Zweite harmonische Generation Signale in Kaninchen Sklera als Instrument für die Bewertung des therapeutischen Gewebes Vernetzung (TXL) für Kurzsichtigkeit

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, die Verwendung der Mikroskopie der zweiten harmonischen Generation zu demonstrieren, um den Kollagenvernetzungseffekt im Skleralgewebe zu visualisieren und zu messen, wie er durch die Injektion des Formaldehyd-Trennmittels unter der Zapfenschicht induziert und mit der dynamischen Differenzkalorimetrie bestätigt wurde. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der therapeutischen Gewebevernetzung zu beantworten, indem sie eine nicht-invasive Methode zur Bewertung der induzierten Vernetzungseffekte bereitstellt. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die erzeugten Signale der zweiten Harmonischen hochspezifisch für Collagefibrillen sind und daher keine spezielle Gewebevorbereitung, wie z. B. eine Antikörperfärbung, erforderlich ist.

Die Idee zu dieser Methode hatten wir, als wir von dem Verfahren gelesen haben, das bei der therapeutischen Vernetzung von Hornhautgewebe angewendet wird. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da eine erfolgreiche Mikroskopie der zweiten Harmonischen eine sorgfältige Platzierung des Gewebes und die Einstellung korrekter Bildgebungsbedingungen erfordert, um Gewebeschäden und Artefakte bei der Signalmessung zu vermeiden. Beginnen Sie die Behandlung mit einer Sub-Tenon-Injektion in die Augäpfel des Kaninchens, wie im Textprotokoll beschrieben.

Hier sehen Sie eine schematische Darstellung der Injektionsstelle des Subzapfens. Wählen Sie ein optimal dimensioniertes Spekulum entsprechend der Größe des Auges. Nach dreieinhalb Stunden Inkubation ziehen Sie die Augenlider mit dem Augenlidspekulum zurück, um den Zugang zum Globus zu optimieren.

Trennen Sie die Bindehaut, die den Limbus umgibt, und durchtrennen Sie die zusätzlichen Augenmuskeln an den Stellen, an denen die Sklera angesetzt ist. Schneiden Sie den oberen Teil der Sklera mit einer Schere oder einer Klinge ab, um einen Bereich von einem Zentimeter zu schaffen, in dem sich die Injektionsstelle in der Mitte befindet. Kratzen Sie die restlichen Netzhaut- und Aderhautschichten ab und waschen Sie sie zweimal mit frischem PBS, wobei Sie die Stücke jedes Mal etwa 10 Sekunden lang in Lösung belassen.

Legen Sie das Gewebe in ein Milliliter-Röhrchen, das mit PBS-Lösung gefüllt ist, um es zur Bildgebungseinrichtung zu transportieren. Um das Signal und die Auflösung bei der SHG-Mikroskopie zu maximieren, verwenden Sie eine Objektivlinse, die für die Übertragung von Infrarotlicht optimiert ist und eine hohe numerische Apertur aufweist. Passen Sie den Korrekturring des Objektivs an die Tiefe der Probe an.

In diesem Fall 0,17 Millimeter. Montieren Sie die 25-fach-Objektivlinse am Mikroskop und fügen Sie eine großzügige Menge Immersionsgel auf Wasserbasis hinzu, um die Linsenoberfläche zu bedecken. Es ist wichtig, die Gewebebildgebung innerhalb von 30 Minuten nach der Montage der Probe am Mikroskop durchzuführen, um das Gewebe mit Feuchtigkeit zu versorgen und ein Austrocknen des Immersionsgels zwischen dem Linsenobjektiv und dem Objektträger zu verhindern, da dies zu Veränderungen des SHG-Signals führen würde.

Bauen Sie die Zellkammer zusammen, indem Sie einen 25 Millimeter dicken runden Abdeckzettel auf den unteren Teil der Kammer legen. Legen Sie das Stück Skleragewebe auf den Deckglas und fügen Sie 50 bis 100 Mikroliter Puffer hinzu. Decken Sie das Gewebe mit einem zweiten runden Deckglas ab und schrauben Sie den oberen Teil der Kammer auf, ohne das Gewebe zu drücken oder abzuflachen.

Anschließend montieren Sie die Zellkammer mit der Gewebeprobe auf dem Mikroskoptisch. Positionieren Sie den Tisch und stellen Sie die Höhe des Objektivs so ein, dass die untere Oberfläche der Probe scharf ist, wie durch Hellfeldinspektion durch das Okular bestimmt. Schalten Sie alle Lichter außer dem Computermonitor aus und blockieren Sie so viel Licht wie möglich vom Monitor mit Aluminiumfolien, die auf dem Mikroskoptisch drapiert sind.

