Phagozytose - Assay für apoptotische Zellen in Drosophila Embryonen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die in vivo Phagozytose in Drosophila zu messen, um die Beteiligung spezifischer Gene von Interesse am apoptotischen Zellengulfment zu beurteilen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen in der Immunologie und Entwicklungsbiologie über die Mechanismen zu beantworten, die am apoptotischen Zellengulfment beteiligt sind. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Zellen einfach und präzise in vivo gemessen werden können.

Die Implikation dieser Technik erstreckt sich auf die Therapie von Entzündungskrankheiten und Autoimmunerkrankungen, da apoptotische Zellen durch Phagozytose notwendig sind, um gefährliche Zellen zu entfernen, die Entzündungen verursachen. Beginnen Sie damit, 200 erwachsene weibliche und 200 erwachsene männliche Fruchtfliegen und einen Teller mit frischem Traubensaft-Agar auf Hefe in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen zu geben. Verschließen Sie die Tube mit einer Schwammkappe und brüten Sie die Fliegen zwei bis drei Tage lang im Licht bei 16 Grad Celsius aus.

Am Ende der Inkubation stellen Sie die Fliegen eine Stunde lang im Dunkeln auf 25 Grad Celsius und ersetzen die alte Platte durch eine neue Platte ohne Hefe. Lassen Sie die Fliegen zwei Stunden lang Eier legen. Dann inkubieren Sie die Platte 26 Stunden lang bei 16 Grad Celsius.

Am nächsten Tag übertragen Sie die Embryonen mit einem Pinsel in einen Milliliter PBS, der mit 0,2% Triton X-100 ergänzt ist. Geben Sie nach zwei Wäschen 1,2 Milliliter Natriumhypochloritlösung zu den Embryonen, um das Chorion zu entfernen. Waschen Sie die Embryonen nach drei Minuten viermal in frischem PBS plus Triton X-100.

Übertragen Sie die gewaschenen Embryonen auf eine sechs Zentimeter große Agaroseplatte und legen Sie die Platte unter ein Präpariermikroskop. Identifizieren Sie Embryonen im Stadium 16 mit einer Mikrospitze. Verwenden Sie eine Mikropipette, um etwa 50 der Embryonen im Stadium 16 in ein 1,5-Milliliter-Mikroreagenzglas zu übertragen.

Um die embryonalen Zellen zu isolieren, waschen Sie die Embryonen zunächst zweimal mit 150 Mikrolitern PBS. Übertragen Sie die Embryonen in ein neues 1,5-Milliliter-Mikroreagenzglas. Fügen Sie dann 200 Mikroliter Kollagenase hinzu und homogenisieren Sie die Embryonen 30 Mal mit einem Pelletmischer.

Am Ende der Homogenisierung trituieren Sie die embryonalen Zellen 10 Mal und überführen die Zellsuspension in ein neues 1,5-Milliliter-Röhrchen. Inkubieren Sie die Zellen eine Minute lang bei 37 Grad Celsius. Zerreiben Sie die Zellen dann noch 10 Mal und stellen Sie sie für eine weitere Minute in den 37 Grad Celsius heißen Inkubator.

Am Ende der zweiten Inkubation geben Sie 800 Mikroliter PBS zu den Zellen und sammeln die Zellen durch Zentrifugation. Resuspendieren Sie das Pellet in 200 Mikrolitern Trypsin, bevor Sie die Zellsuspension durch ein 70-Mikron-Zellsieb filtrieren. Stoppen Sie die enzymatische Aktivität mit 40 Mikrolitern hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum in 800 Mikrolitern PBS und sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation.

Resuspendieren Sie die gefällten Zellen in 200 Mikrolitern frischem PBS und sammeln Sie die Zellen mit einer weiteren Zentrifugation. Resuspendieren Sie das Pellet in 30 Mikrolitern PBS und montieren Sie die Zellen auf einen mit Aminopropyltriethoxysilan beschichteten Objektträger. Wenn sich die Zellen festgesetzt haben, verwenden Sie eine Pipette, um das überschüssige PBS vom Objektträger zu entfernen, und fixieren Sie die Zellen mit 60 bis 70 Mikrolitern 4%-Paraformaldehyd.

Entfernen Sie nach 10 bis 15 Minuten das Fixiermittel und waschen Sie die Zellen eine Minute lang in PBS. Um die Zellen mit Anti-Croquemort-Antikörpern zu immunfärben, tränken Sie den Objektträger zuerst seriell in Methanol, dann in PBS, ergänzt mit 0,2 % Triton X-100, gefolgt von PBS allein. Als nächstes blockieren Sie die unspezifische Bindung mit 20 Mikrolitern 5 %igem Schweineserum in PBS plus 0,2 % Triton X-100 für 20 Minuten bei Raumtemperatur.

