Name: Nachweis von seltenen Mutationen im CtDNA mit Next Generation Sequencing (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: Erfahren Sie die ER-Seq-Methode zum Nachweis seltener Mutationen in ctDNA für die Onkologie. Diese Technik mit bidirektionaler Fehlerkorrektur bietet hohe Sensitivität und Spezifität für präzise klinische Diagnostik.

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Tumor Proben und Blutproben wurden nach einem Protokoll genehmigt durch das Ethik Komitee der Peking Universität Menschen erhalten &#39; s Krankenhaus. Schriftliche Einwilligungserklärung wurden die Patienten mit ihren Proben entnommen. Die Teilnehmer wurden nach folgenden Kriterien überprüft: Weiblich, erweiterte Non-Small Cell Lung Cancer, EGFR p.L858R Mutation durch vorherige Sanger-Sequenzierung, Fortschreiten der Erkrankung nach zwei Sitzung des EGFR zielgerichtete Therapie mit Erlotinib, und ER-Seq, die angewendet wurde, um CtDNA die Ursache des Widerstands zu analysieren und finden neue Ziel Medikamente.
 1. DNA-Extraktion aus dem peripheren Blut für Blut und genomischer DNA (gDNA) <ol><li>sammeln 10 mL des peripheren Blutes in einem Sammelrohr, invertieren sanft auf und ab 6 - 8 Mal zu mischen. Vermeiden Sie Zelle zu scheren. Blutproben können bis zu 72 Stunden in dem Sammelrohr bei 6-37 ° C gelagert werden.</li>
	<li>Zentrifugieren dem Sammelrohr bei Raumtemperatur für 10 min bei 1600 (±150) x g.</li>
	<li>Übertragung den überstand (Plasma) aus dem Sammelrohr bis vier saubere 2 mL entsprechend gekennzeichnet Zentrifuge Röhrchen mit einem Einweg-Pipettieren ohne zu stören die Pellet-Schicht (weiße Blutkörperchen).</li>
	<li>Transfer1 mL der Zellen mit einer sauberen Einweg Pipettieren bis 2 mL entsprechend gekennzeichnet Zentrifugenröhrchen. Die Zellen können gespeicherte bei-20 ° C oder kälter vor Schritt 1,8 werden.</li>
	<li>Zentrifugieren des Plasmas (aus Schritt 1.3) für 10 min bei 4 ° C und 16000 (±150) x g.</li>
	<li>Übertragen das Plasma zur Reinigung der Zentrifuge Rohre richtig gekennzeichnet als &#34; Plasma &#34;, ~0.1 mL Restvolumen an der Unterseite zur Vermeidung von Kontaminationen zu verlassen. Speichern Sie das Plasma bei-80 ° C bis Schritt 1.7.</li>
	<li>3 mL Plasma aus Schritt 1.6 verwenden, um Blut zu isolieren (enthält CtDNA) mit einem kommerziell erhältlichen Kit, Anschluss an die Hersteller &#39; s Anweisungen.</li>
	<li>Einsatz 200 µL der weißen Blutkörperchen aus Schritt 1.3 gDNA mit einem kommerziell erhältlichen Kit, Anschluss an die Hersteller zu isolieren &#39; Anweisungen s. 
	Hinweis: Beide Blut und gDNA können bei-20 ° C vor dem Gebrauch gespeichert werden.</li>
	<li>Gelten verschiedene Qualitätskontrollen für Blut und gDNA (Tabelle 2). Führen Sie Qualitätskontrolle durch ein standardisiertes Verfahren zur Bioanalyzer Probe Abbau und/oder gDNA Kontamination zu bestimmen. Peak-Analyse der Qualität der Blut-Extraktion sollte angezeigt werden, ähnlich wie Abbildung 1. 
	Hinweis: Die Maximalgröße von Blut ist etwa 170 BP. beachten Sie, dass die Erhöhung der Menge an DNA in einer höheren Qualität-Bibliothek für die effektive Erkennung von seltenen Mutationen im Blut führt. Wir empfehlen die Verwendung von mindestens 30 ng Blut (30.000 Exemplare).</li>
</ol> 2. Vorbereitung der Bibliothek Hinweis: betreffend Basisbibliothek Konstruktion auf fragmentierte DNA, Blut existiert in Fragmente mit einer Spitze Größe ~ 170 bp und müssen somit nicht fragmentiert werden.
<ol><li>Fragment des Steuerelements Probe (gDNA) durch Ultraschallbehandlung, 200-250 bp Fragmente zu erhalten.
