Eine Alternative Kultur-Methode, um genomische Hypomethylierung von embryonalen Stammzellen der Maus mit MEK-Inhibitor PD0325901 und Vitamin C aufrechtzuerhalten

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, die niedermolekularen Verbindungen PD0325901 und Vitamin C zu verwenden, um einen hypomethylierten und pluripotenten Zustand in embryonalen Stammzellen der Maus aufrechtzuerhalten. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der FBS-kultivierten embryonalen Stammzellen der Maus zu beantworten, wie z.B. die Heterogenität in der Morphologie und die Dehypermethylierung. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht also darin, dass die embryonalen Stammzellen der Maus in der Lage sind, eine ausgezeichnete Morphologie und den hypomethylierten und den undifferenzierten Zustand beizubehalten.

Nach der Vorbereitung von Platten und Puffern gemäß dem Textprotokoll werden die ES-Zellen der Maus, das Kulturmedium, das Trypsin und das PBS in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius vorgewärmt. Um die Zellen zu passieren, saugen Sie das Medium aus der Schale ab und verwenden Sie zwei Milliliter PBS, um die Zellen zweimal zu spülen. Entfernen Sie dann das PBS und geben Sie 0,3 Milliliter Trypson EDTA zu den Zellen und kippen Sie die Schale schnell, um die Zellen mit der Lösung zu bedecken.

Entfernen Sie sofort das Trypsin und inkubieren Sie die Platte eine Minute lang bei 37 Grad Celsius, um die Zellen zu lösen. Fügen Sie zwei Milliliter vorgewärmtes Serummedium hinzu, um das Trypsin zu inaktivieren, und verwenden Sie eine Fünf-Milliliter-Pipette, um die Zellkolonien 10 Mal in einer einzigen Zellsuspension zu resuspendieren. 150 Mikroliter der Zelllösung in eine neue, sechs Zentimeter große, mit Gelatine überzogene Schale geben und mit drei Millilitern frisch hergestelltem VCPD0325901 Medium ergänzen.

Kultivieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius und fünf Prozent CO2. Aufgrund der Instabilität von Vc entfernen Sie während der Inkubation alle 24 Stunden das alte Kulturmedium und fügen drei Milliliter frisches Medium Vcpd0325901 hinzu. Nachdem Sie eine Konfluenz von 70 bis 80 Prozent erreicht haben, passieren Sie die Zellen und kultivieren Sie sie weiter, wie gerade gezeigt.

Um die DNA-Extraktion durchzuführen, sammeln Sie die Zellen mit Trypsin, wie bereits gezeigt, und verwenden Sie ein genomisches DNA-Aufreinigungskit gemäß den Anweisungen des Herstellers. Geben Sie 100 Mikroliter ultrareines Wasser in das DNA-Röhrchen und lösen Sie die DNA durch etwa 15-maliges Pipettieren auf. Verwenden Sie dann ein Spektralphotometer, um das Verhältnis von Od260 zu 280 zu messen, um die Konzentration und Qualität der DNA zu bestimmen.

Die DNA-Konzentration sollte etwa 500 Nonogramm pro Mikroliter betragen. Als nächstes verdauen Sie fünf Mikrogramm DNA, indem Sie sie mit fünf Mikrolitern 100 Millimolar Trishydrochlorid PH7,6, zwei Einheiten Kälberdarmphosphatase, einer Einheit Dnase und 0,005 Einheiten Schlangengift, Phosphodyesterase eins, kombinieren. Verwenden Sie dann ultrareines Wasser, um das Volumen auf 50 Mikroliter zu erhöhen.

Inkubieren Sie die Reaktion über Nacht bei 37 Grad Celsius. Entnehmen Sie die Probe am nächsten Morgen durch Zentrifugation bei 1.000 x g bei Raumtemperatur für eine Minute. Füllen Sie dann die Lösung in Ultrafiltrationsröhrchen um und schleudern Sie die Proben 30 Minuten lang bei 13.000 xg und 4 Grad Celsius, um die Verdauungsenzyme zu entfernen.

Um die Proben für die 5HMC-Analyse vorzubereiten, werden 36 Mikroliter des Filtrats in ein neues Ein-Milliliter-Röhrchen überführt und vier Mikroliter D35HMC für eine Endkonzentration von drei Nanomolaren hinzugefügt. Für die 5MC-Analyse pipettieren Sie 196 Mikroliter ultrareines Wasser in ein neues Zentrifugenröhrchen und fügen Sie aufgrund der hohen Dichte von 5MC in der genomischen DNA vier Mikroliter Filtrat hinzu. 36 Mikroliter der verdünnten 5MC-Lösung werden in ein neues Zentrifugenröhrchen überführt und vier Mikroliter D35MC für eine Endkonzentration von 50 Nanomolar hinzugefügt.

Verwenden Sie D35HMC und D35MC als interne Standards, um 5HMC bzw. 5MC zu kalibrieren. Nachdem Sie die Parameter für die Analyse von 5MC und 5HMC in der UHPLCMS-Software gemäß dem Textprotokoll eingerichtet haben, legen Sie die Parameter für QQQMSMS fest, indem Sie auf MS QQQ klicken. Wählen Sie für die Stoppzeit No limit/As Pump (Keine Begrenzung/Als Pumpe).

