte) mit einem 2 x 2 cm Gelatine Schwamm eingeweicht in B-Medien. Die Anzahl der Medien pro Bohrloch sollte 1,5 mL betragen. Wechseln Sie das Medium alle 2-3 Tage. Für Medikamentenstudien ist die Häufigkeit der Wechsel der Medien/Droge Benutzer bestimmt.</li>
</ol>(3) Weitfeld-Fluoreszenz-Bildgebung Lung Slices und Analyse
Hinweis: Für Weitfeld Fluoreszenz sind bildgebende, kleinere Scheiben (3 x 1,5 x 1 mm) geschnitten um die Lunge Abschnitt in 1 Bild mit einem 2,5 X Objektiv passen.
Bildaufnahme auf dem Weitfeld-Fluoreszenz-Mikroskop:
<ol><li>Lunge-Scheiben werden in der Regel bei 0, 3, 7 und 14 Tage nach der Injektion abgebildet. In der sterilen Umgebung des biologischen Kabinetts sorgfältig übertragen die Lunge Scheiben aus der Gelatine Runde Schwämme zu einem sterilen 35 mm Glasboden Schale. Achten Sie darauf, aus die überschüssige Flüssigkeit aus der Lunge Slice Tupfen, da die überschüssige Flüssigkeit als ein Spiegel fungiert und fluoreszierendes Licht aus der Tumorzellen zu reflektieren.</li>
	<li>Ordnen Sie die Lunge Scheiben in ähnlicher Weise dargestellt in Abbildung 1A. Jede Spalte würde eine andere experimentelle Erkrankung darstellen. Achten Sie darauf, nicht Kreuz-die Lungen mit der Pinzette verunreinigen. Mit 70 % Ethanol spülen und trocknen vor dem Umgang mit Lunge Scheiben aus einer anderen experimentellen Gruppe.</li>
	<li>Optimieren der bildgebenden Parameter (dh. Gain, Offset, Belichtung Zeit, binning), bietet den besten Kontrast zwischen der fluoreszierenden Tumorzellen und Hintergrund Lungengewebe im Steuerelement (Fahrzeug unbehandelt) Gruppe. Verwenden Sie die gleichen Parameter aus der Kontrollgruppe zu die experimentellen Gruppen Bild. Speichern Sie als TIFF-Bildformat.</li>
	<li>Zu Referenzzwecken eine Skala nehmen Sie ein digitales Foto von einem Mikrometer auf das gleiche Ziel.</li>
	<li>Da Lunge Auto-Fluoreszenz im Laufe der Zeit ändert, müssen die bildgebenden Parameter jeder bildgebenden Sitzung zu den Lungen Kontrolle angepasst werden. Die bildgebende Parameter für eine Sitzung unbedingt nicht optimal für nachfolgende bildgebende Sitzungen.</li>
</ol>Bildanalyse: Hinweis: Die folgenden Bild-Bearbeitungsschritte erfolgen mit ImageJ 1,51 h Software Paket 17.
<ol><li>Öffnen Sie eine Bilddatei in ImageJ (Abb. 3A).</li>
	<li>Subtrahieren Sie Hintergrund: Prozess > subtrahieren Hintergrund > Rolling Ball Radius (Start mit 50 Pixel), deaktivieren Sie die Option "Licht Hintergrund" (Abb. 3 b).</li>
	<li>Bild 8-Bit-Format zu konvertieren: Bild > Art > 8 - Bit (Abbildung 3).</li>
	<li>Einheiten auf Pixel festgelegt: Bild > Enter "Pixel" Längeneinheit, geben Sie 1 in "Pixelbreite", "Pixelhöhe", "Voxel Tiefe". Aktivieren Sie die Kontrollkästchen "Global" auf nachfolgende Bilder anwenden.</li>
	<li>Mit dem Polygon-Auswahl-Werkzeug, skizzieren Sie die Form des gesamten Lung Slices und ermitteln Sie Bereich (Pixel2) des gesamten Lunge Slice. Dieser Wert wird verwendet werden, um die prozentuale Tumorlast der Lunge zu berechnen.</li>
	<li>Schwelle Bild: Bild > anpassen > Schwellenwert > Markieren Sie "Standard" und "B & W" > verwenden Sie den Schieberegler Schwelle das Bild so, dass die Mehrheit der Tumorzellen genau hervorgehoben werden. "Apply" drücken führt zu einer schwarz / weiß Bild, wo die Lunge ist ganz schwarz, und die fluoreszierenden Läsionen sind weiß (Abbildung 3D). Ein zweites Drücken der "Übernehmen" wird das Bild invertieren, wo alle fluoreszierende Strukturen jetzt schwarze Formen (Abbildung 3E sind).</li>