Entfernen Sie die überschüssige Blockierungslösung und markieren Sie die Zellen über Nacht mit 20 Mikrolitern Anti-Croquemort-Antiserum bei vier Grad Celsius. Waschen Sie den Objektträger am nächsten Morgen in PBS plus Triton X-100 für fünf 10-minütige Inkubationen. Spülen Sie den Objektträger nach dem letzten Waschen 10 Minuten lang in PBS aus.

Anschließend markieren Sie die Zellen eine Stunde lang mit 20 Mikrolitern alkalischer Phosphatase-markiertem Anti-Ratten-IgG bei Raumtemperatur. Waschen Sie den Objektträger am Ende der Inkubation fünfmal in PBS plus Triton X-100, wie gezeigt, gefolgt von einem 10-minütigen Einweichen in Pufferlösung. Markieren Sie dann die Zellen mit Phosphatase-Substratlösung und beobachten Sie die Zellen unter einem Lichtmikroskop.

Wenn starke violette Signale im Hämozytengranulat auftreten, entfernen Sie das überschüssige Substrat und weichen Sie den Objektträger fünf bis 10 Minuten lang in Puffer ein, der mit EDTA angereichert ist. Spülen Sie die Zellen am Ende der Inkubation mit zwei fünfminütigen PBS-Waschungen und behandeln Sie sie 10 Minuten lang mit Äquilibrierungspuffer. Nachdem Sie die Lösung entfernt haben, markieren Sie die Zellen eine Stunde lang mit 20 Mikrolitern terminaler Desoxynukleotidyltransferase-Lösung bei 37 Grad Celsius.

Nehmen Sie dann die Lösung aus dem Objektträger und weichen Sie die Zellen in 0,5 Millilitern Stopp-Waschpuffer in 17 Millilitern Wasser für 10 Minuten ein. Spülen Sie anschließend die Zellen mit drei fünfminütigen PBS-Waschungen und markieren Sie sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 20 Mikrolitern Anti-Digoxigenin-Peroxidase. Am Ende der Inkubation waschen Sie die Zellen viermal in PBS, wie gezeigt, und weichen Sie den Objektträger in 30-Sekunden-Schritten in Peroxidase-Substrat ein, bis die apoptotischen Zellen braun werden.

Wenn eine optimale Färbung erreicht wurde, weichen Sie den Objektträger in Wasser ein, um die Peroxidase-Reaktion zu stoppen. In diesen Bildern wurden Drosophila-Makrophagen, sogenannte Hämozyten, mit TUNEL auf den Hämozytenmarker Croquemort und auf das Vorhandensein von phagozytierten apoptotischen Zellen in dispergierten embryonalen Zellen gefärbt, wie gerade gezeigt wurde. Croquemort-positive Zellen zeigen violette Signale in den kleinen Körnchen ihrer Zellen, während TUNEL-positive Zellen braune Signale in ihren gesamten Körpern zeigten.

Alternativ können Hämozyten mit einem Anti-GFP-Antikörper gefärbt werden, der die gesamte Hämozyte und nicht nur das Granulat färbt. In diesem Experiment wurde das Verhältnis von phagozytierenden Hämozyten zu Gesamthämozyten in Wildtyp- oder Einzelmutantenembryonen analysiert, was zeigte, dass der phagozytäre Index in beiden Einzelmutantenstämmen niedriger war als in Wildtyp-Fliegen, während die Gesamtzahl der Hämozyten und apoptotischen Zellen ähnlich war, was auf die Notwendigkeit der mutierten Gene für die apoptotische Zellengulfment hinweist. Der RNAi-Knockdown einzelner Gene reduziert ebenfalls den phagozytischen Index, während die Gesamtzahl der Hämozyten und apoptotischen Zellen vergleichbar blieb, was die Beteiligung der untersuchten Phagozytoserezeptoren an der apoptotischen zellvermittelten Phagozytose weiter unterstreicht.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in etwa 15 Stunden abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, überschüssige Hämozytenmarker und TUNEL-Färbungen zu vermeiden, um die phagozytotische Fähigkeit der Zellen optimal zu beurteilen. Im Anschluss an dieses Verfahren kann ein in situ Phagozytose-Assay aller Drosophila-Embryonen durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen über den Ort des Verschlingens oder die Verteilung der Hämozyten zu beantworten.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Immunologie, um die Mechanismen des apoptotischen Zellengulfments in Drosophila zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die In-vivo-Phagozytose in Drosophila-Embryonen misst.