Name: Eine Alternative Kultur-Methode, um genomische Hypomethylierung von embryonalen Stammzellen der Maus mit MEK-Inhibitor PD0325901 und Vitamin C aufrechtzuerhalten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: Erfahren Sie eine Kulturmethode für embryonale Stammzellen der Maus mit PD0325901 und Vitamin C zur Aufrechterhaltung des hypomethylierten, pluripotenten Zustands. Diese Technik ermöglicht langfristige Kulturen mit exzellenter Morphologie.

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Diese Arbeit wurde unterstützt von der National Natural Science Foundation of China (21435008 und 21327006, h.w.) und die strategische Priorität Forschungsprogramm von der chinesischen Akademie der Wissenschaften (XDB14030200, HW).

1. Vorbereitungen
<ol><li>
Bereiten Sie eine Lösung von 1,0 mM PD0325901 (MEK-Inhibitor) und 3,0 mM CHIR99021 (GSK3-Hemmer).
	<ol>
<li>Wiegen Sie 2 mg PD0325901 und 4,15 mL DMSO in eine Braunglas-Fläschchen.</li>
		<li>Wiegen Sie 2 mg CHIR99021 und 1,43 mL DMSO in eine Braunglas-Fläschchen.</li>
		<li>Folgende Wiederherstellung speichern Aliquote (50 µL/Rohr in 200 µL PCR-Röhrchen) bei-20 ° C und vor Licht geschützt werden. Ein Röhrchen mit den gefrorenen bestand aus einem Gefrierschrank und Auftauen bei Raumtemperatur vor dem Gebrauch zu entfernen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>0,0176 g Vc in ein Zentrifugenröhrchen 1 mL wiegen und mit 1 mL sterilem Wasser, eine Endkonzentration von 100 mM vor dem Gebrauch wiederherzustellen.</li>
	<li>Inaktivieren FBS: inkubieren Sie 500 mL FBS in einem Wasserbad bei 56 ° C für 30 min.</li>
	<li>
Bereiten Sie 600 mL Basismedium für die Kultivierung von Maus-ES-Zellen.
	<ol>
<li>Verwenden Sie eine Flasche DMEM/hohe Glukose Medium (500 mL) und entfernen Sie 40 mL zu.</li>
		<li>Ergänzung 460 mL DMEM/hohe Glukose Medium mit 20 % inaktiviert FBS (120 mL), 1.000 U/mL LIF (60 µL 107 U/mL Stammlösung), 0,1 mM nicht-essentiellen Aminosäuren (NEAA) (6 mL Stammlösung 10 mM), 1 mM Natrium Pyruvat (6 mL 100 mM Stammlösung) , 2 mM L-Glutamin (6 mL Stammlösung 200 mM), 0,1 mM β-Mercaptoethanol (600 µL der Stammlösung 100 mM), und 33 IU/mL Penicillin und 33 µg/mL Streptomycin (2 mL von Penicillin-Streptomycin gemischt Lösung (10.000 IU/mL Penicillin und 10.000 µg/mL Streptomycin)) . Definieren Sie das Basismedium als Serum Medium.</li>
		<li>Pipette 50 µL der Stammlösung von PD0325901 (1,0 mM) und Vc (100 mM), jeweils in 50 mL des Mediums Serum (Endkonzentration: 1,0 µM PD0325901 und 100 µM Vc), und definieren Sie das Medium als Vc/PD0325901 Medium. Hinweis: Die Vc/PD0325901 mittlere frisch vor Gebrauch aufgrund der Instabilität der Vc zubereiten.</li>
		<li>Mit einer Pipette 50 µL der Stammlösung von PD0325901 übertragen (1,0 mM) und CHIR99021 (3,0 mM), jeweils in 50 mL des Mediums Serum (Endkonzentration: PD0325901 1,0 µM und CHIR99021 3,0 µM), und definieren Sie das Medium als 2i Medium.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Die Gelatine beschichtet Gerichte zuzubereiten.
	<ol>
<li>Bereiten Sie die 0,1 % Gelatine-Lösung: 0,3 g Gelatine in 300 mL Reinstwasser in einer Glasflasche Reagenz mit einer Kappe und Sterilisieren in einem Autoklaven bei 121 ° C für 20 min. Store die sterile Lösung bei Raumtemperatur.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Zelle-Kultur-Gerichte (6 cm Durchmesser) mit 2 mL 0,1 % Gelatine-Lösung für 15 min bei Raumtemperatur und Aspirieren Sie die Gelatine. Trocknen Sie die Gerichte in der Luft zu und verwenden sie innerhalb von 12 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>10 mL von Maus-ES-Zellen einfrieren Medium in einer 15 mL Zentrifugenröhrchen vorbereiten: 90 % FBS (9 mL) und 10 % DMSO (1 mL). Nutzen Sie das Medium innerhalb von 1 Tag.</li>
	<li>Bereiten Sie einen eiskalten Container: die Füllhöhe des Behälters Einfrieren 100 % Isopropyl-Alkohol hinzu, und entsorgen Sie die alte Isopropyl-Alkohol. Fügen Sie neue Isopropyl-Alkohol direkt nach jedem fünften Gebrauch.</li>
	<li>Die enzymatische Verdauung Puffer zu machen: wiegen 1,2114 g Tris-Pulver in 100 mL Reinstwasser zur Vorbereitung 100 mM Tris-Lösung und fügen konzentrierte HCl-Lösung (ca. 12 M) in der Tris-Lösung zur Einstellung des pH-Wertes auf 7,6 (ca. 0,6 mL konzentrierte HCl-Lösung).</li>
	<li>Bereiten Sie 50 mL Radio Immunopräzipitation testpuffer (RIPA Puffer): 20 mM Tris, pH 7,4, 1 mM MgCl2, 150 mM NaCl, 20 % Glycerin, 0,5 % NP40, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA. Ergänzen Sie mit 1 mM DVB-t, 1 X cocktail-Proteasehemmer und 1 mM PMSF vor dem Gebrauch. Sobald der PMSF hinzugefügt wird, verwenden Sie den Puffer innerhalb von 30 min.</li>
</ol>(2) wachsen Sie ES-Zellen auf Gelatine beschichtet Gerichte
<ol><li>Pre-warme Maus-ES-Zellen (Wildtyp, 129 SvEv) Kultur, Medium, Trypsin und Phosphat gepufferte Lösung (PBS) in einem Wasserbad bei 37 ° C.</li>
	<li>
Die Passage der Zellen. Aspirieren Sie das Medium vollständig aus der Schale und Pipette 2 mL PBS, das Geschirr zu spülen Sie die Zellen.
