Name: Masse isoliert und In-vitro- Kultivierung von Intramolluscan Stadien der menschlichen Blut Fluke Schistosoma Mansoni (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 5 s
Description: Erfahren Sie die Massenisolierung und In-vitro-Kultivierung von Schistosoma mansoni-Mirazidien. Dieses Protokoll ermöglicht Forschern die Untersuchung der Biologie des Blutegels zur Bekämpfung der Schistosomiasis.

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NIH Grant RO1AI015503 finanziert teilweise. Schistosome-infizierten Mäusen lieferten die NIAID Schistosomiasis Resource Center unter Biomedical Research Institute (Rockville, MD) durch NIH-NIAID Vertrag HHSN272201000005I für den Vertrieb über BEI Ressourcen.

Alle Tierpflege und experimentelle Verfahren wurden durch die institutionelle Tier Pflege und Verwendung Ausschuss der University of Wisconsin-Madison unter Protokoll genehmigt keine. V005717. Das folgende Protokoll beinhaltet Arbeiten in einer Einrichtung Biosafety Level 2 (BSL2) für menschliche Krankheitserreger, obwohl keiner der schistosome-Stufen dargestellt, die in diesem Protokoll ansteckend für Menschen oder andere Säugetiere sind. Institutionellen Richtlinien für den Umgang mit Risiko-Gruppe 2 (RG2) menschliche Krankheitserreger zu folgen.
Hinweis: Wir verwenden weibliche Swiss-Webster Mäuse (6 - Wochen alten) aufgrund ihrer höheren Anfälligkeit zur Infektion10, damit größere Ei Belastungen nachgeben. Tucker Et Al. beschreiben die Maus und Schnecke Infektion Protokolle in diesem Modell System11verwendet. Die Tabelle der Materialien zeigt eine Liste aller spezifischen Ausrüstung, Materialien, Reagenzien und tierischen Quellen, die zur Durchführung dieser experimentellen Protokolls.
1. Verarbeitung von infizierten Leber
<ol><li>Einschläfern Sie Mäuse, 6-7 Wochen nach der Infektion, durch CO2 ersticken (Rate von 10-30 % von dem Kammervolumen pro Minute). Mäuse für die Einstellung der Atmung und Herzschlag zu überwachen. Hinweis: In der Regel können bis zu 20 Mäuse zu einem bestimmten Zeitpunkt verarbeitet werden.</li>
	<li>Legen Sie nach der Übertragung euthanasierten Mäuse auf eine biologische Kabinett Mäuse auf den Rücken und sprühen Sie ihre ventralen Flächen mit 70 % Ethanol. 1 min. einwirken lassen.</li>
	<li>Kneifen und ziehen Sie die Haut des Unterleibs und quer durch die Basis der eingeklemmten Haut am nächsten an den Bauch mit sterilen Chirurgische Scheren. Ziehen Sie die geschnittenen Haut anterior (d. h. in Richtung zum Kopf), die Leber zu offenbaren. Beachten Sie, dass die Leber sollte vergrößert und durch eine Ei-induzierte granulomatöse Reaktion (Abbildung 2A gesprenkelt).</li>
	<li>Entfernen Sie die Leber und legen Sie sie in einen Becher mit 200 mL sterile 1,2 % NaCl-Lösung mit Pen/Strep.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 1.3 und 1.4 mit verbleibenden Mäuse. Hinweis: Zwanzig Mäuse sind in der Regel in einer einzigen Ernte verarbeitet.</li>
	<li>Die Leber in eine sterile Petrischale und entfernen Sie-Leber Fett/Bindegewebe mit der sterilen Pinzette.</li>
	<li>Auf eine sterile 250-mL-Zentrifuge-Flasche mit ~ 200 mL sterile 1,2 % NaCl-Lösung mit Pen/Strep getrimmt/gereinigt Lebern übertragen.</li>
	<li>Kräftig schütteln Sie die Flasche mit der Leber, und mit einer sterilen Einweg-Pipette, entfernen Sie die überschüssige Oberfläche Schaum/Treibgut. Langsam die restliche Salzlösung in ein Gefäß abgießen oder Waschbecken mit 1 % Bleichmittel (Desinfektionsmittel).</li>
	<li>Die Lebern ~ 200 mL frische Kochsalzlösung hinzu, und wiederholen Sie Schritt 1,8 noch dreimal.</li>
</ol>2. Leber Extraktion und Miracidial isolation
<ol><li>Legen Sie die Leber in einer kleinen sterilen Edelstahl-Mixbecher und ~ 2 mL 1,2 % NaCl-Lösung (Abb. 2 b).</li>
	<li>Decken Sie die Tasse mit Folie und einer Petrischale zur Verhinderung von Verschmutzungen und Mischung für 1 min durch den Wechsel von niedriger und hoher Geschwindigkeit (20 s niedrige Geschwindigkeit/10 s high-Speed, Wiederholung) (Abbildung 2).</li>
	<li>Verteilen Sie gleichmäßig die kombinierte Leber Aussetzung in sterilen 250-mL-Zentrifuge Flaschen (für 20 Lebern 4 Flaschen verwenden).</li>
	<li>~ 200 mL Gesamt Volumen/Flasche sterile Kochsalzlösung mit Antibiotika hinzufügen. Gewicht/Balance Flaschen vor der Zentrifugation.</li>
	<li>Zentrifuge gemischt Leber bei 290 X g für 15 min bei 4 oC. sanft aus Überstände in einen Behälter mit Bleichmittel vor der Entsorgung zu gießen.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 2,4-2,5 einmal. Achten Sie darauf, gründlich vor Zentrifugation Leber Sediment aufzuwirbeln.</li>