	<ol><li>Bereiten 1 µg gDNA Samples in 100 µL Tris-EDTA Puffer in einem Rohr sauber Sonorisierung.</li>
		<li>Stellen die Beschallung-Programm als 30 s ein und 30 s aus 12 Zyklen für eine Gesamtmenge von 12 min.</li>
		<li>Nach Beschallung, bestätigen das Produkt (5 µL) enthält 200-250 bp Fragmente durch eine Laufanalyse mit 2 % Agarosegel.</li>
		<li>Alle Fragmentierung Produkte auf eine neue 1,5 mL Tube übertragen und inkubieren Sie mit 150 µL des magnetischen Beads für 5 min die richtige Fragmente auswählen.</li>
		<li>Den Überstand zu entfernen, indem Sie das Rohr auf einem magnetischen Rack für 30 s.</li>
		<li>Waschen die Perlen mit 200 µL von 80 % Ethanol (frisch zubereitet) mit dem Rohr auf das magnetische Gitter bleiben. Inkubieren Sie für 30 s vor dem Entfernen des Überstands. Einmal zu wiederholen.</li>
		<li>Luft trocknen die Perlen mit dem Rohr Deckel geöffnet während Ihres Aufenthalts auf der magnetischen Zahnstange. Vermeiden Sie pulverisieren Perlen um sicherzustellen, dass die DNA Ziel gut erholt. DNA-Fragmente aus den Perlen indem 32 µL 10 mM Tris-HCl (pH 8) zu den Perlen, die DNA-Fragmente gefolgt durch Quantifizierung von UV/Vis Spektroskopie zu lösen eluieren. 
		Hinweis: mindestens 200 ng ist für die folgenden Experimente erforderlich.</li>
	</ol></li> <li>Ende Prep Reaktion Hinweis: Folgen Sie Hersteller &#39; s Anleitung und nach Bedarf ändern. Einsatz 30 ng von Blut; und 1 µg gDNA als Kontrolle.
	<ol><li>Hinzufügen 7 µL Reaktion Puffer, 3 µL Enzym-Mix, 30 ng von Blut in ein steriles Röhrchen Nuklease-frei, und Gesamtvolumen von 60 µL DdH 2 O hinzufügen. In einem separaten Rohr, die oben genannten Komponenten hinzuzufügen, aber mit 1 µg gDNA statt Blut.</li>
		<li>Mix und inkubieren Sie die Mischung bei 20 ° C für 30 min, gefolgt von 65 ° C für 30 min in einem Thermocycler ohne Deckel erhitzt. Sofort mit dem nächsten Schritt fortfahren.</li>
	</ol></li> <li>Adapter Ligation <ol><li>hinzufügen 30 µL der Ligatur-master-Mix, 1 µL der Ligatur-Enhancer und 4 µL der einzigartigen Sequenzierung Adapter auf die Mischung aus Schritt 2.2.</li>
		<li>Inkubation bei 20 ° C für 15 min in einem Thermocycler ohne Deckel erhitzt.</li>
		<li>Vortex Aufschwemmen der magnetischen Beads und lassen die Perlen bei Raumtemperatur für mindestens 30 Minuten vor dem nächsten Schritt fort.</li>
		<li>87 µL der resuspendierte magnetische Beads zu der zuvor erwähnten Mischung; mischen gut durch Pipettieren rauf und runter und dann bei Raumtemperatur 5 min inkubieren</li>
		<li>Waschen und lufttrocknen die Perlen wie unter Schritt 2.1.</li>
		<li>Das Ziel der DNA aus den Perlen durch Zugabe von 20 µL 10 mM Tris-HCl (pH 8) eluieren.</li>
	</ol></li> <li>Anreicherung von DNA-Fragmenten mit Adapter ligiert <ol><li>fügen Sie 20 µL Adapter ligiert DNA-Fragmente, 5 µL der Index Primer/i7 (2,5 µL Primer-P7 (22:00) und 2,5 µL Primer-P5 (22:00), Sequenzierung Zwecken), 25µL von Bibliothek-Verstärkung-master-Mix und DdH 2 O auf ein Gesamtvolumen von 50 µL.</li>
		<li>PCR verstärken die Adapter ligiert DNA und thermischen Zyklus wie folgt: erste Denaturierung bei 98 ° C für 45 s, gefolgt von 8 Zyklen (Blut) oder 4 Zyklen (gDNA) des Glühens ° C für 15 s, 65 ° C für 30 s, 72 ° C für 30 s) , und eine letzte Verlängerung bei 72 ° C für 60 s, dann hält die Temperatur um 4 ° c</li>
		<li>Hinzufügen 45 µL des schwebenden magnetischen Beads an die PCR-angereicherten DNA erworbenen Fragmente erhalten.</li>