	<li>Quantifizierung von der Anzahl und Form der Läsionen: Analysieren > Messungen festlegen > "Area" zu überprüfen. Deaktivieren Sie alle anderen Kontrollkästchen. Analysieren Sie Partikel > Größe (Pixel2): 0-unendlich repräsentiert den Bereich der Formen, die ImageJ auflisten wird. Bestimmen Sie empirisch die kleinste Läsion, die als eine einzelne Tumorzelle in Tag 0 Fahrzeugbilder gilt. Verwenden Sie den Bereich von diesem einzelnen Tumorzelle als untere Grenze für die restlichen Bilder im Dataset. Für die Arbeit in diesem Papier präsentiert ist 11 Pixel2 als untere Grenze festgelegt. Für die Arbeit in der video-Beispiel vorgestellt ist 24 Pixel2 als untere Grenze festgelegt. Lassen Sie "Rundheit" Palette als 0-1. "Show" auf eingestellt werden "Nichts". Alternativ, wenn "Show" und "Umrisse" ausgewählt ist, wird eine Zeichnung von allen Formkonturen generiert. Suchen Sie ein separates Fenster Messungen Pop-up "Ergebnisse anzeigen". Optional sparen mit "Add to Manager" Kontrollkästchen aktiviert alle Shapes, die quantifiziert mit einem ROI-Manager, die für die spätere Verwendung gespeichert werden können. Nach dem "OK" drücken, erscheint ein Fenster "Ergebnisse" mit allen aufgezählten Formen und Flächenmaße (Abbildung 3F).</li>
	<li>Kopieren und Einfügen der Daten aus dem Fenster "Ergebnisse" in eine Tabellenkalkulation. Verwenden Sie die mathematische Summe-Funktion in Excel fassen wir alle Bereiche der metastatischen Läsionen für diesen bestimmten Lunge-Slice. Um die Tumorlast Prozent Lunge Lunge Slice zu bewerten, teilen Sie die Summe der Flächen der metastatischen Läsionen durch die Gesamtfläche des Lung Slices. Dieser Parameter ist auch bekannt als Bereich Bruchteil (einA) die beschrieben wird durch Underwood 18weiter. Lunge Tumorlast = Summe der metastatischen Läsion Bereiche/Gesamt Fläche von Lung Slice</li>
	<li>Berechnen Sie die Lunge Tumorlast für den Rest der Lunge Abschnitte in Kontrollgruppe und verbleibenden Gruppen. Zeichnen Sie die durchschnittliche Lunge Tumorlast pro Gruppe in 0, 3, 7 und 14 Tagen. Vertreter Weitfeld fluoreszierende Bilder hoch und niedrig metastasierendem menschlicher OS Zellen wachsen in das PuMA-Modell zu progressive Zeitpunkten werden (Abb. 4A) angezeigt. Ein Liniendiagramm zeigt die Falte-Änderung (normiert auf Tag 0) in Prozent metastasierendem Tumorlast im Laufe der Zeit ist (Abbildung 4 b) gezeigt.</li>
</ol>4. konfokale Fluoreszenz-Bildgebung des PuMA-Modells
Hinweis: Für die konfokale Bildgebung ist Gewebe Verarbeitung ähnlich wie im vorherigen Abschnitt außer dass größere Lunge Scheiben (komplette Querschnitte, 1-2 mm dick) geschnitten werden, um für mehr ROIs, abgebildet werden können.
Kennzeichnung des Lungenparenchyms mit DAR4M:
<ol><li>Tauchen Sie Lunge Scheiben in 10 μμM DAR4M (in HBSS) für 45 min bei 37 ° C. DAR4M Etiketten reaktivem Stickstoff-Spezies innerhalb der Zellen der Lunge.</li>
	<li>Spülen Sie nach 45 min Inkubation die Lunge Scheiben mit frischen HBSS.</li>
	<li>Legen Sie die Lunge Scheibe in einem 35 mm-Glasboden Runde Schüssel und Bild auf das konfokale Mikroskop.</li>
	<li>Die bildgebende Parameter für die Beispielbilder, die in Abbildung 5 dargestellten sind in Tabelle 5aufgeführt.</li>
	<li>Erwerben Sie einen Z-Stapel für eine Region von Interesse. Verwenden Sie die empfohlene Z Scheibendicke für Nyquist Sampling. In Movie 1 und ergänzende Film 1kostenfrei ein repräsentativen Film eines 3D Stacks zeigt grüne fluoreszierende OS Zellen im Lungengewebe DAR4M beschriftet.</li>
</ol>Für die konfokale Beispielbilder in Abbildung 5gezeigt war die bildgebende Session terminal. Wenn längs Bildgebung erforderlich ist, wird die Verwendung eines 2-Photonen oder Multi-Photonen ausgestattete konfokale LSM Mikroskops für die Bildgebung empfohlen, da gibt es weniger lichtbedingten lebenden Gewebe19,20. Bildgebung Mito-RFP mit dem Ausdruck ihrer MG63 Zellen in das PuMA-Modell:
<ol><li>Führen Sie das PuMA-Protokoll als Gliederung in Schritt 1 und 2 mit MG63 Zellen mit dem Ausdruck der Mito-RFP-Konstrukt.</li>
	<li>Legen Sie die Lunge Scheibe in einem 35 mm-Glasboden Runde Schüssel und Bild auf das konfokale Mikroskop.</li>
	<li>Die bildgebende Parameter für die in Abbildung 6 gezeigten Beispielbilder sind in Tabelle 6aufgeführt. Einen repräsentativen Film eines 3D Stacks grüne fluoreszierende OS Zellen mit rot fluoreszierende Mitochondrien erfolgt in Movie 2 und zusätzliche Movie 2zeigen.</li>
</ol>