	<li>Nach verwerfen die letzten Kochsalzlösung waschen Sie (Schritt 2,6), gebeizte Lebergewebe, schütteln Sediment aufzuwirbeln und übertragen die Aufhängung in eine sterilisierte 1 L volumetrischen Kolben, der komplett mit Aluminium abgedeckt wurde fügen 200 mL sterilem Teichwasser mit Pen/Strep hinzu Folie, mit Ausnahme der Spitze 3 cm des Halses (Abb. 2D). Hinweis: Verwenden Sie zwei Flaschen (= 10 Lebern) pro 1-L-Flasche. Teichwasser simuliert die natürliche Süßwassersee Umgebung musste Miracidial schlüpfen aus den Eiern zu stimulieren.</li>
	<li>Mit sterilem Teichwasser, füllen Sie die Flasche um ca. 3 cm oberhalb der Folie abdecken am Hals. Dann, ohne Verzögerung (wie Miracidia in Kürze beginnen zu schlüpfen), restliche Schaum und Lebergewebe schwimmend an der Oberfläche durch schnell Pipettieren bis ~ 12 mL Teichwasser mit Schutt entfernen und verwerfen es in einem separaten Rohr zu verwerfen. Ersetzen Sie durch frische sterile Teichwasser.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Reinigung Schritt 2.8, drei weitere Zeiten, Überprüfung auf Vorhandensein eines Miracidia in der Röhre verwerfen. Einzustellen Sie Wiederholung der Reinigung Schritt erscheint Miracidia in der Waschlösung.</li>
	<li>Fügen Sie nach der letzten Wäsche hinzu, langsam ~ 12 mL warmen sterilem Teichwasser (30 oC vorgewärmt) um ein Temperaturgradient mit sauberem, sterile warmes Wasser an der Spitze zu schaffen. Hinweis: Dies geschieht am besten durch langsam entladen Wasser entlang der Seite des Halses Fläschchen mischen zu vermeiden.</li>
	<li>Legen Sie eine kleine Petrischale Abdeckung über der Öffnung der Flasche und strahlen ein helles Licht am oberen Rand der Flasche über die Folienabdeckung, die Oberfläche des Wassers zu beleuchten. Hinweis: In der Regel innerhalb von 5-10 Minuten, Schwimmen Miracidia, angezogen, das Licht in großer Zahl innerhalb der ersten 2-3 cm Teichwasser (Abbildung 3A) konzentrieren.</li>
</ol>3. Miracidial Ernte und Anbau
<ol><li>Wenn Miracidia haben nach 10 min an der Oberfläche gesammelt, mit einer sterilen Transferpipette ~ 8 mL Teichwasser und Transfer in einem sterilen Zentrifugenröhrchen 15 mL entfernen. Legen Sie die Röhrchen mit Miracidia auf Eis.</li>
	<li>Zurück 8 mL warmen sterilem Teichwasser entlang der Innenseite der volumetrischen Küvette hinzufügen und weitere 10 Minuten warten.</li>
	<li>Mit neuen Röhren jedes Mal, wiederholen Sie die Schritte 3.1 und 3.2 noch dreimal. Halten Sie nach der 4th -Sammlung das letzte Rohr auf Eis für 10 min erlauben die Miracidia zu begleichen. Dieser Satz von Rohren umfasst die erste Ernte.</li>
	<li>Zentrifugen-Röhrchen mit Miracidia 290 X g für 1 min bei 4 oC in einer vorgekühlten gekühlten Zentrifuge.</li>
	<li>Umgehend entfernen Sie die meisten des Überstands (~ 7 mL) darauf achten, nicht zu stören das Parasiten-Pellet (Abb. 3 b).</li>
	<li>Pool der Miracidia aus dieser ersten Ernte zu einem Rohr, dann spülen Sie alle der ursprünglichen Rohre mit ~ 1 mL sterilem Teichwasser und hinzufügen "gepoolte" Rohr.</li>
	<li>Können Parasiten für ~ 5 min auf Eis zu begleichen, und erneut Zentrifugieren der Parasiten bei 290 X g für 1 min bei 4 oC.</li>
	<li>Sorgfältig entfernen Sie den Überstand zu und fügen Sie 6-8 mL sterile Chernin Salzlösung (CBSS +; siehe Tabelle of Materials) enthaltenden Pen/Strep ausgeglichen.</li>
	<li>Auszusetzen Sie die Miracidia und aliquoten folgte ihnen in eine Kultur 24-Well-Platte (1 mL pro Well), indem das Rohr in 6-8 mL CBSS + Spülung und 1 mL Spülen in jede Vertiefung sanft. Parasiten bei 26 oC unter inklusieve Bedingungen auszubrüten. Konzentrationen von isolierten Miracidia schwankt, aber werden in der Regel durchschnittlich ~ 7000/mL.</li>
	<li>Wenn Parasiten noch auf die Lichtquelle konzentrieren, wiederholen Sie die Schritte 3.1 bis 3.9 weiterhin Ernte spät-Schlupf Miracidia aber erhöhen Sie das Zeitintervall zwischen Sammlungen auf 15-20 min zu. Hinweis: Diese neue Reihe von Röhren steht die zweite Ernte. Jedoch weil die Miracidial Zahlen in der Regel niedrig sind, sind Larven aus allen Rohren in der Regel in einer einzigen Kultur gut mit 2 mL CBSS + gebündelt.</li>
	<li>24 h nach der Ernte und Anbau Aufschwemmen Sie sanft Sporocysts in den Brunnen durch pipettieren.</li>
	<li>Warten Sie ein paar Minuten um Parasiten, sich an der Unterseite der Brunnen zu ermöglichen. Sobald sie sich niedergelassen haben, entfernen Sie vorsichtig den überstand (~1.5 mL), enthalten die meisten der Nasenfunktion epidermalen Platten Schuppen von Miracidia während der larvalen Transformation. Diese "Verwandlung" überstand kann entweder verworfen oder in Folgestudien Larven sekretorischen Produkte integriert.</li>
	<li>Jeder Brunnen und sanft Pipette zum Sporocysts Aufschwemmen fügen Sie 1,5 mL frische CBSS hinzu +. Wiederholen Sie Schritt 3.12, wenn weitere waschen oder Umstellung auf ein anderes Medium gewünscht wird.</li>
</ol>