	<ol>
<li>Entfernen Sie die PBS mit einer Pipette zu und waschen Sie die Zellen wieder mit 2 mL PBS.</li>
		<li>Entfernen der PBS und 0,3 mL Trypsin-EDTA (0,25 %) in jedes Gericht.</li>
		<li>Die ganze Schüssel mit dem Trypsin schnell und dann sofort entfernen.</li>
		<li>Setzen Sie die Schale in einem Inkubator bei 37 ° C für 1 min um die Zellen aus der Schale lösen. Nehmen Sie das Geschirr aus dem Inkubator und 2 mL vorgewärmten Serum Medium, die Wirkung von Trypsin zu kündigen.</li>
		<li>Die Zelle Kolonien in eine einzelne Zelle Suspension zu distanzieren, resuspending mit einer Pipette (5 mL PIPETTENSPITZE) 10 mal.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Übertragen Sie 150 µL 2 ml der Zelle-Lösung (ca. 190.000 Zellen durch zählen mit einem Hemocytometer) zu, in eine neue Schale Gelatine beschichtet und mit 3 mL frisch zubereiteten Vc/PD0325901 Medium pro 6 cm Kulturschale ergänzen. Kultur der Zellen in einem Inkubator 37 ° C mit 5 % CO2.</li>
	<li>Alle 24 h während der Inkubation, entfernen Sie das alte Kulturmedium und 3 mL frisches Vc/PD0325901-Medium in der Kulturschale aufgrund der Instabilität der Vc. erwarten 70 – 80 % Konfluenz nach 2 – 3 Tagen.</li>
	<li>Nach erreichen von 70-80 % Konfluenz, Durchgang der Zellen und sie wie beschrieben 2.2 – 2.4 Kultur weiterhin.</li>
</ol>(3) frieren Sie ein und tauen Sie Maus Embryonische Stammzellen auf
<ol><li>
Maus-ES-Zellen einfrieren.
	<ol>
<li>Die Zellen von den Gerichten mit Trypsin durch folgende Schritt 2.2 abnehmen.</li>
		<li>Übertragen Sie die Zellen in einem Kunststoffrohr 15 mL und Zentrifuge bei 800 x g und Raumtemperatur für 3 min.</li>
		<li>Dump des Überstands sanft in einen Becher füllen und Aufschwemmen der Zelle Pellet mit 1 mL frisch Einfrieren Medium gemacht. Bereiten Sie einfrierende mittlere 30 min vor diesem Schritt, damit es Raumtemperatur vor der Anwendung ist.</li>
		<li>Die Zellen in das Medium zu einem 1,8 mL Microcentrifuge Schlauch mit einer 1-mL-Pipette Einfrieren und den Microcentrifuge Schlauch in einen eiskalten Behälter. Die Füllhöhe des Behälters Einfrieren Isopropyl-Alkohol hinzu und vor der Benutzung bei Zimmertemperatur aufbewahren.</li>
		<li>Lassen Sie die eiskalten Behälter über Nacht in einem-80 ° C Gefrierschrank.</li>
		<li>Übertragen der Mikrozentrifugenröhrchen auf einem Flüssigstickstoff-Behälter für bis zu 2 – 3 Jahre. Hinweis: Nicht halten Zellen einfrieren mittelfristig für eine lange Zeit und schnelle Übertragung von Zellen in einem-80 ° C Gefrierschrank wegen der Giftigkeit von DMSO.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Tauen Sie ES Mauszellen.
	<ol>
<li>Wärmen Sie 50 mL Serum Medium in einem 37 ° C-Wasserbad vor.</li>
		<li>Ein Zelle-haltigen Fläschchen aus dem Flüssigstickstoff-Behälter herausnehmen und das angeschnittene Ärmel Fläschchen in einem 37 ° C Wasserbad eintauchen. Schütteln Sie sie schnell in das Wasserbad aufzutauen. Übertragen Sie die Zellen in einem 15 mL-Tube mit einer 1-mL-Pipette. Fügen Sie 2 mL vorgewärmten Serum Kulturmedium in das Rohr zu verdünnen Mediums Einfrieren und dann bei 800 X g und Raumtemperatur für 3 min zentrifugieren.</li>
		<li>Entfernen Sie den überstand und Aufschwemmen Sie sanft der Zelle Pellets mit 3 mL frisches Vc/PD0325901 Medium mit einer 5 mL-Pipette.</li>
		<li>Die Zellen von der 15 mL Tube auf ein Gelatine beschichtet Gericht übertragen und Kultur der Zellen für 24 h Kultur die Zellen wieder wie in Schritt2 beschrieben.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Gesamt-Protein aus Zellen extrahieren
<ol><li>Spülen Sie die gesammelten Zellen mit 1 mL PBS und dann bei 800 X g und Raumtemperatur für 3 min zentrifugieren.</li>
	<li>Den überstand abgesaugt und Aufschwemmen der Zelle Pellet gründlich mit RIPA Buffer sanft Pipettieren mit DVB-t, Protease-Inhibitor cocktail und PMSF ergänzt. Das Volumen des RIPA Puffer ist ca. 5 X, die der Zelle pellet. Hinweis: Führen Sie die Zelle Wiederfreisetzung auf Eis.</li>
	<li>Halten Sie die Zellen im RIPA Puffer für 30 min auf Eis und Zentrifuge bei 13.000 x g und 4 ° C für 5 min.</li>
	<li>Übertragen Sie den überstand zu einem neuen Schlauch und speichern Sie Aliquote bei-80 ° C.</li>
	<li>Bestimmen Sie die Konzentration des Proteins mit einem Bradford Protein Assay Kit.</li>
</ol>5. Extrahieren Sie DNA aus Zellen und Digest DNA in einem einzigen Nukleosid mit Hilfe von Enzymen
<ol><li>Sammeln Sie die Zellen mit Trypsin, wie in den Schritten 3.1.1 und 3.1.2 beschrieben.</li>
	<li>Führen Sie die DNA-Extraktion mit den genomischen DNA-Reinigung-Kit nach den Anweisungen des Herstellers.</li>
	<li>Speichern Sie die extrahierte DNA in 1 mL Zentrifuge Röhren. 100 µL Reinstwasser in die Zentrifugenröhrchen einfügen und die DNA durch pipettieren etwa 15 Mal auflösen. Die Konzentration ermitteln und bewerten die Qualität der DNA durch die Messung der Absorption bei 260 nm und 280 nm15. Die DNA-Konzentration beträgt etwa 500 ng/µL.</li>