		<li>Eluieren DNA-Fragmente mit Adaptern in 30 µL 10 mM Tris-HCl (pH 8).</li>
	</ol></li> <li>Bibliothek Qualitätskontrolle <ol><li>folgen den Hersteller &#39; s-Protokoll für das kommerzielle Kit Adapter messen ligiert DNA-Konzentration. Verwenden Sie die Bioanalyzer zur Bestimmung der DNA-Qualität.</li>
	</ol></li></ol> 3. Gezielte DNA-Erfassung Hinweis: Target Anreicherung erfolgte mittels eine benutzerdefinierte Sequenz Capture-Sonde, die speziell für eine 1021 kb Bereicherung Zielregion für bekannte Tumor-assoziierten Treiber Mutationen von 12 verschiedene Arten von Tumoren. Änderungen an den Hersteller &#39; s-Protokoll werden in den folgenden Schritten beschrieben.
<ol><li><ol><li>Add 1,5 µg Blockierung des Poolings Bibliotheken (maximale Anzahl von Bibliotheken zum Pool für Blut ist 6, gDNA ist 20) aus Schritt 2, 8 µL P5 Block(100P), 8 µL P7 Block(100P) und 5 µL Kinderbett-1 DNA (1 µg/µL) in ein steriles Röhrchen. Trocknen Sie den Inhalt des Rohres mit einem Vakuum Konzentrator auf 60 festgelegt ° C.</li>
	</ol></li> <li>Hybridize, die die DNA-Erfassung-mit der Bibliothek Sonden.
	<li>Fügen Sie die folgenden Komponenten, um den Schlauch vom Schritt 3.1: 8.5 µL 2 X Hybridisierung Puffer, 2,7 µL Hybridisierung Enhancer und 1,8 µL Nuklease-freie DdH 2 O.</li> <ol>
		<li>Mix von oben und unten pipettieren und brüten in einem Thermomixer bei 95 ° C für 10 min.</li>
		<li>Nach Inkubation, sofort hinzufügen 4 µL des Custom-Probe. Inkubieren Sie Proben in einem Thermocycler bei 65 & #176; C mit Deckel erhitzt auf 75 ° C für 4 Std.</li>
	</ol></li> <li>DNA Fragmente Aufnahme <ol><li>inkubieren das hybridisierte Ziel DNA mit Streptavidin-Perlen, gefolgt vom Waschen der Perlen um ungebundene DNA zu entfernen. Verwenden Sie das kommerzielle Kit laut Hersteller &#39; s Anweisungen, um eine endgültige 20 µL resuspendierte Perlen mit aufgenommenen DNA Fragmente.</li>
	</ol></li> <li>Verstärkung der erfassten DNA Fragmente <ol><li>führen Sie PCR unter Verwendung der kommerziellen kit mit 2 µM Rückgrat Oligonukleotide, laut Hersteller &#39; s Anweisungen.</li>
		<li>Wenn der PCR-Reaktion abgeschlossen, 45 µL des suspendierten Perlen das PCR-Produkt direkt hinzufügen und bereichern die verstärkte Ziel DNA-Fragmente durch Elution mit 30 µL 10 mm Tris-HCl (pH 8) an die Perlen gebunden.</li>
	</ol></li> <li>Quantifizieren die DNA-Fragmente mit der Bibliothek Quantifizierung Kit und bestimmen Sie die durchschnittliche Fragmentlänge von Bioanalyzer ( Abbildung 2).</li></ol>
 4. Sequenzierung <ol><li>Sequenz gemultiplext Bibliotheken mit 75 bp gepaart-End läuft auf einem Benchtop-Sequenzer für 18 h. Gesamtdaten produziert bis zu 60 Gigabyte, 15 G wird für Patientenprobe Blut und 1G für Kontrolle Probe gDNA.</li></ol>
 5. Daten-Analyse-Workflows Hinweis: Abbildung 3 zeigt die allgemeine Arbeit Informationsfluss und Analyseprozess. Daten-Analyse-Parameter und Befehle sind unten aufgeführt.
<ol><li>Filter minderwertige liest und korrigiert Fehler und Maskierung der UID mit NCfilter. 
	NCfilter(own) NCfilter filter - Q 0,5 -l 5 - 0,1 n -T 3 - G -1 fastq1-2 fastq2 realSeq(own) Python bin/RealRealSeq fq1 MaskUID-1-2 fq2 -o Ausgang Dir -p Präfix -u 4 -s 7 - m 3 -i UidFile-f.</li>
	<li>Genom hg19 Referencing (menschliche Genom 19), suchen Sie die Sequenzierung Ergebnisse über die BWA (Version 0.7.12-r1039) Mem und ausrichten mit Genome Analysis Toolkit (GATK) (Version 3.4-46-gbc02625). 
	BWA Mem -t 3 hg19 fastq1 fastq2 Java-d64-Server - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g - Xmx10g - Djava.io.tmpdir=/tmp/-Jar GenomeAnalysisTK.jar -T RealignerTargetCreator -R hg19 -L TargetRegion-Dbsnp bekannt &#8212; 