Wählen Sie für Ionenquelle ESI aus. Aktivieren Sie für die Zeitfilterung die Option Spitzenbreite und geben Sie 0,07 Minuten ein. Um die Zeitsegmente einzurichten, wählen Sie für die Startzeit die Option Null aus.

Um den Scanmodus in MRM so festzulegen, dass die Anspielung aus der Spalte analysiert wird, wählen Sie für Scantyp die Option MRM aus. Wählen Sie für Div Value die Option To MS aus. Geben Sie für Delta EMV plus 200 ein, und geben Sie für Delta EMV minus Null ein. Erstellen Sie die Parameter für die Überwachung der Übergänge, indem Sie zuerst auf MSQQQ one acquisition klicken.

Geben Sie zum Festlegen von Scan-Segmenten für Verweildauer den Wert 90 ein. Um die Fragmentspannungen für den Fragmentor festzulegen, geben Sie 90 ein. Geben Sie für Kollisionsenergie fünf ein.

Geben Sie für die Zellbeschleunigerspannung vier ein. Um den positiven Ionenmodus festzulegen, wählen Sie für Polarität die Option positiv aus. Um die UHPLC-Trennung von Mononukleosiden durchzuführen, bereiten Sie die Lösungen a und b für die Anspielung von 5MC und Cytosin vor, indem Sie 500 Milliliter Reinstwasser mit 500 Mikrolitern Ameisensäure für Lösung a mischen.

Messen Sie dann 500 Milliliter 100 % Methanol und Lösung b. Mischen Sie Lösung a und Lösung b mit einem Volumen-Volumen-Verhältnis von 95 zu fünf als mobile Phase, um 5MC und C zu eluieren. Stellen Sie dann die Durchflussrate auf 0,25 Milliliter pro Minute ein. Trennen Sie 5HMC durch eine optimierte Gradientenanspielung.

Stellen Sie dann die Durchflussmenge auf 0,25 Milliliter pro Minute ein. Überwachen Sie die Übergänge für 5MC, D35MC, DC, 5HMC und D35HMC. Stellen Sie die Kapillarspannungen auf 3.500 Volt ein.

Stellen Sie dann das Injektionsvolumen auf 5 Mikroliter ein und analysieren Sie jede Probe dreimal. Verwenden Sie die entsprechenden Standardkurven, um die Menge an 5MC und 5HMC gemäß dem Textprotokoll zu bewerten. Wie in dieser Analyse der genomischen DNA in ES-Zellen der Maus mittels UHPLC-MSMS zu sehen ist, führte die Behandlung mit VcPD0325901 zu einem schnelleren Rückgang der DNA-Methylierung und erreichte nach fünf Tagen stabile MC-Spiegel von fünf Metern, während die Behandlung mit Vc2i an Tag 11 zu einem vergleichbaren Niveau führte.

Diese Grafik zeigt, dass die Vc-haltige Behandlung die 5HMC-Häufigkeit nach einem Tag drastisch erhöhte und danach die 5HMC-Spiegel aufgrund einer fortschreitenden Reduktion des 5MC-Substrats allmählich abnahmen. Die Western-Blot-Analyse zeigte, dass Prdm14 signifikant erhöht war, während Dnmt3b und sein Co-Faktor Dnmt3l erheblich herunterreguliert waren, wenn Zellen mit PD0325901 zurückgingen, was auf die Wirkung von PD0325901 bei der Löschung von 5MC hinweist. In diesem alkalischen Phosphatase-Assay wurden alle ES-Zellen der Maus violett gefärbt, wenn sie 26 Tage lang in VcPD032590 kultiviert wurden, was auf einen undifferenzierten Zustand hinweist.

Im Gegensatz dazu erschienen Zellen, die in FBS gezüchtet wurden, die nur Medium enthielten, eine helle Farbe, wobei eine partielle Ausbreitung auf eine partielle Differenzierung hindeutete. Einmal gemeistert, kann diese Technik in fünf Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, dass FBS vorab überprüft werden muss.

Vermeiden Sie es außerdem, Zellen zu stark durch den Durchgang zu pipettieren und das Kulturmedium VcPDO325901 täglich zu wechseln. Nach dieser Entwicklung ebnet diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Kultivierung von ES-Zellen der Maus in vitro, um die Entwicklung und die Prozesse von Embryonen in vitro und die erzeugten Zellen von medizinischer Relevanz für die regenerative Medizin zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein besseres Verständnis dafür haben, wie Sie die Wachstumsmorphologie und den hypermethylierten und pluralen potenten Zustand für ES-Zellen der Maus aufrechterhalten können, indem Sie zwei kleine molekulare Komponenten, den MEK-Inhibitor PD0325901, verwenden.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Trisol, DMS oder PMS und dem DTT äußerst gefährlich sein kann und die Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen, einer Maske und der Schutzbrille bei der Durchführung dieses Verfahrens immer getroffen werden sollten.