<ol><li>Khanna, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+drug+development+path+that+targets+metastatic+progression+in+osteosarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Toward a drug development path that targets metastatic progression in osteosarcoma.</a> Clin Cancer Res. 20 (16), 4200-4209 (2014).</li>
<li>Steeg, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspective%3A+The+right+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Perspective: The right trials.</a> Nature. 485 (7400), S58-S59 (2012).</li>
<li>Mendoza, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+metastasis+biology+and+therapy+in+real+time+in+the+mouse+lung%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Modeling metastasis biology and therapy in real time in the mouse lung.</a> J Clin Invest. 120 (8), 2979-2988 (2010).</li>
<li>Hong, S. H., Ren, L., Mendoza, A., Eleswarapu, A., Khanna, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+resistance+and+PKC+signaling%3A+distinguishing+features+of+high+and+low+metastatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Apoptosis resistance and PKC signaling: distinguishing features of high and low metastatic cells.</a> Neoplasia. 14 (3), 249-258 (2012).</li>
<li>Lizardo, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upregulation+of+Glucose-Regulated+Protein+78+in+Metastatic+Cancer+Cells+Is+Necessary+for+Lung+Metastasis+Progression%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Upregulation of Glucose-Regulated Protein 78 in Metastatic Cancer Cells Is Necessary for Lung Metastasis Progression.</a> Neoplasia. 18 (11), 699-710 (2016).</li>
<li>Pouliot, N., Pearson, H. B., Burrows, A. Investigating Metastasis Using In Vitro Platforms. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPouliot%2C+N+%22Metastatic+Cancer%3A+Clinical+and+Biological+Perspectives%22">Metastatic Cancer: Clinical and Biological Perspectives</a>. , Landes Bioscience. Austin, Texas. (2012).</li>
<li>Cameron, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+progression+of+metastasis+in+lung%3A+cell+survival%2C+dormancy%2C+and+location+dependence+of+metastatic+inefficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Temporal progression of metastasis in lung: cell survival, dormancy, and location dependence of metastatic inefficiency.</a> Cancer Res. 60 (9), 2541-2546 (2000).</li>
<li>Morrow, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTOR+inhibition+mitigates+enhanced+mRNA+translation+associated+with+the+metastatic+phenotype+of+osteosarcoma+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">mTOR inhibition mitigates enhanced mRNA translation associated with the metastatic phenotype of osteosarcoma cells in vivo.</a> Clinical Cancer Research. , (2016).</li>
<li>Varghese, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+videomicroscopy+reveals+differential+effects+of+the+vascular-targeting+agent+ZD6126+and+the+anti-angiogenic+agent+ZD6474+on+vascular+function+in+a+liver+metastasis+model%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">In vivo videomicroscopy reveals differential effects of the vascular-targeting agent ZD6126 and the anti-angiogenic agent ZD6474 on vascular function in a liver metastasis model.</a> Angiogenesis. 7 (2), 157-164 (2004).</li>
<li>Khanna, C., Hunter, K. <a target="_blank" href="https://pdfs.semanticscholar.org/7085/128aafb639e92c1df8f0212bfe53757e9cbd.pdf">Modeling metastasis in vivo.</a> Carcinogenesis. 26 (3), 513-523 (2005).</li>
<li>Welch, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+considerations+for+studying+cancer+metastasis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Technical considerations for studying cancer metastasis in vivo.</a> Clin Exp Metastasis. 15 (3), 272-306 (1997).</li>
<li>Somasekharan, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((YB-1+regulates+stress+granule+formation+and+tumor+progression+by+translationally+activating+G3BP1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">YB-1 regulates stress granule formation and tumor progression by translationally activating G3BP1.</a> J Cell Biol. 208 (7), 913-929 (2015).</li>
<li>El-Naggar, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+Activation+of+HIF1alpha+by+YB-1+Promotes+Sarcoma+Metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Translational Activation of HIF1alpha by YB-1 Promotes Sarcoma Metastasis.</a> Cancer Cell. 27 (5), 682-697 (2015).</li>
<li>MacDonald, I. C., Groom, A. C., Chambers, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+spread+and+micrometastasis+development%3A+quantitative+approaches+for+in+vivo+models%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Cancer spread and micrometastasis development: quantitative approaches for in vivo models.</a> Bioessays. 24 (10), 885-893 (2002).</li>
<li>Entenberg, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+permanent+window+for+the+murine+lung+enables+high-resolution+imaging+of+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis.</a> Nat Methods. 15 (1), 73-80 (2018).</li>
<li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+cancer+cell+extravasation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Quantification of cancer cell extravasation in vivo.</a> Nat Protoc. 11 (5), 937-948 (2016).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Underwood, E. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aUnderwood%2C+EE+%22Quantitative+stereology%22">Quantitative stereology</a>. , Addison-Wesley Pub. Co. (1970).</li>
<li>Tanaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+optical+imaging+of+cancer+metastasis+using+multiphoton+microscopy%3A+a+short+review%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transl+Res%22%5BJournal%5D)">In vivo optical imaging of cancer metastasis using multiphoton microscopy: a short review.</a> Am J Transl Res. 6 (3), 179-187 (2014).</li>
<li>Prouty, A. M., Wu, J., Lin, D. T., Camacho, P., Lechleiter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiphoton+laser+scanning+microscopy+as+a+tool+for+Xenopus+oocyte+research%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Multiphoton laser scanning microscopy as a tool for Xenopus oocyte research.</a> Methods Mol Biol. 322, 87-101 (2006).</li>
<li>Bijgaart, R. J., Kong, N., Maynard, C., Plaks, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+Live+Imaging+of+Lung+Metastasis+and+Their+Microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment.</a> J Vis Exp. (108), e53741(2016).</li>
<li>Guha, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+retrograde+signaling+induces+epithelial-mesenchymal+transition+and+generates+breast+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial retrograde signaling induces epithelial-mesenchymal transition and generates breast cancer stem cells.</a> Oncogene. 33 (45), 5238-5250 (2014).</li>
<li>Ren, L., Morrow, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((+Positively+selected+enhancer+elements+endow+osteosarcoma+cells+with+metastatic+competence%5BTitle%5D)+AND+%22.+Nat+Med%22%5BJournal%5D)"> Positively selected enhancer elements endow osteosarcoma cells with metastatic competence.</a> . Nat Med. , (2018).</li>
<li>Ren, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((+Metabolomics+uncovers+a+link+between+inositol+metabolism+and+osteosarcoma+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22+Oncotarget%22%5BJournal%5D)"> Metabolomics uncovers a link between inositol metabolism and osteosarcoma metastasis.</a> Oncotarget. 8 (24), 38541-38553 (2017).</li>
<li>Ren, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+metastatic+phenotype+of+a+panel+of+established+osteosarcoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Characterization of the metastatic phenotype of a panel of established osteosarcoma cells.</a> Oncotarget. 6 (30), 29469-29481 (2015).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Die folgende technischen Artikel beschreibt einige praktische Aspekte des Modells bei der Untersuchung der Lunge Kolonisation in OS PuMA. Im folgenden: einige wichtige Schritte in das Protokoll, wo Forscher besonders vorsichtig nehmen sollte
(a) Kanülierung der Luftröhre. Die Luftröhre kann leicht beschädigt werden, während sie sezieren die umliegenden Muskeln und Bindegewebe. Darüber hinaus kann die Nadel des Katheters leicht durch die Luftröhre gedrückt werden. Achten Sie besonders auf wie d...