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</ol>

Autoren haben nichts preisgeben.

Miracidia von S. Mansoni, isoliert und manipuliert, wie hier beschrieben nur die Schnecke Zwischenwirt infizieren können und daher repräsentieren keine menschliche Biohazard während dieser Phase der Larvalentwicklung. Jedoch um versehentliche Belichtung/Infektion der Schnecken zu vermeiden, sollte darauf geachtet werden, Miracidial Isolationen an einem anderen Ort aus ausführen wo anfällig Biomphalaria Schneckenarten anwesend oder gepflegt werden können. Ein separater Raum, registriert als BSL2 Raum, wi...

Das menschliche Blut Egel Schistosoma spp., sind die Erreger der Schistosomiasis, eine vernachlässigte tropische Krankheiten leidet schätzungsweise 230 Millionen Menschen weltweit1. Die am weitesten verbreitete Art, Schistosoma Mansoniist in Südamerika, des karibischen Archipels, Nahost und Afrika südlich der Sahara in Afrika2geografisch verteilt. Der Lebenszyklus von S. Mansoniund andere Schistosomen ist komplex, mit einem Säugetier Definitive Host und Süßwasserschnecken der Gattung Biomphalaria , die als obligate Zwischenwirte dienen.
S. Mansoni männlichen und weiblichen Erwachsenen Wurm Paare Leben in den hinteren mesenterialen Adern der Säugetier-Wirt reproduzieren, was die Auflösung von embryonierten Eiern (Ova), die in die kleinen Venolen der Darmschleimhaut eingereicht werden. Eiern dann durchbricht die Gefäßwände durch Schleimhaut Wandern, und schließlich geben Sie das Darmlumen, wo sie mit dem Kot storniert werden. Bei Ova Süßwasser und freischwimmenden Larven (Miracidia) schlüpfen müssen, sie in kurzer Zeit eine geeignete Biomphalaria Schnecke zu infizieren, um seinen Lebenszyklus weiter vorkommen. Dieser Infektionsprozess beinhaltet Miracidial Bindung an die Schnecke äußeren Körperoberfläche gefolgt von aktiven eindringen und Eindringen von der Larve in den Host. Bald nach Eintritt beginnt das Miracidium, die Außenlamellen ciliated epidermalen Schuppen, wie es ein Syncytium bildet, die die neue äußere Oberfläche (Schale) des nächsten Larvenstadium, die primäre oder Mutter Sporocyst werden. Durch Ungeschlechtliche Fortpflanzung jede primäre Sporocyst produziert und veröffentlicht eine zweite Generation von Sporocysts, als sekundäre oder Tochter Sporocysts, die wiederum erzeugen und lösen zahlreicher intramolluscan Endphase der Cercaria3 . Bei der Flucht aus der Schnecke Host können Nautiliden Cercariae zuweisen und direkt die Haut eines Menschen oder andere geeignete Säugetier-Hosts durchdringt. Bei der Einreise in ihren neuen Wirt Cercariae auf die parasitären Schistosomula Bühne verwandeln und dringen in das Gefäßsystem. Sie migrieren wiederum an der Lunge und dann an die Lebervene wo sie Reifen zu Erwachsenen Würmer, männliche und weibliche Paare bilden und Reisen zu den mesenterialen Adern um ihren Lebenszyklus zu vervollständigen.
Erfolgreiche intramolluscan oder "Schnecke-Phase" Entwicklung der Larven Schistosomen unbedingt Fortsetzung des Zyklus des menschlichen Host-to-Host-Übertragung. Von entscheidender Bedeutung ist die folgende Posten von der freischwimmenden Miracidium in der Schnecke Host und seine frühen Transformation auf die primäre Sporocyst-Bühne. Abhängig von den physiologischen und immunologischen Kompatibilität zwischen Wirt und Parasit ist es in dieser Phase der Larvalentwicklung dieser anfänglichen Erfolg oder Misserfolg zu Infektionen ist bestimmt4,5,6 . Nachfolgende Entwicklung der primären Sporocysts asexuell produzieren sekundäre Sporocysts, die dann Menschen infektiöse Cercariae erzeugen, weitere erfordern eine permissive physiologischen Host-Umgebung, die für alle der Parasit Wachstum bereitstellt und reproduktive braucht.
Bisher ist wenig bekannt über die zugrunde liegenden, physiologische, biochemische und molekulare Prozesse schistosome-Schnecke Interaktionen, vor allem die Moleküle und Wege beteiligt zur Regelung der Larvalentwicklung und Reproduktion oder Modulation Host-Immunantworten. Zugriff auf eine große Anzahl dieser Larvenstadien unter in-vitro- Kulturbedingungen, die experimentelle Manipulation zulassen würde erheblich erleichtern die Entdeckung des entwicklungspolitischen Wege und zugrunde liegenden Mechanismen des Zellwachstums, Differenzierung und Reproduktion. Kritischen Parasit Wege oder Mechanismen, identifiziert durch in-vitro- Experimente, könnte dann Larven Wachstum/Reproduktion in der Schnecke Host zu stören oder Schnecke Host Abwehrmechanismen beteiligt Erkennung und Beseitigung von identifizieren verwendet werden Miracidial oder Sporocyst Stufen.
In diesem Artikel und video-Präsentation bieten wir eine detaillierte Beschreibung einer Methode zur Isolierung von freischwimmenden S. Mansoni zahlreicher Miracidia für Einführung in in-vitro- Kultur, die dann mit weiteren experimentellen ausgesetzt sein könnten Manipulation (siehe Abbildung 1 eine schematische Übersicht über die Protokoll-Workflow). Obwohl ähnliche Verfahren beschrieben wurden bisher7,8,9, fühlten wir, dass ein detailliertes Protokoll sinnvoll, Forscher, die dieses Modell wäre, um noch offene Fragen im Zusammenhang mit Adresse beschäftigen wollen intramolluscan Larvalentwicklung, Zellproliferation und schistosome-Schnecke immun Interaktionen. Darüber hinaus könnte dieser Ansatz für die Isolierung von Eiern aus anderen medizinisch wichtigen Trematoden wie Blase-Wohnung S. Haematobium, Leberegel oder Lunge Egel leicht angepasst werden.