	AllowPotentiallyMisencodedQuals -nt 10 - Ich CancerBam-ich NormalBam Java-d64-Server - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g &#8212; Djava.io.tmpdir=/tmp/-Jar GenomeAnalysisTK.jar -T IndelRealigner -R hg19-bekannt Dbsnp - AllowPotentiallyMisencodedQuals &#8212; TargetIntervals Abständen-ich CancerBam-ich NormalBam</li>
	<li>Cluster die Duplikate nach der UID und Position der Vorlage-Fragmente, die den Fehler zu korrigieren, Grundlagen von PCR/Sequenzierung eingeführt und ändern die Basis Qualität. 
	realSeq(own) Python RealSeq/bin/RealSeq CLUSTER -b unmarkdup_sort_merge.bam - R ChipRegion -o Output_dir -p Präfix -m 6</li> <li>neu ausrichten die gruppierten Duplikate von BWA-mem. 
	BWA Mem -t 3 hg19 fastq1 fastq2</li> <li>führen Sie eine lokale Neuausrichtung gefolgt von eine Rekalibrierung der Basis Qualitätsfaktor mithilfe GATK (Version 3.4-46-gbc02625). 
	Gesundheitsamt Neuausrichtung: Java-d64-Server - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g--Djava.io.tmpdir=/tmp/-Jar GenomeAnalysisTK.jar -T RealignerTargetCreator -R hg19 -L TargetRegion-bekannt Dbsnp - AllowPotentiallyMisencodedQuals -nt 10 -Ich CancerBam-ich NormalBam Java-d64-Server - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g--Djava.io.tmpdir=/tmp/-Jar GenomeAnalysisTK.jar -T IndelRealigner -R hg19-bekannt Dbsnp - AllowPotentiallyMisencodedQuals - TargetIntervals Intervalle-ich CancerBam-ich NormalBam Basis-Qualitätsfaktor Rekalibrierung: Java-d64-Server - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g-Djava.io.tmpdir=/tmp/ - Jar GenomeAnalysisTK.jar -T BaseRecalibrator -R hg19 -L TargetRegion - KnownSites Dbsnp - KnownSites kosmische - AllowPotentiallyMisencodedQuals - Nct 10 - Ich Bam -o GFK Java-d64-Server - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g--Djava.io.tmpdir=/tmp/-jar GenomeAnalysisTK.jar -T PrintReads-ich Bam - BQSR GFK -o Outbam -R hg19 - Nct 8 - AllowPotentiallyMisencodedQuals</li> <li>zum SNV (Einzel-Nukleotid-Variante) und INDEL (kleine Einfügungen oder Löschungen) telefonieren, die Genauigkeit der Niederfrequenz-Mutationen wird bestätigt durch die GSR (gute Unterstützung liest) mit beiden vorwärts und rückwärts Strang lesen Paare und Filtration durch Kontrollgruppe (Keimbahn-Mutationen) und Grunddatenbank. 
	realDcaller(own) Python RealDcaller -f hg19 - R ChipRegion - C BaselineDB - O -L 2 CancerBam NormalBam -p 30</li> <li>Grundlinie Proben als ein Steuerelement für CNV (Kopie Nummer Variation) Berufung verwenden. 
	NCcnv(own) Python NCcnv -o Cnvdir -t Tmpdir - R ChipRegion Cnv--Normgt NormalBam--Tumgt CancerBam--Repdb RepeatMarsk</li> <li>Realigned unzugeordnet, Clips und diskordanten paar liest SV (strukturellen Variationen) anrufen. 
	NCsv(own) NCsv -t Tmpdir - R hg19 -o Outputdir Python - X Transkript -w Bwapath -n 4 NormalBam CancerBam</li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Die Existenz zirkulierender Tumor-DNA (CtDNA) wurde vor mehr als 30 Jahren entdeckt, aber die Anwendung von CtDNA Analysen noch nicht routinemäßig in der klinischen Praxis ist. Interesse an der praktischen Anwendung von CtDNA Methoden hat mit der Entwicklung von Technologien zur CtDNA Erkennung und Analyse erhöht. Tumor-Überwachung mit CtDNA bietet einen minimal-invasive Ansatz für die Bewertung der mikroskopischen Resterkrankung, Reaktion auf Therapie und molekulare Tumor-Profile unter dem Hintergrund der Tumor Evolutio...