Bessere Ergebnisse für pädiatrische Patienten mit metastasierendem Osteosarkom (OS) bleibt noch ein kritischer ungedeckten klinischen Bedarf 1. Dies unterstreicht die Bedeutung der Entwicklung neuer molekular zielgerichtete Therapien. Herkömmliche Chemotherapeutika, die Ziel-Tumor-Zell-Proliferation haben nicht als wirksam erwiesen bei der Behandlung von Metastasen und damit neue Strategien muss der metastatischen Prozess selbst 2ausgerichtet. Der aktuelle Artikel beschreibt die praktischen Aspekte der eine relativ neue Art von ex Vivo Lunge Metastasen Modell, entwickelt von Mendoza und Kollegen3, wonach ein nützliches Werkzeug bei der Entdeckung neuer pulmonalen Metastasen-Assay (PuMA) molekularen Treiber in der Lunge Metastasen Progression in OS 4,5. Bevor Sie fortfahren, es wäre klug, kurz auf einige aktuelle Modelle von Metastasen zu berühren, und wie das PuMA-Modell bietet mehrere Vorteile gegenüber konventionellen in-vitro- Tests.
Die meisten experimentelle Modellen genutzt, um Metastasen zu untersuchen umfassen in Vitro und in Vivo -Systeme, die entweder einem bestimmten Schritt oder mehrere Stufen der metastatischen Kaskade zu rekapitulieren. Diese Schritte umfassen: (1) die Migration vom Primärtumor, 2) Intravasation in nahe gelegenen Gefäße (Blut- oder Lymphgefäße) und Transitländern im Umlauf, Tumorzellen (3) verhaften am sekundären Standort, 4) Extravasation und Überleben am sekundären Standort, Bildung (5) Fixierungsprotokoll, und 6) Wachstum in vaskularisierte Metastasen (Abbildung 1). In-vitro- Modelle von Metastasen können 2-dimensionale (2D) Migration und 3-dimensionale (3D) Matrigel Invasion Assays, die in überprüft werden ausführlich an anderer Stelle 6. Für in-Vivo -Modelle, die zwei häufig verwendete Modellsysteme umfassen: 1) das spontane Metastasierung Modell ist wo ein Tumor-Zellen sind Orthotopically, die in einem bestimmten Gewebetyp einen lokalen Tumor bilden, die spontan metastasierende Zellen wirft injiziert an entfernten Standorten; (2) die experimentelle Metastasierung Modell ist wo Tumorzellen in das Blutgefäß stromaufwärts von dem Zielorgan injiziert werden. Zum Beispiel eine Rute Vene Injektion von Tumor-Zellen-Ergebnisse in der Entwicklung Lunge Metastasen5,7,8. Andere experimentelle Metastasen-Modelle verfügen über Injektion von Tumorzellen in die Milz oder mesenterialen Vene führt zu die Entwicklung von Lebermetastasen9,10. Praktische Erwägungen dieser in-Vivo -Modelle werden von Welch 11ausführlich erörtert. Ein weiteres in-Vivo -Modell zur Untersuchung von Metastasen in den pädiatrischen Sarkome ist der Nieren Nieren subkapsuläre Tumor Implantation Modell ergibt sich lokale Tumorbildung und spontane Metastasen in der Lunge 12,13. Eine technisch anspruchsvolle Technik wie intravitalen Videomicroscopy können direkt sichtbar zu machen, in Echtzeit, Wechselwirkungen zwischen metastatischen Krebszellen und den Microvasculature einer metastatischen Website (dh. Lunge oder Leber) wie beschrieben von MacDonald14 und Entenberg15oder Krebs Zelle Extravasation in der chorioallantoic Membrane wie beschrieben durch Kim 16.
Das PuMA-Modell ist ein ex-Vivo, Lunge Gewebe Explant, geschlossenes Kultursystem wo kann das Wachstum von Tumorzellen fluoreszierende längs über Fluoreszenz-Mikroskopie über einen Zeitraum von einem Monat beobachtet werden (siehe Abb. 2A). Dieses Modell rekapituliert die Anfangsphase der Lunge Kolonisation (Schritte 3-5) in der metastasierten Kaskade. Einige große Vorteile gegenüber konventionellen in-vitro- Modellen des Modells PuMA sind: 1) Es bietet die Möglichkeit, metastasiertem Krebs Zelle Wachstum in einem 3D Mikroumgebung längs zu messen, die viele Funktionen der Lunge Mikroumgebung behält Vivo 3; (2) PuMA ermöglicht den Forscher zu beurteilen, ob der Zuschlag einer Kandidaten-gen oder Drogenmissbrauch Behandlung Anti-metastatischen Aktivitäten im Zusammenhang mit einem 3D Lunge Mikroumgebung hat; (3) das PuMA-Modell sind flexibel mit vielen Arten von Fluoreszenz-Mikroskopie-Plattformen (Abbildung 2 b) wie Weitfeld-Fluoreszenz-Mikroskopie oder konfokale Laser-scanning-Mikroskopie, Beispiele für jede Abbildung 2 & Dzeigt, bzw.. Dieser Artikel wird erläutert, wie mithilfe der PuMA-Modell um längs Bilddaten auf metastasiertem Wachstum der erweiterten grün fluoreszierendes Protein (eGFP) zu erhalten-mit dem Ausdruck, menschliche Ebbe und metastasierendem Osteosarkom Zellen (MNNG und HOS Zellen) mit niedrig-Vergrößerung Weitfeld Fluoreszenz. Beispiele für imaging ein Fluoreszenzfarbstoff, der Lungenparenchyms Etiketten und ein rot-fluoreszierende Protein, die genetische Reporter der Mitochondrien in OS Etiketten im PuMA Modell konfokale Laser-scanning-Mikroskopie mit Zellen werden ebenfalls besprochen.