<table><tbody><tr><td>Chernin's balanced salt solution (CBSS+)</td><td></td><td></td><td>Für 1 l Lösung</stark</td></tr><tr><td>>2,8 g Natriumchlorid</td><td>Fisher</td><td>Scientific S271-3</td><td>Salze auflösen, ausgenommen Calciumchlorid, und&nbsp;</td></tr><tr><td>0,15 g Kaliumchlorid&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5405</td><td>Zucker in 800 mL ddH2O</td></tr><tr><td>0,07 g Natriumphosphat, zweibasisch wasserfrei</td><td>Fisher</td><td>Scientific S374-500</td><td>Calciumchlorid separat in 200&nbsp;</td></tr><tr><td>0,45 g Magnesiumsulfat-Heptahydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1880</td><td>mL ddH2O</td></tr><tr><td>0,53 g Calciumchlorid-Dihydrat</td><td>Mallinckrodt</td><td>4160</td><td>Langsam Calciumsoln zum Salz-/Zuckersoln geben mit&nbsp;</td></tr><tr><td>0,05 g Natriumbikarbonat &nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233-3</td><td>mit konstantem Mischen</td></tr><tr><td>1 g Glukose</td><td>MP Biomedicals</td><td>152527</td><td>Auf pH 7,2 einstellen und mit einem Filter sterilisieren;</td></tr><tr><td>1 g Trehalose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0167</td><td>0,22 & Mikro; m Einweg-Flaschenfilter</td></tr><tr><td>10 mL 100X Penicillin/Streptomycin</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td>Fügen Sie gefiltertes Penicillin und Streptomycin Soln&nbsp; Vorverwendung</td></tr><tr><td><stark>unvollständig Bge&nbsp; Medium (Ibge)</stark></td><td></td><td></td><td><stark>Für 900 mL Lösung</stark></td></tr><tr><td>220 mL Schneider" s Drosophila medium modifiziert</td><td>Lonza</td><td>04-351Q</td><td>Schneider's Medium mit 680 mL ddH2O</td></tr><tr><td>4,5 g enzymatisches Lactalbumin-Hydrolysat</td><td>mischen Sigma-Aldrich</td><td>L9010</td><td>Lactalbumin-Hydrolysat und Galaktose</td></tr><tr><td>1,3 g Galaktose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G0625</td> Auf <td>pH 7,2 einstellen und filtrieren Sterilisieren mit einem 0,22 &μ; m vorsterilisierter Einwegfilter mit Flaschenaufsatz</td></tr><tr><td>Complete Bge-Medium (cBge)</td><td></td><td></td><td>Für 100 mL Lösung</stark</td></tr><tr><td>>90 mL Unvollständiges Bge-Medium</td><td></td><td></td><td>Zur Hitzeinaktivierung von FBS: Inkubieren Sie aufgetautes FBS in&nbsp;</td></tr><tr><td>9 mL fötales Rinderserum (FBS) (Optima)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S12450</td><td>Wasserbad bei 60°; C für 1 Std., während sanft&nbsp;</td></tr><tr><td>1 mL 100X Penicillin/Streptomycin</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td>Schwenken der Flasche alle 10 min Aliquot hitzeinaktiviertes FBS in 15-ml-Röhrchen&nbsp; und lagern bei -20°C.&nbsp; Mischen Sie Medium + FBS und Filter, sterilisieren Sie mit einem 0,22 & Mikro; m vorsterilisiert&nbsp; Einweg-Flaschenaufsatzfilter&nbsp; Vor Gebrauch Penicillin und Streptomycin zugeben</td></tr><tr><td><stark>Teichwasser (Stammlösung)</stark></td><td></td><td></td><td><stark>1 l Stammlösung</stark</td></tr><tr><td>>12,5 g Calciumcarbonat</td><td>Fisher Scientific</td><td>C64-500</td><td>Alle Salze in 1 l ddH2O</td></tr><tr><td>mischen 1,25 g Magnesiumcarbonat</td><td>Fisher Scientific</td><td>M27-500</td><td>Beachten Sie, dass die Salze nicht vollständig&nbsp;</td></tr><tr><td>1,25 g&nbsp; Natriumchlorid</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-3</td><td>gelöst.&nbsp; Kräftig schütteln, bis es suspendiert ist&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>0,25 g&nbsp; Kaliumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5405</td><td>Salze vor der Herstellung der Arbeitslösung&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td><stark>Teichwasser (Arbeitslösung)</stark><</td><td></td><td></td><td>stark>1,5 l Lösung</stark></td></tr><tr><td>0,8 ml Stammlösung Teichwasser (vor Gebrauch schütteln) in&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td></td><td></td><td>Mischen Sie das Material mit ddH2O</td></tr><tr><td>1500 mL ddH2O</td><td></td><td></td><td>Sterilisieren Sie das Teichwasser durch Autoklavieren (langsam&nbsp; Zyklus)</td></tr><tr><td>1,5 ml 100X Penicillin/Streptomycin&nbsp;</td><td></td><td>Hyclone SV30010</td><td>Fügen Sie Penicillin und Streptomycin zu</td></tr><tr><td><stark>Kochsalzlösung (1,2 % NaCl)</stark></td><td></td><td></td><td><stark>1,5 l Lösung</stark</td></tr><tr><td>>18 g Natriumchlorid in 1500 ml ddH2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-3</td><td>Autoklaven-Kochsalzlösung hinzu, um</td></tr><tr><td>1,5 ml 100-fache Penicillin/Streptomycin-Hyclone-SV30010</td><td></td><td></td> <td>zu sterilisierenFügen Sie Penicillin und Streptomycin vor Gebrauch hinzu</td></tr><tr><td><stark>Zusätzliche Ausrüstung und Material:&nbsp; </td>7-L Maus-Euthanasiekammer Gemäß dem genehmigten IACUC-Protokoll <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Nr. V001551</td>Mäuse Taconic Biosciences Swiss-Webster, weiblich, 6 Wochen alt, Maus&nbsp;<td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> &nbsp;</td></tr><tr><td>CO2Tank und Regler</td><td></td><td></td><td>pathogenfreie</td></tr><tr><td>24-Well-Gewebekulturplatte</td><td>TPP</td><td>92424</td><td></td></tr><tr><td>1-L-Messkolben</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lichtquelle (150 W)</td><td>Chiu Tech Corp</td><td>Modell F0-150</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge, gekühlt, schwingender Eimer</td><td>Eppendorf</td><td>Modell 5810R</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge Flaschen (250 ml)</td><td>Nalgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15-ml-Zentrifugenröhrchen, steril</td><td>Corning</td><td>430053</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Einweg-Transferpipetten&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>Scientific 1371120</td><td></td></tr><tr><td>0,22 &Mikro; m vorsterilisierter Einweg-Flaschenaufsatzfilter&nbsp;</td><td>EMD Millipore</td><td>SCGPS05RE</td><td></td></tr><tr><td>Edelstahl-Mixer</td><td>Waring Commercial</td><td>Model 51BL31</td><td></td></tr><tr><td>Mixbecher, 100 mL Fassungsvermögen</td><td>Waring Commercial</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inverses Mikroskop</td><td>Nikon Instruments&nbsp;</td><td>Eclipse TE300</td><td></td></tr></tbody></table>