Next Generation Sequencing (NGS), ein leistungsfähiges Werkzeug zu untersuchen, die Geheimnisse des Genoms, bieten eine große Menge an Informationen, die genetische Veränderungen offenbaren kann. Die Anwendung der NGS-Analyse in der Klinik ist immer häufiger, vor allem für die personalisierte Medizin geworden. Eines der größten Einschränkungen der NGS, ist jedoch eine hohe Fehlerquote. Obwohl es für Studium vererbte Mutationen geeignet erachtet wird, ist die Analyse von seltenen Mutationen stark eingeschränkt1,2, vor allem bei der Analyse von DNA aus einer "Flüssigbiopsie" gewonnen.
Tumor im Umlauf ist DNA (CtDNA) zellfreie DNA (Blut) in das Blut, das von Tumorzellen vergossen wird. In den meisten Fällen ist die Menge der CtDNA äußerst gering, die die Erkennung und Analyse sehr anspruchsvoll. CtDNA hat jedoch viele attraktive Features: seine Isolation ist minimal invasiv, kann in den frühen Stadien des Tumorwachstums erkannt werden, die CtDNA Ebene reflektiert therapeutische Effizienz und CtDNA enthält DNA-Mutationen in primären und metastatischen Läsionen gefunden 3 , 4 , 5. daher angesichts die rasante Entwicklung der NGS-Technik und Analyse, die Anwendung der CtDNA-Erkennung ist attraktiver geworden.
Haben verschiedene massiv parallelen Sequenzierung Ansätze zur CtDNA Erkennung verwendet worden, aber keiner dieser Ansätze für den routinemäßigen Einsatz in Kliniken aufgrund ihrer Einschränkungen angenommen worden: niedrige Empfindlichkeit, Mangel an Vielseitigkeit und einen relativ hohen Preis6 ,7,8. Zum Beispiel korrigiert duplex Sequenzierung, basierend auf einem eindeutigen Bezeichner-Tag (UID), immer wieder Fehler in der Konsens bidirektional, die meisten Sequenzierung Fehler beheben. Die Machbarkeit dieser Methode ist jedoch aufgrund der hohen Kosten und geringe Auslastung9,10verloren. Ebenso haben CAPP-Seq und seine verbesserte Iteration, CAPP-IDES11,12, größeren Praktikabilität im Blut erkennen, obwohl die Genauigkeit und die Universalität dieser Methoden verbessert werden.
Um den aktuellen Bedarf für genaue CtDNA Detektion und Analyse, entwickelten wir eine neue Strategie, bereichern seltene Mutation Sequenzierung (ER-Seq). Dieser Ansatz verbindet die folgenden: einzigartige Sequenzierung Adapter effizient wiederherstellen CtDNA Moleküle mit bidirektionalen Fehlerkorrektur und die Fähigkeit, eine einzige Mutation von unterscheiden &#62; 1 × 107 Wildtyp Nukleotide; 1021 kb-Sonden, die Messung der Zielregionen zu bereichern, die decken mehr als 95 % der Tumor im Zusammenhang mit Mutationen von 12 Tumoren, einschließlich Lungenkrebs, Darmkrebs, Magenkrebs, Brustkrebs, Nierenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Leberkrebs, Schilddrüsen-Krebs, Gebärmutterhalskrebs, Speiseröhrenkrebs und Endometrium-Karzinom (Tabelle 1); und Grunddatenbank screening machen, effizient und einfach zu seltene Mutationen im CtDNA genau zu erkennen.
Um eine Baseline-Datenbank zu erstellen, finden Sie alle Gen-Mutationen durch ER-Seq aus einer Reihe von der gleichen Art von Proben (~ 1000 am Anfang). Diese echte Mutationen ist durch mehrere andere zuverlässige Nachweismethoden und Analyse nachzuweisen. Als nächstes zusammenfassen, das Muster der falschen Mutationen und cluster-die falsche Mutationen um die erste Grundlinie-Datenbank zu erstellen. Weitere falsche Mutationen gefunden von nachfolgenden Sequenzierung Experimente zu dieser Datenbank hinzufügen. Daher wird diese Grunddatenbank dynamische erweiterte Datenbank, die Sequenzierung Genauigkeit deutlich verbessert.
Um Fortschritte bei der Tumor-Diagnose und Überwachung zu fördern, präsentieren wir ER-Seq, eine kostengünstige und praktikable Methode für den Erwerb von allgemeinen Daten. Wir präsentieren eine Fallstudie, die ER-Seq Analyse unterzog sich demonstriert seine Genauigkeit zum Nachweis von seltenen Mutationen und Machbarkeit für den Einsatz in der Klinik.