<table><tbody><tr><td>Tabelle 2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zellkulturreagenzien für A-Medien, B-Medien und vollständige Medien</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MNNG-HOS</td><td>ATCC</td><td>CRL-1547</td><td>hochmetastasierte OS-Zelllinie</td></tr><tr><td>HOS</td><td>ATCC</td><td>CRL-1543</td><td>schwach metastasierte OS-Zelllinie</td></tr><tr><td>MG63.3</td><td>Amy LeBlanc Laboratory (NCI)</td><td>N/A</td><td>hochmetastasierte OS-Zelllinie</td></tr><tr><td>MG63</td><td>ATCC</td><td>CRL-1427</td><td>schwach metastasierte OS-Zelllinie</td></tr><tr><td>10X M199 Medien</td><td>Thermofisher</td><td>11825015</td><td>Basismedien für A-Medien und B-Medien</td></tr><tr><td>Destilliertes Wasser (sterilisiert)</td><td>Thermofisher</td><td>15230-147</td><td>Komponente von A-Medien & B-Medien</td></tr><tr><td>7,5% Natriumbicarbonat Lösung</td><td>Thermofisher</td><td>25080094</td><td>Bestandteil von A-Medien & B-Medien</td></tr><tr><td>Hydrocortison</td><td>Sigma-Alrich</td><td>H6909</td><td>Komponente von A-Medien & B-Medien</td></tr><tr><td>Retinolacetat-wasserlöslich</td><td>Sigma-Alrich</td><td>R0635-5MG</td><td>Komponente von A-Medien & B-Medien</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin 10X konzentrierte (10000 U/ml) Lösung</td><td>Thermofisher</td><td>15140122</td><td>Komponente von A-Medien & B-Medien, komplette Medien.</td></tr><tr><td>Rinderinsulinlösung (10mg/ml)</td><td>Sigma-Alrich</td><td>I0516-5ML</td><td>Bestandteil von A-Medien & B-Medien</td></tr><tr><td>DMEM, Thermofisher mit hohem Glukosegehalt</td><td></td><td>11965092</td><td>Basismedien des Gesamtmediums</td></tr><tr><td>L-Glutamin (200 mM)</td><td>Thermofisher</td><td>25030081</td><td>Bestandteil des Gesamtmediums</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Thermofisher</td><td>16000044</td><td>Bestandteil des Gesamtmediums</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Thermofisher</td><td>14190144</td><td>Wird in Zellkulturen verwendet.</td></tr><tr><td>Hank' s Gepufferte Salzlösung, kein Kalzium, kein Magnesium, kein Phenolrot</td><td>Thermofisher</td><td>14175095</td><td>Wird verwendet, um Zellpellets vor der Injektion zu resuspendieren</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,25%), Phenolrot</td><td>Thermofisher</td><td>25200114</td><td>Wird in Zellkulturen verwendet.</td></tr><tr><td>DAR4M</td><td>Enzo</td><td>ALX-620-069-M001</td><td>Zur Markierung von Lungenparenchym.</td></tr><tr><td>Name</td><td>Unternehmen</td><td>Katalognummer</td><td>><Kommentare</td></tr><tr><td>Tabelle 3</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Materialien für PuMA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss 710 konfokal LSM</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td>Upright LSM konfokal Mikroskop</td></tr><tr><td>Zeiss 780 Konfokales LSM</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td>Inverses LSM Konfokalmikroskop</td></tr><tr><td>SCID Mäuse</td><td>Charles River</td><td>N/A</td><td>NOD. CB17-Prkdcscid/NcrCrl, weiblich, Alter 6-8 Wochen</td></tr><tr><td>GelFoam</td><td>Harvard Apparatus</td><td>59-9863</td><td>Wird als Stütze für Lungengewebeschnitte verwendet.