masse isoliert und in-vitro- kultivierung von intramolluscan stadien der menschlichen blut fluke schistosoma mansoni

Mass Isolation and In Vitro Cultivation of Intramolluscan Stages of the Human Blood Fluke Schistosoma Mansoni

Menschliches Blut Egel, Schistosoma spp., haben einen komplexen Lebenszyklus, der sexuelle und asexuelle Entwicklungsphasen innerhalb einer Schnecke zwischen- und Säugetieren Endwirt, bzw. beinhaltet. Die Fähigkeit, zu isolieren und Aufrechterhaltung der verschiedenen Lebenszyklusphasen unter in-vitro- Kulturbedingungen hat Untersuchungen der zellulären, biochemischen und molekularen Mechanismen zur Regulierung Parasit Wachstum, Entwicklung und Host erheblich erleichtert. Interaktionen. Übertragung von Schistosomiasis erfordert Ungeschlechtliche Fortpflanzung und Entwicklung mehrere Larvenstadien innerhalb der Schnecke Host; von der infektiösen Miracidium, durch primäre und sekundäre Sporocysts zu cercarial Endstufe, die für den Menschen ansteckend ist. In diesem Beitrag präsentieren wir eine Schritt für Schritt Protokoll zur Masse Schraffur und Isolierung von Schistosoma Mansoni Miracidia von Eizellen aus Lebern von infizierten Mäusen und ihre nachträgliche Einführung in in-vitro- Kultur. Es wird erwartet, dass das ausführliche Protokoll wird neue Forscher zu betreiben und erweitern diese wichtige Forschungsfeld schistosome-zu fördern.

Die überwiegende Mehrheit der Miracidia wird in der Regel in den ersten beiden "ernten" gesammelt wurden. Inkubation von isolierten Miracidia in CBSS + löst den Miracidium-Sporocyst Transformationsprozess (Abbildung 4A- C). Innerhalb der ersten Stunde Brunnen folgende Übertragung auf Kultur mit CBSS +, die meisten Miracidia nicht mehr schwimmen (Abb. 4A). Um 6 Uhr in der Kultur Miracidia sind dabei aktiv shedding...

Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll für die groß angelegte axenic Isolierung und Sammlung von freischwimmenden Miracidia der menschlichen Blut Egel Schistosoma Mansoni und deren Weiterverarbeitung für Einführung in die in-vitro- Kultur.

Masse isoliert und In-vitro- Kultivierung von Intramolluscan Stadien der menschlichen Blut Fluke Schistosoma Mansoni

Human blood flukes, Schistosoma spp., have a complex life cycle that involves asexual and sexual developmental phases within a snail intermediate and ...