Schalten Sie in der Software den Eye-Port-Modus aus. Überprüfen Sie im TI Pad-Panel, ob die Objektivdefinition korrekt ist. Wählen Sie im Bedienfeld "A1 Compact Graphical User Interface" den Infrarotlaser für die Bildgebung aus, wählen Sie die nicht descannten Detektoren und wählen Sie den DAPI-Kanal aus, der mit einem Bandpassfilter von 400 bis 450 Nanometern ausgestattet ist.

Stellen Sie im Bedienfeld "A1 Multi Photon Graphical User Interface" die Wellenlänge des Infrarotlasers auf 860 Nanometer ein und öffnen Sie den Verschluss. Warten Sie, bis sich die Emissionswellenlänge geändert hat, wie durch das konstante grüne Licht angezeigt. Um die Laserscanning-Bedingungen in der grafischen Benutzeroberfläche des A1 Compact einzustellen, wählen Sie Galvano-Scanner, Unit-Directiond-Scanning, eine Bildgröße von 1024 x 1024 Pixel, eine Pixelverweilzeit von 6,2 Mikrosekunden und eine Zeilenmittelung von 2X aus.

Aktivieren Sie dann die Live-Bildgebung mit dem Suchmodus und legen Sie die Imagine-Bedingungen im Bedienfeld AI Compact Graphical User Interface fest, indem Sie die Laserleistung und die Detektorverstärkung anpassen. Stellen Sie die Laserleistung zwischen 50 Milliwatt und 150 Milliwatt ein, d. h. zwischen zwei und sechs Prozent für einen Laser bei 860 Nanometern. Oberhalb dieses Bereichs kann es zu Gewebeschäden kommen.

Öffnen Sie das Bedienfeld Nachschlagetabelle, in dem ein Histogramm der Pixelintensitätswerte im aktuellen Bild angezeigt wird, und passen Sie die Verstärkung des Detektors in der HV-Leiste weiter an, um den Bereich der Pixelwerte zu maximieren und gleichzeitig eine Sättigung zu vermeiden. Verwenden Sie die Probe mit dem höchsten SHG-Signal, um die optimalen Laser- und Verstärkungseinstellungen zu finden. Behalten Sie identische Einstellungen für alle Proben bei, die in einem Experiment verglichen werden sollen.

Diese Vorgehensweise stellt sicher, dass keine Probe im Experiment den Detektor durchtränkt. Um das Gewebe im Vorschaumodus zu scannen, öffnen Sie das XYZ-Übersichtswerkzeug. Stellen Sie die Bildgebung auf eine niedrigere Auflösung ein, um die Aufnahme von Bildern in diesem Modus zu beschleunigen.

Klicken Sie im XYZ-Übersichtsfenster mit der rechten Maustaste auf die aktuelle Position und wählen Sie "Fünf mal fünf", "Drei mal drei" oder "Einzelansicht" auswählen. Nachdem der Scanvorgang abgeschlossen ist, wechseln Sie zu einem neuen Speicherort, indem Sie auf einen Bereich außerhalb des aktuell in der Vorschau angezeigten Bereichs doppelklicken. Schalten Sie den Live-Scan-Modus ein und bringen Sie das Gewebe in den Fokus, da verschiedene Regionen des Gewebes leicht unterschiedliche Positionen in axialer Richtung einnehmen können.

Erfassen Sie ein neues Fünf-mal-Fünf-, Dreimal- oder Einzel-Sichtfeld. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis ein großer Bereich des Gewebes in der Vorschau angezeigt wurde. Doppelklicken Sie im XYZ-Übersichtswerkzeug auf eine Position, an der die Kollagenfasern im gesamten Sichtfeld zu sehen sind, um die Bühne an diese bestimmte Position zu verschieben.

Stellen Sie die Bildgebung auf hohe Auflösung, 1024 x 1024 Pixel und 2-fache Zeilenmittelung ein. Aktivieren Sie den Live-Find-Modus, passen Sie die Position des Objektivs so an, dass die untere Ebene scharf ist, und verschieben Sie die optische Ebene auf dem TI Pad mit dem Z Drive 10 Mikrometer über diese untere Schicht. Erfassen Sie ein Bild mit der Schaltfläche "Aufnehmen", speichern Sie den Speicherort mit der Plus-Schaltfläche im XYZ-Überprüfungswerkzeug.