	<li>Digest 5 µg DNA in einem 50 µL Lösung System: Fügen Sie 5 µL 100 mm Tris-HCl-Lösung, pH 7.6 (Endkonzentration: 10 mM), 2 U Kalb intestinale Phosphatase, 1 U DNase I, 0,005 U snake Venom Phosphodiesterase ich und 5 µg DNA (das zusätzliche Volumen entsprechend der gemessenen berechnen Rote DNA-Konzentration, ~ 10 µL) in ein Zentrifugenröhrchen und erhöhen das Volumen der Lösung zu 50 µL mit Reinstwasser. Über Nacht inkubieren Sie die Mischung bei 37 ° C. Zentrifugieren Sie die verdaute DNA-Lösung bei 1.000 g und Raumtemperatur für 1 min um die Lösung am Ende der Rohre zu sammeln.</li>
	<li>Die verdaute DNA-Lösung aus der Zentrifuge Rohre in Ultrafiltration Röhren übertragen (ein Molekül Gewicht cutoff: 3 kDa) und Zentrifuge bei 13.000 g und 4 ° C für 30 min, die Verdauung Enzyme zu entfernen.</li>
	<li>
5mC und 5hmC Analyse der Proben vorbereiten.
	<ol>
<li>Für die 5hmC Analyse: pipettieren 36 µL Filterlösung für eine neue Zentrifuge tube (1 mL) und fügen Sie 4 µL 5'-(hydroxymethyl-d3)-2'-Deoxycytidine ([D3]-5hmC) mit der Endkonzentration von 3 nM.</li>
		<li>5mC Analyse: das Rohr (50-fold Verdünnung), aufgrund der hohen Dichte an 5mC in genomischer DNA 196 µL Reinstwasser in einem neuen Zentrifugenröhrchen und pipettieren 4 µL Filterlösung hinzufügen. Übertragen Sie 36 µL der verdünnten Lösung zu einem neuen Zentrifugenröhrchen geben und 4 µL (5'-(methyl-d3)-2'-Deoxycytidine ([D3]-5mC) mit der Endkonzentration von 50 nM. Verwendung [D3]-5hmC und [D3]-5mC als interner Standard, 5hmC und 5mC, bzw. zu kalibrieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Übertragen Sie die Beispiellösung auf Messrohre und Lagerung bei 4 ° C. Analysieren Sie 5mC und 5hmC mit ultra-high-Performance liquid Chromatography-Triple Quadrupol-Massenspektrometrie mit Multiple-Reaktionskontrolle (UHPLC-MS/MS (MRM)) wie in einem früheren Bericht15beschrieben.</li>
</ol>6. analysieren 5mC und 5hmC mit UHPLC-MS/MS-15
<ol><li>
Richten Sie verschiedene Parameter für die Analyse 5mC und 5hmC mit Hilfe der UHPLC-MS-Software.
	<ol>
<li>Eine neue Methode zu etablieren. Öffnen Sie die Software und klicken Sie auf "Datei | Neu | Methode". Zeigen Sie dem Meldungsfeld "Methode Editor" mit dem Inhalt "Möchten Sie die Änderungen für die aktuelle Methode speichern" und klicken Sie auf "Nein".</li>
		<li>Bauen Sie die Parameter des Samplers. Klicken Sie auf "Sampler | Setup | Injection". Wählen Sie "Standard-Injektion" und geben Sie "5 µL bei Injektionsvolumen".</li>
		<li>Die Parameter der Pumpe in UHPLC zu bauen.<ol>
<li>Klicken Sie auf "BinPump2 | Setup", um die Parameter der Pumpe zu bauen. "Flow" auf "0,25 mL/min" und "Endzeit" "15 min" eingerichtet.</li>
			<li>Richten Sie "Lösungsmittel B bei 5 %" und "Grenzen" in "Max 600 Bar".</li>
			<li>Klicken Sie auf "BinPump2 | Fahrplan"der isokratischen Elution Parameter für 5mC Analyse bauen. Klicken Sie auf "Anfügen", um eine Zeile hinzuzufügen. Geben Sie "0,00" in "Time" und "5.0" auf "B %". Klicken Sie auf "Append" einmal mehr um eine neue Zeile hinzuzufügen. Geben Sie "15,00" zur "Zeit" und "5.0" auf "B %".</li>
			<li>Klicken Sie auf "BinPump2 | Fahrplan", die Gradienten Elution Parameter für 5hmC Analyse zu bauen. Klicken Sie auf "Anhängen, um eine Zeile hinzuzufügen. 0.00 bei Zeit und 5.0 "B %" eingeben. Klicken Sie auf "Append" einmal mehr um eine neue Zeile hinzuzufügen. Geben Sie "3,00" zur "Zeit" und "5.0" auf "B %". Klicken Sie auf "Anfügen" für weitere 6 mal 6 Zeilen hinzufügen. Geben Sie "3.01" bei "Time" und "15,0" bei "B %", "6.00" bei "Time" und "15,0" bei "B %", "6.01" zur "Zeit" und "100" "B %", "10,00" zur "Zeit" und "100,0" bei "B %", "10.01" bei "Time" und "5.0" auf "B %", "15,00" zur "Zeit" und "5.0" auf "B %" in Folge. Hinweis: Führen Sie die Analyse der 5mC und 5hmC individuell aufgrund der Trennung der verschiedenen Bedingungen der UHPLC.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Die Parameter der Temperatur der Spalte Fach (TCC) in UHPLC zu bauen. Klicken Sie auf "TCC | Setup | Temperatur (links) "und"30 ° C"eingeben.</li>
		<li>Legen Sie die Parameter der QQQ-MS/MS.<ol>
<li>Klicken Sie auf "MS QQQ | Zeit anhalten | Kein Limit/als pump"," Ionenquelle | ESI"," Zeit Filtern | Peak-Breite: 0,07 min ". Richten Sie "Zeit Segmente: Startzeit: 0"; "Scan-Typ: MRM"; "Div Wert: ms"; "Delta EMV (+): 200" und "Delta EMV (-): 0".</li>
			<li>Bauen Sie die Parameter der Überwachung die Übergänge der 5mC, D3-5mC, dC, 5hmC und D-3-5hmC<ol>
<li>Klicken Sie auf "MS QQQ | Erwerb | Scan-Segmente: wohnen: 90"; "Fragmentor: 90"; "Kollision Energie: 5"; "Handy-Beschleuniger Spannung: 4" und "Polarität: Positive".</li>
				<li>Geben Sie "5mC" auf "Zusammengesetzte Name", "242" at "Vorläufer Ion", "126" auf "Produkt-Ion" für 5mC Analyse. Klicken Sie die Rechte Maustaste und wählen Sie "Zeile hinzufügen" um eine neue Zeile hinzuzufügen. Eingabe "D-3-5mC" bei "Zusammengesetzte Name", "245" at "Vorläufer Ion", "129" auf "Produkt-Ion" für D3-5mC Analyse.</li>