In diesem Video beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für das großflächige Schlüpfen und Isolieren von freischwimmenden Schistosoma mansoni miracidia und die anschließende Einführung in in vitro Kultur. Schistosoma mansoni ist eine von vier großen Blutegelarten, die weltweit über zweihundert Millionen Menschen infizieren und die vernachlässigte Tropenkrankheit Schistosomiasis verursachen. Der Lebenszyklus der Schistosomen ist komplex und umfasst Schnecken als Zwischenwirte und Säugetiere, einschließlich des Menschen als endgültiger Wirte.Die In-vitro-Kultivierung von Larven und adulten Schistosomen stellt ein unschätzbares Instrument dar, um die Forschung zur Kontrolle und Eliminierung dieser parasitären Krankheit voranzutreiben. In diesem Video veranschaulichen wir anhand eines Mausmodells zur Herstellung von S.mansoni-Eiern, die das schneckeninfizierte Miracidialstadium enthalten, ein Schritt-für-Schritt-Verfahren zur Massenisolierung von Miracidien, die aus Eiern geschlüpft sind, die aus Lebereiern gewonnen und in vitro kultiviert wurden. Bei dieser Demonstration helfen mir Nathalie Dinguirard und Codie Heinemann.Im Folgenden finden Sie ein Workflow-Diagramm, das die drei wichtigsten Schritte veranschaulicht, die im begleitenden Video behandelt werden. Im ersten Abschnitt veranschaulichen wir die Verarbeitung von infizierten Lebern. Anhand von Mäusen, die mit erwachsenen Mäusen infiziert sind, beschreiben wir, wie ihre infizierten Lebern entfernt werden und welche Schritte zur Vorbereitung auf das Mischen des Gewebes verwendet werden, einschließlich der Entfernung eines Nicht-Lebergewebes und des anschließenden Waschens in steriler Kochsalzlösung.Im zweiten Abschnitt zeigen wir, wie Eizellen aus Lebern extrahiert und Mirazidien isoliert werden. Die Eizellen werden durch mechanisches Mischen aus der Leber freigesetzt, gefolgt von wiederholtem Waschen des homogenisierten Lebergewebes in Kochsalzlösung durch Zentrifugation. Pelletiertes Lebergewebe, das Eier enthält, wird dann wieder in sterilem künstlichem Teichwasser suspendiert und vorsichtig in mit Folie bedeckte Messkolben überführt.Überschüssiger Schaum und schwimmende Leberreste werden durch die schnelle sequentielle Entnahme und Zugabe von etwa 12 Mills Teichwasser in den Kolben beseitigt. Nach dem letzten Waschen wird vorgewärmtes Teichwasser vorsichtig in den Kolben gegeben, gefolgt von einer Beleuchtung der oberen Zentimeter des Kolbenhalses mit der hellen Lichtquelle, um Miracidien anzuziehen. Nachdem sich die Mirazizien an der Lichtquelle angesammelt haben, zeigen wir im dritten und letzten Segment des Videos die Sammlung dieser Larven und ihre Kultivierung.Miracidia werden aus dem Kolben in 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführt. Dann auf Eis immobilisiert und durch Zentrifugation konzentriert. In den letzten Schritten werden Miracidien in ein einziges Röhrchen gezogen.Das Teichwasser wird durch die ausgewogene Salzlösung von Chernin ersetzt und Miracidia wird für die In-vitro-Kultivierung bei 26 Grad Celsius in die Vertiefungen der 24-Brunnen-Gewebekulturplatte aufgeteilt. Nach der Einschläferung infizierter Mäuse gemäß den von der institutionellen Tierpflege genehmigten Protokollen werden sie auf den Rücken gelegt und 70%iges Ethanol auf die Bauchflächen gesprüht. Um die Leber zu entfernen, kneifen und ziehen Sie die Haut des Unterbauchs hoch und schneiden Sie mit einer sterilen chirurgischen Schere über die eingeklemmte Haut.Ziehen Sie die Haut nach oben, um die Leber freizulegen, und entfernen Sie sie vorsichtig mit der Hand. Lebern von infizierten Mäusen erscheinen aufgrund einer durch Eier induzierten granulomatösen Reaktion vergrößert und gesprenkelt. Sobald die Leber entfernt wurde, legen Sie sie in ein Becherglas mit 200 Mühlen steriler 1,2%iger Kochsalzlösung, die Pen Strep enthält, und