</td></tr><tr><td>SeaPlaque Agarose</td><td>Lonza</td><td>50100</td><td>Wird bei der Insufflation der Lunge angewendet.</td></tr><tr><td>1 ml Spritze mit 27 Gauge Nadel</td><td>Fisherscientific</td><td>14-826-87</td><td>Zur Injektion von Schwanzvenen.</td></tr><tr><td>10 ml Spritze</td><td>BD</td><td>309604</td><td>Zur Insufflation der Lunge.</td></tr><tr><td>20-Gauge-Katheter</td><td>Terumo</td><td>SR-OX2032CA</td><td>Wird bei der Insufflation der Lunge verwendet.</td></tr><tr><td>Abbott IV Verlängerungsset (30", steril)</td><td>Medisca</td><td>8342</td><td>Zur Anwendung bei der Insufflation der Lunge.</td></tr><tr><td>Alkoholtupfer</td><td>BD</td><td>326895</td><td>Zum Abwischen der Schwanzvene vor der Injektion</td></tr><tr><td>Sterile OP-Handschuhe</td><td>Fisherscientific</td><td>Variiert je nach Größe</td><td>Askeptischer Umgang mit der Lunge von Mäusen</td></tr><tr><td>30 cm</td><td>Lineal Klammern</td><td></td><td>Wird zur Insufflation der Lunge verwendet.</td></tr><tr><td>Stützständer für Lineal</td><td>Pipette.com</td><td>HS29022A</td><td>Wird zur Insufflation der Lunge verwendet.</td></tr><tr><td>35 mm Kulturschale mit Glasboden</td><td>Ibidi</td><td>81158</td><td>Wird bei der Bildgebung von Lungenschnitten verwendet</td></tr><tr><td>Saugfähige Unterlagen mit wasserdichter Feuchtigkeitsbarriere</td><td>VWR</td><td>56617-014</td><td>Wird verwendet, um den sterilen Arbeitsbereich in der biologischen Haube auszukleiden.</td></tr><tr><td>Catgut Plain Resorbierbares Nahtmaterial</td><td>Braun</td><td>N/A</td><td>Wird zum Abbinden von kanülierter Luftröhre verwendet.</td></tr><tr><td>Name</td><td>Unternehmen</td><td>Katalognummer</strong<></td><td>strong>Kommentare</td></tr><tr><td>Tabelle 4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische Instrumente für PuMA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro Präparierschere 3,5" Gerade scharf/scharf</td><td>Roboz</td><td>RS-5910</td><td>Zum Schneiden von Lungenabschnitten</td></tr><tr><td>4" (10 cm) Lang, gezahnt, gerade, extra zart, 0,5 mm Spitze</td>, <td>Roboz</td><td>RS-5132</td><td>Zum Manipulieren/Halten von Lungenabschnitten.</td></tr><tr><td>4" (10 cm) Lange gezackte leichte Kurve 0,8 mm Spitze</td><td>Roboz</td><td>RS5135</td><td>Zum Manipulieren/Halten von Lungenabschnitten.</td></tr><tr><td>Daumen-Verbandzange; Gezahnt; Delikat; 4,5" Länge; 1,3 mm Spitzenbreite</td><td>Roboz</td><td>RS-8120</td><td>Für die allgemeine Dissektion.</td></tr><tr><td>Daumen-Abrichtzange 4,5" gezahnt 2,2 mm Spitzenbreite</td><td>Roboz</td><td>RS-8100</td><td>Für die allgemeine Dissektion.</td></tr><tr><td>Extra feine Mikro-Präparierschere 3,5" Gerade Scharf/Scharf, 20mm Klinge</td><td>Roboz</td><td>RS-5880</td><td>Für das allgemeine Präparieren.</td></tr><tr><td>Knapp Schere; Gerade; Scharf-stumpf; 27 mm Klingenlänge; 4" Gesamtlänge</td><td>Roboz</td><td>RS-5960</td><td>Für die allgemeine Dissektion.</td></tr></tbody></table>