				<li>Ergänzung einer anderen drei Zeilen mit dem gleichen Modus. Geben Sie "dC", "Zusammengesetzte Name", "228" at "Vorläufer Ion", "112" auf "Produkt-Ion" für dC-Analyse. Geben Sie "5hmC" bei "Zusammengesetzte Name", "258" at "Vorläufer Ion", "142" auf "Produkt-Ion" für die 5hmC Analyse. Eingang D3-5hmC auf zusammengesetzte Namen, "261" at "Vorläufer Ion", "145" auf "Produkt-Ion" für D-3-5hmC-Analyse.</li>
			</ol>
</li>
			<li>Bauen Sie die Parameter für die Gasquelle. Klicken Sie auf "MS QQQ | Quelle | Source-Parameter: Gas Temp: 300 ° C "; "Gas-Flow: 11 L/min"; "Vernebler: 15 Psi"; "Positiv-Kapillare: 3500 V".</li>
			<li>Speichern Sie die vorgeschlagene Methode. Klicken Sie auf "MS QQQ | Instruments | Save-Methode". Wählen Sie einen Pfad für die vorgeschlagene Methode von "Directory" und geben Sie einen Namen für die Methode durch die Eingabe der Inhalte in "Methode", zum Beispiel: 5mC und 5hmC Analyse.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
UHPLC-Trennung und MS/MS-Analyse von mononucleosides
	<ol>
<li>Vorbereiten die mobile Phase für 5mC und Cytosin (C) Analyse: bilden die mobile Phase der Lösung A und B. Lösung A: 500 mL Reinstwasser mit 500 µL der Ameisensäure (Endkonzentration: 0,1 %), und Lösung B: 500 mL 100 % Methanol. Mischen Sie Lösung A und B bei 95:5 (V: V) der mobilen Phase zu eluieren 5mC und C (festgelegt im Schritt 6.1.3.3). Legen Sie die Durchflussmenge bei 0,25 mL/min (festgelegt im Schritt 6.1.3.1).</li>
		<li>Bereiten Sie die mobile Phase durch Lösungsmittel A und B für die 5hmC Analyse. Solvent A ist 2,0 mM NH4HCO3 wässrige Lösung (pH 9,0) (500 mL), und Lösungsmittel B ist 100 % Methanol (500 mL). Separate 5hmC durch eine optimierte Gradienten Elution: 0-3 min, 5,0 % B und 95 % pro (V: V); 3-6 min, 15,0 % B und 85 % A; 6-10 min, 100 % B; 10-15 min, 5,0 % B und 95 % A (festgelegt im Schritt 6.1.3.4). Legen Sie die Durchflussmenge bei 0,25 mL/min (festgelegt im Schritt 6.1.3.1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Nutzen Sie Elektrospray MS/MS mit MRM-Modus (im Schritt 6.1.5.1) analysieren die Elution aus der Spalte und Annahme des positiven Ionen-Modus (festgelegt im Schritt 6.1.5.2.1).
	<ol>
<li>Die Übergänge zu überwachen: 5mC, m/Z 242→126 (Aufprallenergie, 5 eV); [D3]-5mC, m/Z 245→129 (5 eV); dC, m/Z 228→112 (5 eV); 5hmC, m/Z 258→142 (5 eV); [D3]-5hmC, m/Z 261→145 (5 eV) (Set im Schritt 6.1.5.2.2).</li>
		<li>Die Kapillare und Fragment Spannungen am +3,500 V (festgelegt im Schritt 6.1.5.3) und 90 V (festgelegt im Schritt 6.1.5.2.1), beziehungsweise.</li>
		<li>Das Injektionsvolumen auf 5 µL und analysieren Sie jede Probe 3 mal (festgelegt im Schritt 6.1.2). Setzen Sie die entsprechenden standard Kurven, die Menge an 5mC und 5hmC zu bewerten.<ol>
<li>Die Standardkurve 5mC zu etablieren: 1 – 50 nM übertragen (1, 5, 10, 20, 50 nM, Endkonzentration) standard-Lösung von 5mC in Zentrifuge Rohre und fügen Sie 50 nM [D3]-5mC Rohre. Ergänzung das Gesamtvolumen zu 50 µL. führen Sie die Analyse der standard 5mC folgen Sie den Anweisungen für die 5mC Probe (Schritt 6).</li>
			<li>Bauen die Standardkurve von 5hmC: 1-20 nM übertragen (1, 2, 5, 10, 20 nM, Endkonzentration) Standardlösung von 5hmC Zentrifugieren Sie Rohre und fügen 3 nM [D3]-5hmC an den Rohren. Ergänzung das Gesamtvolumen zu 50 µL. führen Sie die Analyse von standard 5hmC folgen Sie den Anweisungen für die 5hmC Probe (Schritt 6).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Analyse der statistischen Signifikanz
<ol><li>
Durchführen Sie die statistische Auswertung mit Software.
	<ol>
<li>Öffnen Sie die Software und wählen Sie "Spalte" in "neue Tabelle & Grafik". Legen Sie die Parameter wie folgt: "Beispieldaten | Beginnen Sie mit einer leeren Tabelle"; "Wählen Sie einen Diagramm der ersten Mode"; "Grafik-Wiederholungen oder Fehlerbalken | Plot | Mit SEM bedeutet".</li>
		<li>Klicken Sie auf "Erstellen", um die drei Wiederholungen der Kontroll- und Vc/PD0325901-behandelten Gruppe in der Zeile "A" und "B" bzw. einzugeben. Wählen Sie die sechs Daten und klicken Sie auf "Analysieren" in der "Analyse".</li>
		<li>Wählen Sie"t -Tests (und Nichtparametrische Tests)" in "Spalte Analysen", und klicken Sie auf "OK", um die nächste Schnittstelle zu öffnen.</li>
		<li>Legen Sie die Parameter wie folgt: "Choose Test | Name des Tests | Ungepaarten t -Test; Optionen | Zwei-tailed"; "Konfidenzintervalle: 95 %"; "Signifikante Ziffern | Zeigen Sie 4 signifikante Ziffern." Klicken Sie auf "OK", um den p -Wert zwischen der Steuerung und Vc/PD0325901 Behandlung zu erwerben.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Auswertung die statistische Signifikanz zwischen dem Steuerelement und den experimentellen Gruppen beschäftigt die zweiseitigen und ungepaarten Student t-test16. Hinweis: p < 0,05 bezeichnet den Unterschied statistischen Signifikanz besitzen. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001.</li>
</ol>