fahren Sie mit der Entnahme der Lebern von den verbleibenden Mäusen fort.Die Lebern werden dann in eine sterile Petrischale überführt und jegliches Fett und Bindegewebe, das nicht zur Leber gehört, mit einer sterilen Pinzette entfernt. Sobald das Trimmen abgeschlossen ist, werden die Lebern in sterile 250-Milliliter-Zentrifugenflaschen überführt, die etwa 200 Mühlen sterile Kochsalzlösung enthalten, und kräftig geschüttelt, um das Fremdgewebe und das überschüssige Blut zu suspendieren. Entfernen Sie mit einer sterilen Einwegpipette den Oberflächenschaum und alle schwimmenden Gewebereste.Verschließen Sie die Flasche wieder und schütteln Sie sie ein zweites Mal kräftig, entfernen Sie dann erneut Schaum und Schmutz und entleeren Sie sie dann vorsichtig und entsorgen Sie die Kochsalzlösung. Geben Sie 200 Milliliter frische Kochsalzlösung in die Leber und wiederholen Sie den Vorgang noch dreimal. Sie sollten eine deutliche Reinigung der weggeworfenen Waschlösung sehen.Geben Sie die gewaschene Leber in einen kleinen sterilen Mixbecher aus Edelstahl und fügen Sie etwa zwei Mühlen Kochsalzlösung mit Antibiotika hinzu. Decken Sie den Becher mit Folie und einer Petrischale ab, um ein Verschütten zu verhindern, und mixen Sie ihn eine Minute lang, indem Sie niedrige und hohe Geschwindigkeiten abwechseln. Nach dem Mischen die Lebersuspension gleichmäßig in sterile 250-Milliliter-Zentrifugenflaschen verteilen.Typischerweise werden bei der Verarbeitung von 20 Lebern vier Flaschen verwendet. Füllen Sie jede Flasche mit ca. 200 Millilitern steriler Kochsalzlösung. Wiegen oder balancieren Sie die Flaschen und schütteln Sie jede einzelne, bevor Sie die gemischte Leber zentrifugieren.Nach dem Zentrifugieren die Waschsalzlösung vorsichtig dekantieren und entsorgen. Sie sollten das pelletierte Lebersediment, das die Eier enthält, am Boden der Flasche beobachten und dann diesen Schritt noch einmal wiederholen, indem Sie 200 Milliliter frische Kochsalzlösung in jede Flasche geben und kräftig schütteln, um das Lebersediment vor dem Zentrifugieren gründlich wieder zu suspendieren. Bereiten Sie während des Zentrifugationsschritts zwei sterile Ein-Liter-Messkolben vor, indem Sie sie bis auf die oberen drei Zentimeter vollständig mit Aluminiumfolie abdecken.Verwenden Sie separate Folienstücke, um den Körper und den Hals des Kolbens zu bedecken, um die Waschschritte zu erleichtern, die im nächsten Abschnitt beschrieben werden. Okay, zurück zu den Lebern. Nach der Zentrifugation und dem Verwerfen der letzten Kochsalzlösung geben Sie 200 Milliliter steriles künstliches Teichwasser mit Pen Strep in das pelletierte Lebergewebe und schütteln Sie es erneut, um das Sediment wieder vollständig zu suspendieren.Übertragen Sie die Teichwasserlebersuspension vorsichtig in die Messkolben, die nun mit Alufolie abgedeckt sind. Füllen Sie den Kolben mit sterilem Teichwasser einschließlich des Halses und entfernen Sie unverzüglich Schaumreste und schwimmendes Lebergewebe, indem Sie schnell etwa 12 Mühlen Teichwasser mit Rückständen aufpipettieren und in ein separates Röhrchen entsorgen. Ersetzen Sie das frische Teichwasser und wiederholen Sie diesen Reinigungsschritt noch dreimal, indem Sie prüfen, ob sich Mirazizien im Entsorgungsrohr befinden.Ergreifen Sie zusätzliche Reinigungsschritte, wenn Mirazizien im Entwurfröhrchen schwimmen oder wenn keine Gewebereste mehr beobachtet werden. Nach dem letzten Waschen langsam acht Milliliter vorgewärmtes steriles Teichwasser hinzufügen, um einen Temperaturgradienten am oberen Rand des Kolbens zu erzeugen. Dies wird am besten erreicht, indem das Wasser langsam an der Seite des Kolbenhalses entleert wird, um eine Vermischung zu vermeiden.Stellen Sie eine kleine Petrischale auf, um die Kolbenöffnung abzudecken, und leuchten Sie mit hellem Licht über die Oberseite des Halses über der Folienabdeckung, um