Nachweis von seltenen Mutationen im CtDNA mit Next Generation Sequencing

Das übergeordnete Ziel dieser Technik ist es, Mutationen mit geringer Häufigkeit in zirkulierender Tumor- oder ctDNA zu erkennen, um klinischen Ärzten ein leistungsfähiges Werkzeug zur Diagnose von Tumoren und zur Überwachung der Tumordynamik als Reaktion auf die Therapie an die Hand zu geben. Die Methode zum Testen von ctDNA kann dazu beitragen, wichtige Fragen darüber zu beantworten, welche Arten von Mutationen ein Patient trägt, wie z. B. Variation des Einzelnukleartyps, Insertion Deletion, Variation der Kopienzahl und strukturelle Variation. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die hohe Sensitivität und Spezifität, die einen präzisen Nachweis von niederfrequenten Mutationen in der ctDNA ermöglicht.

Verfahren werden von Yuliang Yang, einem Techniker aus meinem Labor, vorgeführt. Ziehen Sie zunächst 10 Milliliter peripheres Blut in ein Sammelröhrchen und drehen Sie das Röhrchen vorsichtig sechs- bis achtmal auf und ab, um den Inhalt zu mischen. Lagern Sie Blutproben in den Entnahmeröhrchen bei sechs bis 37 Grad Celsius für bis zu 72 Stunden.

Das Entnahmeröhrchen wird bei 1.600 g bei Raumtemperatur 10 Minuten lang zentrifugiert. Verwenden Sie dann eine Entsorgungspipette, um den Überstand oder das Plasma aus dem Röhrchen in vier saubere, zwei Milliliter entsprechend beschriftete Zentrifugenröhrchen zu übertragen, ohne das Pellet zu stören. Verwenden Sie eine saubere Entsorgungspipette, um einen Milliliter der Zellen in ein zwei Milliliter entsprechend beschriftetes Zentrifugenröhrchen zu überführen.

Lagern Sie die Zellen bei minus 20 Grad Celsius oder kälter, bevor Sie sie genomisch oder gDNA-isolieren. Als nächstes zentrifugieren Sie das Plasma bei 1.600 mal g bei vier Grad Celsius für 10 Minuten. Übertragen Sie dann das Plasma in saubere Zentrifugenröhrchen, die ordnungsgemäß als Plasma gekennzeichnet sind, und lassen Sie etwa 0,1 Milliliter Restvolumen am Boden, um eine Kontamination zu vermeiden.

Der Buffy Coat sollte während des Trennprozesses aus dem Plasma vermieden werden. Andernfalls können große DNA-Fragmente, die aus den Zellen extrahiert werden, die ctDNA verdünnen und die Empfindlichkeit des Tests beeinträchtigen. Isolieren Sie mit einem im Handel erhältlichen Kit cfDNA aus drei Millilitern des gesammelten Plasmas gemäß den Anweisungen des Herstellers.

Isolieren Sie dann auch mit einem Kit gDNA aus 200 Mikrolitern weißer Blutkörperchen gemäß den Anweisungen des Herstellers. Um die gDNA-Kontrollprobe durch Ultraschall zu fragmentieren, wird ein Mikrogramm der gDNA-Probe in 100 Mikrolitern Tris-EDTA-Puffer in einem sauberen Beschallungsröhrchen vorbereitet. Stellen Sie das Beschallungsprogramm für 12 Zyklen für insgesamt 12 Minuten auf 30 Sekunden ein und 30 Sekunden aus.

Nachdem Sie bestätigt haben, dass das Produkt 200 bis 250 Basenpaarfragmente enthält, übertragen Sie alle Fragmentierungsprodukte in ein neues 1,5-Milliliter-Röhrchen mit 150 Mikrolitern magnetischen Kügelchen und inkubieren Sie die Probe fünf Minuten lang, um die richtigen Fragmente auszuwählen. Legen Sie dann das Röhrchen für 30 Sekunden auf ein Magnetgestell und entfernen Sie den Überstand. Während Sie die Tube auf dem Gestell lassen, fügen Sie 200 Mikroliter frisch zubereitetes 80%iges Ethanol hinzu, um die Kügelchen zu waschen.

Inkubieren Sie die Kügelchen 30 Sekunden lang, bevor Sie den Überstand entfernen und den Waschgang wiederholen. Lassen Sie die Tube mit offenem Deckel auf dem Rost, um die Perlen an der Luft trocknen zu lassen. Dann eluieren Sie die DNA-Fragmente, indem Sie den Kügelchen 32 Mikroliter 10 millimolare Tris-HCL hinzufügen.

Um die Endvorbereitungsreaktion gemäß den Anweisungen des Herstellers durchzuführen, werden in ein steriles nukleasefreies Röhrchen sieben Mikroliter Reaktionspuffer, drei Mikroliter der Enzymmischung, 30 Nanogramm cfDNA und doppelt destilliertes Wasser für ein Gesamtvolumen von 60 Mikrolitern gegeben. Geben Sie in ein separates Röhrchen die gleichen Komponenten, jedoch mit einem Mikrogramm gDNA anstelle von cfDNA. Inkubieren Sie die Mischung in einem Thermocycler bei 20 Grad Celsius für 30 Minuten, gefolgt von 65 Grad Celsius für 30 Minuten, ohne dass der Deckel erhitzt wird.

Unmittelbar nach der Inkubation geben Sie 30 Mikroliter des Ligations-Mastermixes, einen Mikroliter des Ligationsverstärkers und vier Mikroliter des einzigartigen Sequenzieradapters in das Röhrchen. Inkubieren Sie die Reaktion im Thermocycler bei 20 Grad Celsius für 15 Minuten, ohne dass der Deckel erhitzt wird. Vortex, um die magnetischen Kügelchen wieder aufzuwirbeln, und lassen Sie die Kügelchen mindestens 30 Minuten lang bei Raumtemperatur.