<ol><li>Evans, M. J., Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+in+culture+of+pluripotential+cells+from+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos.</a> Nature. 292 (5819), 154-156 (1981).</li>
<li>Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryo-derived+stem+cells%3A+of+mice+and+men%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Embryo-derived stem cells: of mice and men.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 17, 435-462 (2001).</li>
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Die Autoren offenbaren keine Interessenkonflikte.

In der Arbeit haben wir eine neuartige Methode der Kombination von Vc und PD0325901 um Maus-ES-Zellen in einem undifferenzierten und hypomethyliert Zustand aufrecht zu erhalten, die durch eine synergistische Wirkung der Förderung der DNA Demethylierung von Vc und unterdrücken de Novo DNA erreicht wurde gezeigt. Methylierung von PD0325901. Darüber hinaus zeigte ES-Zellen große Morphologie unter dem Vc/PD0325901-Kultur-System.
Um besser den Zustand der Maus-ES-Zellen in das Vc/PD0325901...

ES-Zellen stammen vom ICM einer Blastozyste1. Die Zellen sind in einem Zustand der Pluripotenz und alle somatischen Abstammungen und Germline Zellen2bilden können. Einrichtung von ES-Zellen bietet die Möglichkeit zur Entwicklung zu untersuchen in-vitro- Verfahren und medizinische Relevanz für die regenerative Medizin, basierend auf ihre Pluripotenz3Zellen zu generieren.
Zwei Gruppen seminally der Maus-ES-Zell-Linien im Jahr 1981 gegründet und wenn Zellen aus der frühen Maus-Embryo im fetalen bovine Serum (FBS) kultiviert wurden-mit Medium mit Maus embryonalen Fibroblasten (MEFs) als Feeder Layer1,4 . MEFs mitotically inaktiviert wurden und wurden bereits in Gerichte vor der Kultivierung Embryonaler Stammzellen angebaut. MEFs bieten Unterstützung für Maus-ES Zellhaftung und produzieren Wachstumsfaktoren zur Förderung der Verbreitung und der Differenzierung5, zu unterdrücken, während FBS wesentliche trophische Faktoren und Hormone für die Zellproliferation bietet. Nachfolgende Studien gezeigt, dass LIF von Feeder-Zellen produziert die wichtigen Zytokin für Selbsterneuerung und Aufrechterhaltung der Pluripotenz in ES-Zellen wurde, und die Zugabe von LIF in das Medium Feeder Zellen6ersetzen könnte. Derzeit ist die Erhaltung der Maus-ES-Zellen in FBS/LIF Medium Feeder noch die standard-Methode von vielen Forschern angenommen. Ergeben sich jedoch einige Probleme mit diesem Ansatz der klassischen Kultur. Erstens, Feeder-Zellen sezernieren übermäßige und unkontrollierte Faktoren und pathogenen Verunreinigungen7verursachen. Zur Vermeidung von dieser Interferenzen, Beschichtung der Oberfläche der Gerichte mit Gelatine und die Zugabe von LIF in Serum-haltigen Medium sind alternative Methoden für die Aufrechterhaltung der Maus-ES-Zellen ohne Feeder-Schicht Zellen. Zusätzlich, zeigen ES-Zellen unter Serum/LIF Bedingungen gewachsen morphologische Heterogenität in Zell-Populationen und sogar in die Expression von Pluripotenz-bezogene Faktoren8. Neuere Studien legen nahe, dass Serum/LIF Bedingungen der Pluripotenz-bezogene Kern Transkriptionsfaktoren (einschließlich OCT4, SOX2 und Nanog) der Pluripotenz durch LIF und WNT signalisieren aufrecht erhalten können; Bemerkenswert ist, aktivieren sie jedoch auch ein Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF) Signal an Differenzierung8auslösen. Aufgrund der ambivalente duale Wirkung von den Kern-Transkriptionsfaktoren präsentieren ES-Zellen kultiviert im Serum Heterogenität, bestehend aus zwei austauschbare Populationen, eine ähnlich ICM und anderen ähnlich grundiert Epiblast Stand8. Darüber hinaus weisen Maus-ES-Zellen im Serum häufig global Hypermethylation9, während ICM und PGCs in einem globalen hypomethyliert Zustand sind, die eng mit ihrer Pluripotenz9,10.
Es gibt eine hohe Nachfrage, neue Methoden zur Kultivierung von Maus-ES-Zellen entwickeln. Einige verbesserte Protokolle wurden seit 200311 aber weiterhin einige Einschränkungen und Mängel7. Seit 2008, die kombinierte Nutzung von zwei kleinen Molekül-Kinase-Inhibitoren, PD0325901 (der Inhibitor der Mitogen-aktivierte Proteinkinase (MAPK) / extrazelluläre Signal-regulierte Kinase (ERK) (MEK)) und CHIR99021 (der Inhibitor der Glykogen-Synthase Kinase 3 (GSK3)), in N2B27 Medium mit LIF und ohne Serum hat eröffnet neue Perspektiven für Maus-Kultivierung ES12Zellen. Dieses neue definierte Medium zeichnet sich durch die Verwendung von zwei Inhibitoren (2i). Maus Embryonische Stammzellen in 2i/LIF Medium kultiviert sind homogener in Zell-Populationen und der Ausdruck der Pluripotenz Faktoren. Darüber hinaus weisen 2i/LIF-kultivierte Maus-ES-Zellen DNA-Hypomethylierung weltweit, welche kommt ICM-wie Zellen9,13. 2i Kultur hat auch so seine Nachteile. PD0325901 und CHIR99021 sind unlöslich in Wasser und in der Regel aufgelöst in Dimethyl Sulfoxid (DMSO)-basierte Stammlösung in Kulturmedium hinzuzufügen. Studien haben gezeigt, dass langfristige und niedrig dosierte Belastung von Zellen mit DMSO zu Zytotoxizität14führen kann.
Hier haben wir zwei kleine Molekül-Verbindungen genutzt und eine neue Kultur-Methode von Maus-ES-Zellen entwickelt. Die neue Kultur-Methode kombiniert Vc und MEK-Inhibitor PD0325901 zur Förderung der DNA-Hypomethylierung schnell und effektiv auf ein vergleichbares Niveau der PGC, benannt als Vc/PD0325901 Kultivierung Protokoll. Maus Embryonische Stammzellen in Vc/PD0325901-added Serum-haltigen Medium Homogenität in der Morphologie aufweisen und sind in einem Grundzustand nachhaltig. Im Vergleich zu 2i Kultur, Maus Embryonische Stammzellen unter Vc/PD0325901 Bedingungen kultiviert weisen schnellere Kinetik der DNA Demethylierung und erreichen die Hypomethylierung Ebene von PGC vergleichbar. Darüber hinaus verringert sich die Verwendung einer einzigen Hemmstoff (PD0325901) der eingangsbetrag von DMSO in Medium im Vergleich zu dem in 2i verwendet (PD0325901/CHIR99021) und reduziert den Schaden auf Zellen.