Doppelklicken Sie auf eine neue Position und wiederholen Sie die Tiefenanpassung und die Bildaufnahme. Nehmen Sie für jedes Stück Gewebe 10 Bilder auf. Die Sichtfelder sollten sich nicht überlappen, wie die gespeicherten Positionen im XYZ-Übersichtswerkzeug zeigen.

Legen Sie schließlich die Skleralstücke unmittelbar nach Abschluss der Mikroskopie in ein Ein-Milliliter-Röhrchen mit PBS, um sie für die anschließende dynamische Differenzkalorimetrie vorzubereiten. Schneiden Sie zunächst den zentralen Teil der Kontrolle und die behandelte Sklera mit einer Schere aus. Trocknen Sie jedes Skleralquadrat mit einem saugfähigen Tuch und legen Sie es mit einer Zahnzange flach auf den Boden einer DSC-Pfanne.

Solange sich das Taschentuch im Inneren befindet und die Lippe gekräuselt und bedeckt ist, wiegen Sie die Pfanne, um das Nassgewicht des Gewebes zu erhalten. Legen Sie dann die gewogene Probe an der dafür vorgesehenen Stelle auf das DSC-Autosampler-Tablett. Erstellen Sie eine Methode mit Hilfe der Instrumentenverwaltungssoftware, geben Sie das Gewicht des Gewebes an und führen Sie die thermische Analyse mit den im Textprotokoll aufgeführten Perimetern durch.

Analysieren Sie nach Abschluss die Daten für jede Probe, indem Sie die Sprungtemperaturspitze, bei der die thermische Denaturierung auftritt, mit der Bildgebungssoftware des Instruments extrahieren. SHG-Bilder von Sklera wurden in Fidschi auf die mittlere Pixelhelligkeit analysiert. Wenn ein Bild geöffnet wird und das Menü "Analysieren" gefolgt von "Messen" ausgewählt wird, öffnet sich eine Tabelle mit Ergebnissen, die die mittlere Helligkeit des Signals enthalten.

Alternativ kann im Menü "Analysieren" die Option "Histogramm" ausgewählt werden, um ein Histogramm der Pixelintensitätswerte zu erstellen, das Informationen über die mittlere Helligkeit und Variation des Signals im Bild enthält. Diese Messung wurde für alle Bilder aus den Kontroll- und vernetzten Proben wiederholt. Repräsentative SHG-Bilder der Sklera mit begleitender Histogrammanalyse, einschließlich mittlerer Helligkeit, werden hier gezeigt.

Die Kontrollprobe zeichnet sich durch eine wellenförmige Anordnung von Fibrillen aus. Hier ist eine Probe zu sehen, die mit 400 Millimolar SMG mit erhöhter Pixelintensität vernetzt ist und Kollagenfasern zeigt, die gerader erscheinen. Die Ergebnisse der thermischen Analyse zeigen den höheren Peak der Denaturierungstemperatur und bestätigen den Vernetzungseffekt.

Die Kontrollprobe und eine 400 Millimolar vernetzte Denaturierungskurve der Probe sind dargestellt. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine vernetzte Probe vorbereitet und wie man SHG-Mikroskopie an Skleralproben durchführt. Im Allgemeinen haben Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten mit der präzisen Injektion im Sub-Zapfen-Raum, der chirurgischen Extraktion des Quadrats um die Injektionsstelle und dem Einstellen der Bildbedingungen für das Scannen des Gewebes im Vorschaumodus.

Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden, wie z.B. die Autoluoreszenz, durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. die Elastinanalyse einschließlich Quantifizierung und Morphologie. Die Auswirkungen dieser Vernetzungstechnik erstrecken sich auf die Therapie von hoher Myopie und posteriorem Staphylom, da sie einen leichteren Zugang zum hinteren Pol zum Zwecke der Skleralstabilisierung bietet. Die Implikationen dieser Mikroskopietechnik erstrecken sich auf die Diagnose von hoher Myopie und Komplikationen, die durch Kollagenschwächung verursacht werden, indem der Zustand der Kollagenvernetzung in der erkrankten Sklera gemessen wird, oder durch die Messung des Ergebnisses nach Abschluss des gewünschten Vernetzungsverfahrens.

Diese Vernetzungsmethode und die Mikroskopie der zweiten harmonischen Generation können also Einblicke in die Skleravernetzung geben und auch auf andere Gewebe wie Hornhaut, Haut, Knorpel, Sehne, Herzklappe und Blutgefäße angewendet werden.