praktische Überlegungen an einem studium von metastasierendem lungenkrebs besiedlung in osteosarkom mit pulmonalen metastasen-assay

Practical Considerations in Studying Metastatic Lung Colonization in Osteosarcoma Using the Pulmonary Metastasis Assay

Pulmonalen Metastasen-Assay (PuMA) ist ein ex-Vivo Lunge Explant und geschlossenen Zellkultursystem, die es Forschern erlaubt, die Biologie der Lunge Besiedlung in Osteosarkom (OS) durch Fluoreszenz-Mikroskopie zu studieren. Dieser Artikel enthält eine ausführliche Beschreibung des Protokolls und erläutert, Beispiele von Bilddaten auf metastasiertem Wachstum mit Weitfeld oder konfokale Fluoreszenz-Mikroskopie-Plattformen zu erhalten. Die Flexibilität des Modells PuMA erlaubt Forschern, nicht nur das Wachstum von OS-Zellen in der Lunge Mikroumgebung zu studieren, sondern auch die Auswirkungen der anti-metastatischen Therapeutika im Zeitverlauf zu beurteilen. Konfokale Mikroskopie ermöglicht eine noch nie da gewesenen, hochauflösende Bildgebung von OS-Zell-Interaktionen mit dem Lungenparenchym. Darüber hinaus Wenn das PuMA-Modell mit Fluoreszenzfarbstoffen oder fluoreszierende Protein genetische Reporter kombiniert wird, können Forscher die Lunge Mikroumgebung, zellulärer und subzellulärer Strukturen und Genfunktion Promotoraktivität in metastasierenden OS Zellen untersuchen. Das PuMA-Modell bietet ein neues Tool für Osteosarkom-Forscher entdecken neue Metastasen Biologie und die Aktivität der neuartigen anti-metastatischen, gezielte Therapien zu bewerten.

Low-Vergrößerung Weitfeld-Fluoreszenz-Mikroskopie
Für Weitfeld-Fluoreszenz-Mikroskopie von PuMA Lung Slices sind repräsentative Bilder und Quantifizierung Daten in Abbildung 2und Abbildung 4A und Bdargestellt. Die metastatischen Neigungen für hohe und niedrige metastasierendem Zelllinien sind über progressive Zeitpunkten visuel...

Das Ziel dieses Artikels ist es, eine detaillierte Beschreibung des Protokolls für die pulmonalen Metastasen-Assay (PuMA) zur Verfügung zu stellen. Dieses Modell erlaubt Forschern, metastasierendem Osteosarkom (OS) Zellwachstum im Lungengewebe mit Weitfeld-Fluoreszenz oder konfokale Laserscanning-Mikroskop zu studieren.

Praktische Überlegungen an einem Studium von metastasierendem Lungenkrebs Besiedlung in Osteosarkom mit pulmonalen Metastasen-Assay

The pulmonary metastasis assay (PuMA) is an ex vivo lung explant and closed cell culture system that permits researchers to study the biology of lung ...

Das übergeordnete Ziel dieses Lungenmetastasen-Assays ist es, das Wachstum von metastasierten Osteosarkomzellen in lebensfähigem Lungengewebe direkt sichtbar zu machen und zu untersuchen. Diese Methode kann helfen, wirklich wichtige Fragen auf dem Gebiet der Osteosarkom-Metastasierung zu beantworten. Zum Beispiel, wie sich metastasierende Osteosarkomzellen in der Mikroumgebung der Lunge anpassen, überleben und vermehren.Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine direkte Visualisierung des metastasierten Osteosarkom-Zellwachstums in einer relevanten dreidimensionalen Mikroumgebung ermöglicht. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, aufgrund der technisch anspruchsvollen Schritte der Kanülierung der Luftröhre und der Insufflation der Lunge Schwierigkeiten haben. Die Schwanzveneninjektion von Tumorzellen und die Euthanasie von Mäusen erfolgen nach den üblichen institutionellen Richtlinien.Legen Sie die euthanasierte Maus nach fünf Minuten in Rückenlage auf ein steriles Pad in einer Laminar-Flow-Haube und verwenden Sie eine kleine, sterile Schere, um das Brustbein vorsichtig hinter dem thorakalen Einlass auf beiden Seiten der L

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Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

Dieser Artikel beschreibt die Verfahren der experimentellen Metastasierung Assay, mit denen die metastatische Potential von humanen Krebszelllinien zu bestimmen.