<table><tbody><tr><td>fötales Rinderserum Australien Quelle</td><td>Corning</td><td>35-076-CV</td><td>Bestandteil des ES-Zellmediums der Maus</td></tr><tr><td>DMEM/hoher Glukosegehalt</td><td>Hyclone</td><td>SH30022</td><td>Bestandteil des ES-Zellmediums der Maus</td></tr><tr><td>LIF</td><td>Millipore</td><td>ESG1107</td><td>Bestandteil des ES-Zellmediums der Maus</td></tr><tr><td>nicht-essentielle Aminosäuren (NEAA)</td><td>Gibco</td> 11140050 <td>Bestandteil des ES-Zellmediums</td><td></td></tr> <tr>der Maus<td>Natriumpyruvat</td><td>Gibco</td> 11360070 <td>Bestandteil des ES-Zellmediums der Maus</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td>Bestandteil des Medium der ES-Zelle der Maus</td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin Lösung</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>Bestandteil des ES-Zellmediums der Maus</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma</td><td>P5493</td><td>Zellen spülen</td></tr><tr><td>Trypsin-Hyklon</td><td></td><td>SH30042</td><td>Zelldissoziation</td></tr><tr><td>Gelatine</td><td>Sigma</td><td>48722</td><td>Schalenbeschichtung</td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Stemolecule</td><td>04-0006-10</td><td>niedermolekulare Chemikalie für die Zellkultur</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Stemolecule</td><td>04-0004</td><td>niedermolekulare Chemikalie für die Zellkultur</td></tr><tr><td>Vitamin C</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd&nbsp;</td><td>XW00508171</td><td>niedermolekulare Chemikalie für die Zellkultur</td></tr><tr><td>Ultra Bioscience Wasseraufbereitungssystem</td><td>Purelab</td><td>Ultra</td><td>Ultra Wasser</td></tr><tr><td>DMSO Sigma</td><td></td><td>D8418</td> Zentrifugation <td>des Zellgefriermediums</td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>5427R</td><td>DNA- und Proteinextraktion</td></tr><tr><td>Proteaseinhibitor-Cocktail</td><td>Sigma</td><td>P8340</td><td>Bestandteil des RIPA-Puffers</td></tr><tr><td>PMSF Proteaseinhibitor</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>36978</td><td>Bestandteil des RIPA-Puffers</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>43815</td><td>Bestandteil des RIPA-Puffers</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td>Bestandteil des RIPA-Puffers</td></tr><tr><td>Aufreinigungskit für genomische DNA</td><td>Promega</td><td>A1125</td><td>Genomische DNA-Extraktion</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NanoDrop 2000</td><td>Bestimmung der DNA-Konzentration</td></tr><tr><td>Kälberdarmphosphatase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0290</td><td>DNA-Verdau</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>New England Biolabs</td><td>M0303</td><td>DNA-Verdau</td></tr><tr><td>Schlangengift Phosphodiesterase I</td><td>Sigma</td><td>P4506</td><td>DNA-Aufschluss</td></tr><tr><td>Nanosep 3K Omega</td><td>Pall</td><td>OD003C35</td><td>Filtration von verdauter DNA</td></tr><tr><td>1290 UHPLC-System</td><td>Agilent&nbsp;</td><td>1290</td><td>UHPLC-Trennung</td></tr><tr><td>G6410B Dreifach-Quadrupol-Massenspektrometer</td><td>Agilent&nbsp;</td><td>G6410B</td><td>MS/MS-Analyse</td></tr><tr><td>Zorbax Eclipse Plus C18 Säule</td><td>Agilent&nbsp;</td><td>Zorbax Eclipse Plus</td><td>Säule für UHPLC-Abscheidung</td></tr><tr><td>5-Methylcytosin</td><td>Solarbio Life Sciences</td><td>SM8900&nbsp;</td><td>Standard 5mC</td></tr><tr><td>5-Hydroxymethylcytosin (Standard)</td><td>Toronto Research Chemicals</td><td>M295900</td><td>Standard 5hmC</td></tr><tr><td>Prdm14 Antikörper</td><td>Bioworld</td><td>BS7634</td><td>Western-Blot-Analyse-Primärantikörper</td></tr><tr><td>Dnmt3a-Antikörper</td><td>Bioworld</td><td>BS6587</td><td>Western-Blot-Analyse-Primärantikörper</td></tr><tr><td>Dnmt3b-Antikörper</td><td>abcam</td><td>ab13604</td><td>Western-Blot-Analyse-Primärantikörper</td></tr><tr><td>Dnmt3l Antikörper</td><td>abcam</td><td>ab3493</td><td>Western-Blot-Analyse-Primärantikörper</td></tr><tr><td>Dnmt1 Antikörper</td><td>abcam</td><td>ab13537</td><td>Western-Blot-Analyse-Primärantikörper</td></tr><tr><td>&beta;-Tubulin-Antikörper</td><td>Bioworld</td><td>BS1482MH</td><td>Western-Blot-Analyse-Primärantikörper</td></tr><tr><td>Ziege Anti-Kaninchen IgG</td><td></td><td>abcam ab6721</td><td>Western-Blot-Analyse-Sekundärantikörper</td></tr><tr><td>Anti-Maus-IgG-Abcam</td><td></td><td>ab6789</td><td>Western-Blot-Analyse-Sekundärantikörper</td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td>RNA-Extraktion</td></tr><tr><td>Reverse-Transkriptionssystem</td><td>Promega</td><td>A3500</td><td>RNA-Reverse-Transkription</td></tr><tr><td>GoTaq qPCR Master Mix</td><td>Promega</td><td>A6001</td><td>RT-PCR</td></tr><tr><td>StemTAG Färbung und Aktivität Assay-Kit für alkalische Phosphatase</td><td>Zellen Biolabs, Inc.</td><td>CBA-302</td><td>&nbsp; Analyse der alkalischen Phosphatase-Färbung</td></tr><tr><td>ES-Zellen der Maus: WT, 129 SvEv</td><td>Zur Verfügung gestellt von Professor Guoliang Xu (Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China)</td><td></td><td>Zellstamm von ES-Zellen der Maus</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>LSM510</td><td>Zellbeobachtung</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 5.0</td><td>GraphPad Prism Software Inc.</td><td>5.0</td><td>Statistische Auswertung</td></tr></tbody></table>

eine alternative kultur-methode, um genomische hypomethylierung von embryonalen stammzellen der maus mit mek-inhibitor pd0325901 und vitamin c aufrechtzuerhalten

An Alternative Culture Method to Maintain Genomic Hypomethylation of Mouse Embryonic Stem Cells Using MEK Inhibitor PD0325901 and Vitamin C