Geben Sie dann 87 Mikroliter der resuspendierten magnetischen Kügelchen zur Ligationsreaktion. Mischen Sie gut, indem Sie auf und ab pipettieren und die Probe dann fünf Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren. Nach dem Waschen und Lufttrocknen der Kügelchen eluieren Sie das DNA-Ziel aus den Kügelchen, indem Sie 20 Mikroliter 10 millimolare Tris-HCL hinzufügen.

Fügen Sie 20 Mikroliter ligierte DNA-Fragmente, fünf Mikroliter Indexprimer i7, 25 Mikroliter Bibliotheksamplifikations-Mastermix und doppelt destilliertes Wasser bis zu einem Gesamtvolumen von 50 Mikrolitern hinzu. PCR-Amplifikation der Adapter-ligierten cfDNA oder gDNA. Fügen Sie dann 45 Mikroliter suspendierte magnetische Kügelchen zur PCR-angereicherten DNA hinzu.

Mischen Sie die Probe, indem Sie sie auf und ab pipettieren und fünf Minuten lang inkubieren. Nach dem Entfernen des Überstands und dem Waschen der Kügelchen verwenden Sie 30 Mikroliter 10 millimolare Tris-HCL, um die DNA-Fragmente mit Adaptern zu eluieren. Um eine gezielte DNA-Erfassung durchzuführen, blockieren Sie die Probe in einem sterilen Röhrchen, indem Sie 1,5 Mikrogramm Pooling-Bibliotheken, jeweils acht Mikroliter P5-Block 100P und P7-Block 100P und fünf Mikroliter von einem Mikrogramm pro Mikroliter einer DNA hinzufügen.

Trocknen Sie den Inhalt des Röhrchens mit einem auf 60 Grad Celsius eingestellten Vakuumkonzentrator. Hybridisieren Sie die DNA-Capture-Sonden mit der Bibliothek, indem Sie 8,5 Mikroliter 2X-Hybridisierungspuffer, 2,7 Mikroliter Hybridisierungsverstärker und 1,8 Mikroliter nukleasefreies, doppelt destilliertes Wasser hinzufügen. Mischen Sie durch Auf- und Abpipettieren und inkubieren Sie im Thermomischer bei 95 Grad Celsius für 10 Minuten.

Fügen Sie dann sofort vier Mikroliter der benutzerdefinierten Sonde hinzu. Inkubieren Sie die Proben in einem Thermomischer bei 65 Grad Celsius, wobei der Deckel vier Stunden lang auf 75 Grad Celsius erhitzt wird. Inkubieren Sie die hybridisierte Ziel-DNA mit Streptavidin-Kügelchen und waschen Sie die Kügelchen, um ungebundene DNA zu entfernen.

Verwenden Sie das handelsübliche Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers, um die letzten 20 Mikroliter resuspendierter Kügelchen mit eingefangenen DNA-Fragmenten zu erhalten. Der Waschschritt von ungebundener DNA aus Streptavidin-Kügelchen sollte schnell sein. Andernfalls könnte die Abscheidungseffizienz der Ziel-DNA beeinträchtigt werden.

Amplifizieren Sie die eingefangenen DNA-Fragmente, indem Sie eine PCR mit einem kommerziellen Kit mit zwei mikromolaren Rückgrat-Oligonukleotiden gemäß den Anweisungen des Herstellers durchführen. Fügen Sie schließlich 45 Mikroliter suspendierter Kügelchen direkt zum PCR-Produkt hinzu und reichern Sie die amplifizierten Ziel-DNA-Fragmente, die durch Elution an die Kügelchen gebunden sind, mit 30 Mikrolitern 10 millimolare Tris-HCL an. Quantifizieren Sie die Fragmente und führen Sie die Sequenzierung und Datenanalyse gemäß dem Textprotokoll durch.

Diese Tabelle zeigt, wie ER-seq die Abdeckungstiefe im Vergleich zur herkömmlichen Methode um 23 % verbessert. Dies ist auf die effiziente Rückgewinnung von cfDNA-Molekülen zurückzuführen, die die Analyse seltener Mutationen erheblich verbessert. Es ist auch klar, dass die einzigartigen Sequenzieradapter, die in ER-seq verwendet werden, eine einfache Unterscheidung von natürlichen und PCR-induzierten Duplikaten ermöglichen.

Wie in dieser Tabelle zu den Aufrufergebnissen beschrieben, war die Analyse auf der Grundlage von ER-seq zu 100 % konsistent für die EGFR pL858R-Detektion und die Häufigkeit der Detektion war im Vergleich zu einer herkömmlichen Analyse etwas höher. Wichtig ist, dass die ER-seq-Analyse den Nachweis anderer relativ niederfrequenter Mutationen ermöglichte, einschließlich EGFR pT790M, das von der herkömmlichen Analyse aufgrund des hohen Hintergrundrauschens nicht erkannt wurde. Einmal gemeistert, kann diese Technik in 48 Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, den Verlust einer sehr geringen Menge an cfDNA während der Extraktion, der Bibliotheksvorbereitung und der Bead-Wash nach der Hybridisierung zu vermeiden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie ctDNA von Patienten gesammelt, vorbereitet und gezielt auf der Grundlage von eindeutig für die Sequenzierung identifiziert wurde. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für die Forscher auf dem Gebiet der Flüssigbiopsie, um bessere Praktiken bei der Entscheidungsfindung in der Klinik zu erforschen.