Experimentelle Metastase Assay

Das erfindungsgemäße Protokoll in der vorliegenden Studie berichtet ermöglicht selektiven Nachweis von Lungenmetastasen in einzelne Zelle Auflösung in Mäusen durch...

Verbesserte Visualisierung von Lungenmetastasen bei Single Cell Auflösung in Mäusen durch kombinierte<em&gt; In-situ</em&gt; Perfusion des Lungengewebes und X-Gal Färbung von<em&gt; LacZ</em&gt;-Tagged Tumor Cells

Dieses Manuskript beschreibt eine Methode zur Quantifizierung der Tumor Zelle Ansammlung in der Lunge in einem Tiermodell der Tumor Metastasen.

Lung Tumor Zelle Rekrutierung Assay

Diese Arbeit setzt ein fortschrittliches Protokoll vor, um die Tumorbelastung durch den Nachweis von grünen Fluoreszenzprotein- und Biolumineszenzsignalen sowie die Integration quantitativer molekularer Detektionstechniken genau zu bewerten.

Studieren von dreifach negativem Brustkrebs mit orthotopischem Brustkrebsmodell

Der beschriebene Ansatz kombiniert experimentelle Schwanzvenenmetastasierungs-Assays mit in vivo Live-Tier-Imaging, um neben der Quantifizierung der Metastasenzahl und -größe in der Lunge auch die Echtzeit-Überwachung der Bildung und des Wachstums von Brustkrebsmetastasen zu ermöglichen.

Kombinierte Verwendung von Tail Vein Metastasis Assays und Real-Time In Vivo Imaging zur Quantifizierung der metastasierenden Kolonisation und Belastung von Brustkrebs in der Lunge

Die intravenöse Injektion von Krebszellen wird häufig in der Metastasenforschung eingesetzt, aber die metastasierende Tumorbelastung kann schwer zu analysieren sein. Hierin demonstrieren wir ein Schwanzvenen-Injektionsmodell der Metastasierung und beinhalten einen neuartigen Ansatz zur Analyse der resultierenden metastasierenden Lungentumorbelastung.

Pathologische Analyse der Lungenmetastasierung nach lateraler Schwanzveneninjektion von Tumorzellen

Knochenmetastasenmodelle entwickeln Metastasen nicht gleichmäßig oder mit einer 100%igen Inzidenz. Die direkte intraossäre Injektion von Tumorzellen kann zu einer Embolisation der Lunge führen. Wir stellen unsere Technik zur Modellierung von primären Knochentumoren und Knochenmetastasen mittels solider Tumortransplantatimplantation in den Knochen vor, was zu reproduzierbarem Transplantat und Wachstum führt.

Modellierung von primären Knochentumoren und Knochenmetastasen mit Implantation eines soliden Tumortransplantats in den Knochen

Hier wird eine syngene orthotope Implantation gefolgt von einem Amputationsverfahren des Osteosarkoms mit spontaner Lungenmetastasierung beschrieben, das zur präklinischen Untersuchung der Metastasenbiologie und entwicklung neuartiger Therapeutika eingesetzt werden kann.

Ein syngenes orthotopes Osteosarkom Sprague Dawley Rattenmodell mit Amputation zur Kontrolle der Metastasenrate

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Intratibia-Osteosarkom-Zellinjektion zur Generierung von Mausmodellen mit orthotopen Osteosarkom- und Lungenmetastasenläsionen.

Intratibiale Osteosarkom-Zellinjektion zur Erzeugung orthotoper Osteosarkom- und Lungenmetastasen-Mausmodelle

Das Manuskript beschreibt eine Methodik für die Etablierung sowie das longitudinale Wachstumsmonitoring von spontanen Lungenmetastasen von orthotopisch injizierten Brusttumoren, die in allen Stadien der Metastasierungskaskade interveniert werden kann.

Im lebenden Organismus Bildgebung zur Messung der spontanen Lungenmetastasierung von orthotopisch injizierten Brusttumorzellen

Dieses experimentelle Protokoll bietet eine stabile, kosteneffiziente und effiziente Methode, die lncRNA-Knockdown mit koloniebildenden Assays kombiniert, um die Wirkung von lncRNA auf die Proliferation von Osteosarkomzellen zu quantifizieren.

Kolonienbildungsassay zur Erkennung der Proliferationskapazität von LncRNA-Knockdown-Osteosarkomzellen

Erfahren Sie den Pulmonalen-Metastasen-Assay zur Visualisierung metastasierender Osteosarkomzellen im Lungengewebe. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Zellwachstum und Überlebensmechanismen in einer dreidimensionalen Mikroumgebung.

Praktische Überlegungen an einem Studium von metastasierendem Lungenkrebs Besiedlung in Osteosarkom mit pulmonalen Metastasen-Assay (Video) | JoVE Journal

Praktische Überlegungen an einem Studium von metastasierendem Lungenkrebs Besiedlung in Osteosarkom mit pulmonalen Metastasen-Assay

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