Embryonale Stammzellen (ES) haben das Potenzial, sich in eines der drei mikrobeschichten (Entoderm, Mesoderm und Ektoderm) differenzieren und erzeugen viele Linien für die regenerative Medizin. ES Zelle Kultur in Vitro seit langem Gegenstand weit verbreitete Bedenken. Klassisch, Maus-ES-Zellen in Serum und Leukämie hemmenden Faktor (LIF) gepflegt werden-Medium enthält. Allerdings Bedingungen Serum/LIF Zellen zeigen Heterogenität in Morphologie und das Expressionsprofil von Pluripotenz-Genen und sind meist in einem metastabilen Zustand. Darüber hinaus kultivierte ES-Zellen zeigen globale Hypermethylation, aber naiv ES-Zellen der inneren Zellmasse (ICM) und primordialen Keimzellen (PGCs) sind in einem Zustand der globalen Hypomethylierung. Der hypomethyliert Zustand des ICM und PGCs ist eng verbunden mit ihrer Pluripotenz. Zur Verbesserung der Maus-ES Zelle Kulturmethoden entwickelten wir vor kurzem eine neue Methode basiert auf der gezielt kombinierte Nutzung von zwei kleine Molekül-Verbindungen, die DNA-hypomethyliert und pluripotenten Zustand zu halten. Hier präsentieren wir die Mitbehandlung von Vitamin C (Vc) und PD0325901 können etwa 90 % der 5-Methylcytosine (5mC) an 5 Tagen in ES-Zellen löschen. Der generierte 5mC Inhalt ist vergleichbar mit dem in PGCs. Die mechanistische Untersuchung zeigt, dass PD0325901 bis Prdm14 Ausdruck Dnmt3b unterdrücken regelt (de Novo DNA-Methyltransferase) und Dnmt3l (der Cofaktor von Dnmt3b), durch die Reduzierung 5mC- de-Novo -Synthese. VC erleichtert die Umstellung der 5mC auf 5-Hydroxymethylcytosine (5hmC) katalysiert hauptsächlich durch Tet1 und Tet2, zeigt die Einbindung der passiven und aktiven DNA-Demethylations. Darüber hinaus zeigen ES-Zellen unter Vc/PD0325901 Bedingungen, homogene Morphologie und pluripotenten Zustand. Gemeinsam schlagen wir eine neuartige und Chemikalie-Synergie-Kultur-Methode für DNA-Hypomethylierung und Aufrechterhaltung der Pluripotenz in Maus-ES-Zellen zu erreichen. Die kleine Molekül chemisch-abhängige Methode überwindet die größten Schwächen der Serum-Kultur und hält Versprechen, homogene Embryonaler Stammzellen für weitere klinische Anwendungen und Forschungen zu generieren.

VC/PD0325901 induzierte synergistisch globale Löschung von ES-Zellen. Maus Embryonische Stammzellen im Serum weisen DNA Hypermethylation, während ICM pluripotenten Zellen und PGCs globale Löschung der DNA-Methylierung zeigen und der hypomethyliert Staat eng verbunden mit ihrer Pluripotenz9,10 ist.
Zuvor fanden wir und andere, dass Vc Tet-vermittelten 5mC Demethylierung<s...

Wir sind zwei Chemie-basierte Protokolle für die Kultivierung embryonalen Stammzellen der Maus ausführlich beschrieben. Diese neue Methode nutzt synergistische Mechanismen der Förderung Tet-vermittelten Oxidation (durch Vitamin C) und de-Novo -Synthese von 5-Methylcytosine (durch PD0325901) zu unterdrücken, um DNA-Hypomethylierung und Pluripotenz von embryonalen Stammzellen der Maus zu erhalten.

Eine Alternative Kultur-Methode, um genomische Hypomethylierung von embryonalen Stammzellen der Maus mit MEK-Inhibitor PD0325901 und Vitamin C aufrechtzuerhalten