<table><tbody><tr><td>QIAamp Zirkulierendes Nukleinsäure-Kit</td><td>Qiagen</td><td>55114</td><td>DNA-Extraktion aus peripherem Blut für cfDNA</td></tr><tr><td>QIAamp DNA-Blut Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>51105</td><td>DNA-Extraktion aus peripherem Blut für gDNA</td></tr><tr><td>Quant-iT dsDNA HS Assay Kit</td><td>Invitrogen</td><td>Q32854</td><td>Messung der cfDNA-Konzentration</td></tr><tr><td>Quant-iT dsDNA BR Assay Kit</td><td>Invitrogen</td><td>Q32853</td><td>Messung Bibliothekskonzentration</td></tr><tr><td>Agilent DNA 1000 Reagenzien</td><td>Agilent</td><td>5067-1504</td><td>Messung von cfDNA und Bibliotheksfragmenten</td></tr><tr><td>Das NEBNext UltraII DNA Library Prep Kit für Illumina</td><td>NEB</td><td>E7645L</td><td>Vorbereitung der Bibliothek</td></tr><tr><td>Agencourt SPRIselect Reagenz</td><td>Beckman</td><td>B23317</td><td>Screening und Aufreinigung von DNA-Fragmenten</td></tr><tr><td>Tris-HCl (10 mM, pH 8,0)-100ML</td><td>Sigma</td><td>93283</td><td>Auflösung</td></tr><tr><td>xGen Lockdown Sonden</td><td>IDT</td><td>&ndash; &ndash;</td><td>Benutzerdefinierte xGen-Sonde</td></tr><tr><td>Human Cot-1 DNA</td><td>Life</td><td>15279-011</td><td>Gezielte DNA-Erfassung</td></tr><tr><td>Dynabeads M-270 Streptavidin</td><td>Life</td><td>65305</td><td>Gezielte DNA-Erfassung</td></tr><tr><td>xGen Lockdown Reagenzien</td><td>IDT</td> 1072281 <td>Gezielte DNA-Erfassung</td><td></td></tr><tr><td>KAPA HiFi HotStart ReadyMix KAPA</td><td></td><td>KK2602</td><td>PCR-Anreicherungsbibliotheken nach der Erfassung</td></tr><tr><td>KAPA Library Quantification Kit</td><td>KAPA</td><td>KK4602</td><td>Messen Sie die Konzentration in der Bibliothek</td></tr><tr><td>NextSeq 500 High Output Kit v2((150 Zyklen)</td><td>illumina</td><td>FC-404-2002</td><td></td></tr><tr><td>Sequenzzentrifuge5810</td><td>eppendorf</td><td>5810</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop8000</td><td>Thermo Scientific</td><td>8000</td><td>Messung der gDNA-Konzentration</td></tr><tr><td>Qubit 2.0</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>Quantify</td></tr><tr><td>Agilent 2100 Bioanalysator</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ThermoMixer C</td><td>eppendorf</td><td></td><td>Inkubation</td></tr><tr><td>16-röhrchen DynaMagTM-2 Magnet</td><td>Life</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Concentrator plus</td><td>eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR</td><td>AB</td><td>simplyamp</td><td></td></tr><tr><td>QPCR</td><td>AB</td><td>7500Dx</td><td></td></tr><tr><td>NextSeq 500</td><td>illumina</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