die obere Oberfläche des Wassers zu beleuchten. In der Regel konzentrieren sich schwimmende Miraziden, die vom Licht angezogen werden, innerhalb von fünf bis zehn Minuten in großer Zahl in den oberen zwei bis drei Zentimetern der Wasseroberfläche des Teiches. Wenn sich Miraziden an der Oberfläche angesammelt haben, werden mit einer sterilen Pipette etwa acht Mühlen Teichwasser entnommen und in ein steriles 15-Mühlen-Zentrifugenröhrchen überführt.Legen Sie das Röhrchen mit den Miracidien auf Eis. Geben Sie acht Mühlen warmes, steriles Teichwasser an der Seite des Messkolbens entlang und warten Sie weitere 10 Minuten. Wiederholen Sie die Sammlung von Miracidia noch drei weitere Male mit jeweils neuen 15-Mühlen-Röhrchen.Halten Sie das letzte Röhrchen nach der vierten Entnahme 10 Minuten lang auf Eis, damit sich die immobilisierten Mirazizien absetzen können. Diese erste Gruppe isolierter Parasiten macht in der Regel etwa 80 % der gesamten Miracidial-Ernte aus. Pellet-Miracidia durch Zentrifugieren von Röhrchen für eine Minute in einer vorgekühlten Kühlzentrifuge.Entfernen Sie nach dem Zentrifugieren sofort den größten Teil des Überstands und achten Sie darauf, die Parasitenpellets nicht zu stören. Dieser Schritt sollte schnell durchgeführt werden, da die Miracidien bald anfangen zu schwimmen. Suspendieren Sie die Miracidien vorsichtig wieder und übertragen Sie sie in ein einzelnes 15-Mill-Rohr.Spülen Sie jedes der Originalröhrchen mit etwa einer Mühle sterilem Teichwasser und geben Sie es in das gepoolte Rohr. Lassen Sie die Parasiten etwa fünf Minuten lang auf dem Eis ruhen und pelletieren Sie sie erneut durch Zentrifugation. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand, ohne das Pellet zu stören, und fügen Sie sechs bis acht Milliliter sterile Tschernin-Salzlösung oder CBSS hinzu, die Antibiotika enthält.Suspendieren Sie die Miracidien vorsichtig wieder in CBSS und verteilen Sie sie auf eine 24-Well-Gewebekulturplatte. Inkubieren Sie Parasiten bei 26 Grad Celsius unter normoxischen Bedingungen. Wie Sie sehen können, schwimmen Mirazizien nach der ersten Inkubation aktiv in Vertiefungen und die meisten beginnen sich am Boden der Vertiefung abzusetzen, um sich in das primäre Sporozystenstadium zu verwandeln.Die Larven beginnen nach zwei bis drei Stunden in der CBSS-Kultur mit der Ablösung der Flimmerepidermisplatten. Nach 24 Stunden hat die überwiegende Mehrheit der Miracidien ihre Platten abgestoßen und ihre Umwandlung in Sporozysten abgeschlossen. Die In-vitro-Kultivierung von parasitären Elementen, insbesondere von medizinischer und veterinärmedizinischer Bedeutung, stellt ein unschätzbares Forschungsinstrument dar, nicht nur zur Identifizierung und Charakterisierung einzigartiger Signalwege, zur Regulierung von Wachstum, Entwicklung, Fortpflanzung und Immuninteraktionen des Wirts, sondern auch zur Bereitstellung praktischer Methoden zum Screening identifizierter Moleküle und Signalwege für mögliche therapeutische Eingriffe.Mit Blick auf die Zukunft mit der Entwicklung und kontinuierlichen Verfeinerung der derzeit verfügbaren Werkzeuge zur Manipulation von Genen und Genexpression in vitro durch transgene RNA-Interferenz und Genom-Editing-Ansätze wird davon ausgegangen, dass effiziente Methoden für die großmaßstäbliche Isolierung und Kultivierung von Miracidien aus anderen wichtigen Schistosomenarten, z. B. Leber- oder Lungenegeln, erforderlich sein werden, um weitere Fortschritte auf diesem Gebiet zu erzielen. Wir gehen davon aus, dass der hier vorgestellte grundlegende Ansatz zur Isolierung von Larven-Schistosomen leicht an diese und andere Helmin-Spezies angepasst werden kann.

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Research

Forschung

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Developmental Biology

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