Embryonic stem (ES) cells have the potential to differentiate into any of the three germ layers (endoderm, mesoderm, or ectoderm), and can generate many ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, die niedermolekularen Verbindungen PD0325901 und Vitamin C zu verwenden, um einen hypomethylierten und pluripotenten Zustand in embryonalen Stammzellen der Maus aufrechtzuerhalten. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der FBS-kultivierten embryonalen Stammzellen der Maus zu beantworten, wie z.B. die Heterogenität in der Morphologie und die Dehypermethylierung. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht also darin, dass die embryonalen Stammzellen der Maus in der Lage sind, eine ausgezeichnete Morphologie und den hypomethylierten und den undifferenzierten Zustand beizubehalten.Nach der Vorbereitung von Platten und Puffern gemäß dem Textprotokoll werden die ES-Zellen der Maus, das Kulturmedium, das Trypsin und das PBS in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius vorgewärmt. Um die Zellen zu passieren, saugen Sie das Medium aus der Schale ab und verwenden Sie zwei Milliliter PBS, um die Zellen zweimal zu spülen. Entfernen Sie dann das PBS und geben Sie 0,3 Milliliter Trypson EDTA zu den Zellen und kippen Sie die Schale schnell, um die Zellen mit der Lösung zu bedecken.Entfernen Sie sofort das Trypsin und inkubieren Sie die Platte eine Minute lang bei 37 Grad Celsius, um die Zellen zu lösen. Fügen Sie zwei Milliliter vorgewärmtes Serummedium hinzu, um das Trypsin zu inaktivieren, und verwenden Sie eine Fünf-Milliliter-Pipette, um die Zellkolonien 10 Mal in einer einzigen Zellsuspension zu resuspendieren. 150 Mikroliter der Zelllösung in eine neue, sechs Zentimeter große, mit Gelatine überzogene Schale geben und mit drei Millilitern frisch hergestelltem VCPD0325901 Medium ergänzen.Kultivieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius und fünf Prozent CO2. Aufgrund der Instabilität von Vc entfernen Sie während der Inkubation alle 24 Stunden das alte Kulturmedium und fügen drei Milliliter frisches Medium Vcpd0325901 hinzu. Nachdem Sie eine Konfluenz von 70 bis 80 Prozent erreicht haben, passieren Sie die Zellen und kultivieren Sie sie weiter, wie gerade gezeigt.Um die DNA-Extraktion durchzuführen, sammeln Sie die Zellen mit Trypsin, wie bereits gezeigt, und verwenden Sie ein genomisches DNA-Aufreinigungskit gemäß den Anweisungen des Herstellers. Geben Sie 100 Mikroliter ultrareines Wasser in das DNA-Röhrchen und lösen Sie die DNA durch etwa 15-maliges Pipettieren auf. Verwenden Sie dann ein Spektralphotometer, um das Verhältnis von Od260 zu 280 zu messen, um die Konzentration und Qualität der DNA zu bestimmen.Die DNA-Konzentration sollte etwa 500 Nonogramm pro Mikroliter betragen. Als nächstes verdauen Sie fünf Mikrogramm DNA, indem Sie sie mit fünf Mikrolitern 100 Millimolar Trishydrochlorid PH7,6, zwei Einheiten Kälberdarmphosphatase, einer Einheit Dnase und 0,005 Einheiten Schlangengift, Phosphodyesterase eins, kombinieren. Verwenden Sie dann ultrareines Wasser, um das Volumen auf 50 Mikroliter zu erhöhen.Inkubieren Sie die Reaktion über Nacht bei 37 Grad Celsius. Entnehmen Sie die Probe am nächsten Morgen durch Zentrifugation bei 1.000 x g bei Raumtemperatur für eine Minute. Füllen Sie dann die Lösung in Ultrafiltrationsröhrchen um und schleudern Sie die Proben 30 Minuten lang bei 13.000 xg und 4 Grad Celsius, um die Verdauungsenzyme zu entfernen.Um die Proben für die 5HMC-Analyse vorzubereiten, werden 36 Mikroliter des Filtrats in ein neues Ein-Milliliter-Röhrchen überführt und vier Mikroliter D35HMC für eine Endkonzentration von drei Nanomolaren hinzugefügt. Für die 5MC-Analyse pipettieren Sie 196 Mikroliter ultrareines Wasser in ein neues Zentrifugenröhrchen und fügen Sie aufgrund der hohen Dichte von 5MC in der genomischen DNA vier Mikroliter Filtrat hinzu. 36 Mikroliter der verdünnten 5MC-Lösung werden in ein neues Zentrifugenröhrchen überführt und vier Mikroliter D35MC für eine Endkonzentration von 50 Nanomolar hinzugefügt.Verwenden Sie D35HMC und D35MC als interne Standards, um 5HMC bzw. 5MC zu kalibrieren. Nachdem Sie die Parameter für die Analyse von 5MC und 5HMC in der UHPLCMS-Software gemäß dem Textprotokoll eingerichtet haben, legen Sie die Parameter für QQQMSMS fest, indem Sie auf MS QQQ klicken. Wählen Sie für die Stoppzeit No limit/As Pump (Keine Begrenzung/Als Pumpe).Wählen Sie für Ionenquelle ESI aus. Aktivieren Sie für die Zeitfilterung die Option Spitzenbreite und geben Sie 0,07 Minuten ein. Um die Zeitsegmente einzurichten, wählen Sie für die Startzeit die Option Null aus.Um den Scanmodus in MRM so festzulegen, dass die Anspielung aus der Spalte analysiert wird, wählen Sie für Scantyp die Option MRM aus. Wählen Sie für Div Value die Option To MS aus. Geben Sie für Delta EMV plus 200 ein, und geben Sie für Delta EMV minus Null ein. Erstellen Sie die Parameter für die Überwachung der Übergänge, indem Sie zuerst auf MSQQQ one acquisition klicken.Geben Sie zum Festlegen von Scan-Segmenten für Verweildauer den Wert 90 ein. Um die Fragmentspannungen für den Fragmentor festzulegen, geben Sie 90 ein. Geben Sie für Kollisionsenergie fünf ein.Geben Sie für die Zellbeschleunigerspannung vier ein. Um den positiven Ionenmodus festzulegen, wählen Sie für Polarität die Option positiv aus. Um die UHPLC-Trennung von Mononukleosiden durchzuführen, bereiten Sie die Lösungen a und b für die Anspielung von 5MC und Cytosin vor, indem Sie 500 Milliliter Reinstwasser mit 500 Mikrolitern Ameisensäure für Lösung a mischen.Messen Sie dann 500 Milliliter 100 % Methanol und Lösung b. Mischen Sie Lösung a und Lösung b mit einem Volumen-Volumen-Verhältnis von 95 zu fünf als mobile Phase, um 5MC und C zu eluieren. Stellen Sie dann die Durchflussrate auf 0,25 Milliliter pro Minute ein. Trennen Sie 5HMC durch eine optimierte Gradientenanspielung.Stellen Sie dann die Durchflussmenge auf 0,25 Milliliter pro Minute ein. Überwachen Sie die Übergänge für 5MC, D35MC, DC, 5HMC und D35HMC. Stellen Sie die Kapillarspannungen auf 3.500 Volt ein.Stellen Sie dann das Injektionsvolumen auf 5 Mikroliter ein und analysieren Sie jede Probe dreimal. Verwenden Sie die entsprechenden Standardkurven, um die Menge an 5MC und 5HMC gemäß dem Textprotokoll zu bewerten. Wie in dieser Analyse der genomischen DNA in ES-Zellen der Maus mittels UHPLC-MSMS zu sehen ist, führte die Behandlung mit VcPD0325901 zu einem schnelleren Rückgang der DNA-Methylierung und erreichte nach fünf Tagen stabile MC-Spiegel von fünf Metern, während die Behandlung mit Vc2i an Tag 11 zu einem vergleichbaren Niveau führte.Diese Grafik zeigt, dass die Vc-haltige Behandlung die 5HMC-Häufigkeit nach einem Tag drastisch erhöhte und danach die 5HMC-Spiegel aufgrund einer fortschreitenden Reduktion des 5MC-Substrats allmählich abnahmen. Die Western-Blot-Analyse zeigte, dass Prdm14 signifikant erhöht war, während Dnmt3b und sein Co-Faktor Dnmt3l erheblich herunterreguliert waren, wenn Zellen mit PD0325901 zurückgingen, was auf die Wirkung von PD0325901 bei der Löschung von 5MC hinweist. In diesem alkalischen Phosphatase-Assay wurden alle ES-Zellen der Maus violett gefärbt, wenn sie 26 Tage lang in VcPD032590 kultiviert wurden, was auf einen undifferenzierten Zustand hinweist.Im Gegensatz dazu erschienen Zellen, die in FBS gezüchtet wurden, die nur Medium enthielten, eine helle Farbe, wobei eine partielle Ausbreitung auf eine partielle Differenzierung hindeutete. Einmal gemeistert, kann diese Technik in fünf Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, dass FBS vorab überprüft werden muss.Vermeiden Sie es außerdem, Zellen zu stark durch den Durchgang zu pipettieren und das Kulturmedium VcPDO325901 täglich zu wechseln. Nach dieser Entwicklung ebnet diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Kultivierung von ES-Zellen der Maus in vitro, um die Entwicklung und die Prozesse von Embryonen in vitro und die erzeugten Zellen von medizinischer Relevanz für die regenerative Medizin zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein besseres Verständnis dafür haben, wie Sie die Wachstumsmorphologie und den hypermethylierten und pluralen potenten Zustand für ES-Zellen der Maus aufrechterhalten können, indem Sie zwei kleine molekulare Komponenten, den MEK-Inhibitor PD0325901, verwenden.Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Trisol, DMS oder PMS und dem DTT äußerst gefährlich sein kann und die Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen, einer Maske und der Schutzbrille bei der Durchführung dieses Verfahrens immer getroffen werden sollten.

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Eine Alternative Kultur-Methode, um genomische Hypomethylierung von embryonalen Stammzellen der Maus mit MEK-Inhibitor PD0325901 und Vitamin C aufrechtzuerhalten (Video) | JoVE Journal

Eine Alternative Kultur-Methode, um genomische Hypomethylierung von embryonalen Stammzellen der Maus mit MEK-Inhibitor PD0325901 und Vitamin C aufrechtzuerhalten

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