nachweis von seltenen mutationen im ctdna mit next generation sequencing

Detection of Rare Mutations in CtDNA Using Next Generation Sequencing

Die Analyse der zirkulierenden Tumor-DNA (CtDNA) mit Next Generation Sequencing (NGS) ist ein wertvolles Werkzeug für die Entwicklung der klinischen Onkologie geworden. Die Anwendung dieser Methode ist jedoch schwierig wegen seiner niedrigen Empfindlichkeit bei der Analyse der Spur Menge an CtDNA im Blut. Darüber hinaus kann die Methode falsch-positive und negative Ergebnisse aus dieser Sequenzierung und die anschließende Analyse generieren. Um die Machbarkeit und Zuverlässigkeit der CtDNA-Erkennung in der Klinik zu verbessern, stellen wir hier eine Technik, die seltene Mutationen für die Sequenzierung, bereichern seltene Mutation Sequenzierung (ER-Seq) bereichert. ER-Seq unterscheiden eine einzige Mutation aus 1 x 107 Wildtyp Nukleotide, wodurch es ein viel versprechendes Instrument, extrem niedrigen Frequenzen genetische Veränderungen zu erkennen und somit an einem Studium von Krankheit Heterogenicity sehr nützlich sein wird. Aufgrund der einzigartigen Sequenzierung Adapter Ligation ermöglicht diese Methode eine effiziente Rückgewinnung von CtDNA Molekülen, während zur gleichen Zeit Korrektur für Fehler bidirektional (Sense und Antisense). Unsere Auswahl an 1021 kb Sonden bereichert die Messung der Zielregionen, die decken mehr als 95 % der Tumor-bezogene Fahrer Mutationen in 12 Tumoren. Diese kostengünstige und universelle Methode ermöglicht eine einzigartig erfolgreiche Anhäufung von genetischen Daten. Nach effizient Herausfiltern von Hintergrund-Fehler, kann ER-Seq seltene Mutationen genau erkennen. Mit einer Fallstudie, präsentieren wir Ihnen ein detailliertes Protokoll zeigen Sonde Design, Bibliotheksbau und Ziel DNA-Aufnahme Methoden, während auch einschließlich des Daten-Analyse-Workflows. Zur Durchführung dieser Methode in der Regel dauert 1-2 Tage.

Die 1021 kb-Sonden angereicherten Zielregionen in ER-Seq verwendet Tabelle 1 siehe werden, umfasst mehr als 95 % von Genmutationen in 12 gemeinsamen Tumoren. Die große Auswahl an diese Sonden macht diesen Prozess für eine Mehrheit der Krebspatienten. Darüber hinaus ermöglichen unsere einzigartige Sequenzierung Adapter und Grundlinie Datenbank Screening, seltene Mutationen genau zu erkennen.
Auf...

Dieses Manuskript beschreibt ein Verfahren zum Nachweis von Mutationen von niedriger Frequenz in CtDNA, ER-seq. Diese Methode unterscheidet sich durch seine einzigartige Verwendung von zwei Richtungen Fehlerkorrektur, einen speziellen Hintergrund Filter und effiziente molekulare Aneignung.

Nachweis von seltenen Mutationen im CtDNA mit Next Generation Sequencing

The analysis of circulating tumor DNA (ctDNA) using next-generation sequencing (NGS) has become a valuable tool for the development of clinical oncology. ...

Das übergeordnete Ziel dieser Technik ist es, Mutationen mit geringer Häufigkeit in zirkulierender Tumor- oder ctDNA zu erkennen, um klinischen Ärzten ein leistungsfähiges Werkzeug zur Diagnose von Tumoren und zur Überwachung der Tumordynamik als Reaktion auf die Therapie an die Hand zu geben. Die Methode zum Testen von ctDNA kann dazu beitragen, wichtige Fragen darüber zu beantworten, welche Arten von Mutationen ein Patient trägt, wie z. B. Variation des Einzelnukleartyps, Insertion Deletion, Variation der Kopienzahl und strukturelle Variation. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die hohe Sensitivität und Spezifität, die einen präzisen Nachweis von niederfrequenten Mutationen in der ctDNA ermöglicht.Die Verfahren werden von Yuliang Yang, einem Techniker aus meinem Labor, vorgeführt. Ziehen Sie zunächst 10 Milliliter peripheres Blut in ein Sammelröhrchen und drehen Sie das Röhrchen vorsichtig sechs- bis achtmal auf und ab, um den Inhalt zu mischen. Lagern Sie Blutproben in den Entnahmeröhrchen bei sechs bis 37 Grad Celsius für bis zu 72 Stunden.Das Entnahmeröhrchen wird bei 1.600 g bei Raumtemperatur 10 Minuten lang zentrifugiert. Verwenden Sie dann eine Entsorgungspipette, um den

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Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

Wir beschreiben die Herstellung von mit Strichcode-DNA-Bibliotheken und die anschließende Hybridisierung Basis Exon Erfassung zur Erkennung von Schlüssel Krebs-assoziierten Mutationen in der klinischen Tumorproben von massiv parallelen Sequenzierung der "nächsten Generation". Gezielte Exon-Sequenzierung bietet die Vorteile der hohen Durchsatz, geringe Kosten, und tiefe Sequenzabdeckung, woraus sich eine hohe Empfindlichkeit zum Nachweis von Niederfrequenz-Mutationen.

Erkennen Somatische Genetische Veränderungen in Tumorproben von Exon-Abscheidung und-Massively Parallel Sequencing

Dieses Manuskript beschreibt klinische Protokolle für zwei Next-Generation-Sequencing-Panels. Ein Panel befasst sich mit hämatologischen Malignomen, während das andere Panel auf Gene abzielt, die in soliden Tumoren häufig mutiert sind. Die molekulare Klassifikation von Treibermutationen bei humanen Malignomen bietet wertvolle prognostische und prädiktive Informationen.

Next Generation Sequencing für den Nachweis von Mutationen umsetzbare in fester und flüssiger Tumoren

Ein integriertes System für die gezielte Next-Generation-Sequenzierung von onkologischen Proben wird beschrieben. Dieses plattformübergreifende System ist für Tumorbiopsien von geringer Qualität und geringen Mengen optimiert, ermöglicht geringe DNA-Eingaben, umfasst gut charakterisierte Mehrvariantenkontrollen und verfügt über einen neuartigen Variantenaufrufer, der auf quantitativen präanalytischen Qualitätskontrollmaßnahmen basiert.

Integration von Nass- und Trocken Bench Prozesse werden so optimiert Gezielte Next-Generation Sequenzierung von Low-Qualität und Low-Menge Tumorbiopsien

Die Wildtyp-Blocking-PCR mit anschließender direkter Sequenzierung bietet eine hochempfindliche Methode zum Nachweis von niederfrequenten somatischen Mutationen in einer Vielzahl von Probentypen.

Wildtyp-Blockierung PCR mit direkter Sequenzierung als hochempfindliche Methode Kombiniert zum Nachweis von Low-Frequency somatischer Mutationen

Das Manuskript beschreibt einen Chip-basierte digitale PCR-Assay zu erkennen, eine seltene CDH1 Transkript Variante (CDH1a) in Tiefkühlfrische normalen und Tumorgewebe von Patienten mit Magenkrebs erhalten.

Erkennung einer CDH1 selten Transkript Variante in Tiefkühlfrische Magenkrebs Geweben durch Chip-basierte digitale PCR

Next Generation Sequencing (NGS) ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die genomische Charakterisierung, die durch die hohe Fehlerquote der Plattform (~0.5–2.0%) begrenzt ist. Wir beschreiben unsere Methoden zur Sequenzierung Fehler korrigiert, mit denen wir umgehen die NGS Fehlerquote und erkennen Mutationen bei Variante Allel Brüche so selten wie 0,0001.

Seltenes Ereigniserkennung mit Fehler korrigiert DNA und RNA Sequenzierung

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um mehrere genetische Veränderungen der Zielregion in einer einzelnen Reaktion mit Drop-off-DdPCR und ein einzigartiges paar Hydrolyse Sonden genau zu quantifizieren.

Einzelne Tropfen digitale Polymerase-Kettenreaktion für umfassende und gleichzeitigen Nachweis von Mutationen im Hotspot-Regionen

Hier stellen wir ein Protokoll zum Nachweis von tumorsomatischen Mutationen in zirkulierender DNA in biologischen Flüssigkeiten (Biofluide) vor. Unsere Droplet-Methode zur digitalen Polymerase-Kettenreaktion (dPCR) ermöglicht die Quantifizierung der Tumormutations-Allelfrequenz (MAF) und ermöglicht eine minimalinvasive Ergänzung zur Diagnose und zeitlichen Überwachung der Tumorreaktion.

Nachweis und Überwachung von tumorassoziierter zirkulierender DNA in Biofluiden von Patienten

Hier wird das sgRNA/CAS9-Endonuklease- und Next-Generation-Sequenzierungsprotokoll vorgestellt, das verwendet werden kann, um die Mutationen zu identifizieren, die mit der Reparatur von Doppelstrangbrüchen in der Nähe des CD4-Promotors verbunden sind.

Verwendung der Next-Generation-Sequenzierung zur Identifizierung von Mutationen, die mit der Reparatur eines CAS9-induzierten Doppelstrangbruchs in der Nähe des CD4-Promotors verbunden sind

Dieses Protokoll beschreibt einen automatisierten, ISO15189-akkreditierten Next-Generation-Sequencing-Workflow zum Nachweis zielgerichteter genomischer Veränderungen in formalinfixierten, paraffineingebetteten Geweben des nicht-kleinzelligen Lungenkrebses (NSCLC).

Nachweis zielgerichteter Veränderungen bei nicht-kleinzelligem Lungenkrebs mittels Next-Generation-Sequencing

Erfahren Sie die ER-Seq-Methode zum Nachweis seltener Mutationen in ctDNA für die Onkologie. Diese Technik mit bidirektionaler Fehlerkorrektur bietet hohe Sensitivität und Spezifität für präzise klinische Diagnostik.

Nachweis von seltenen Mutationen im CtDNA mit Next Generation Sequencing

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