Gepoolte ShRNA Bildschirm für die Reaktivierung des MeCP2 auf dem inaktiven X-Chromosom

Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Präparation von Maussehnenfibroblasten, wie im Textprotokoll beschrieben. Ernten Sie die Zellen aus einer 10 Zentimeter großen Platte, indem Sie zuerst das Medium ansaugen. Fügen Sie dann einen Milliliter 0,05 % Trypsin-EDTA hinzu und inkubieren Sie zwei bis fünf Minuten bei 37 Grad Celsius.

Nach der Inkubation wird das Trypsin mit neun Millilitern DMEM-10 abgeschreckt und die resuspendierten Zellen in einem konischen 15-Milliliter-Röhrchen gesammelt. Verdünnen Sie die Zellen mit DMEM-10 auf eine Endkonzentration von einer Zelle pro 100 Mikroliter. Übertragen Sie dann die Zellen auf 96-Well-Platten, indem Sie 100 Mikroliter der Suspension in jede Vertiefung pipettieren.

Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius, bis die Vertiefungen zusammenfließen, was bis zu zwei bis drei Wochen dauern kann. Ersetzen Sie das Medium alle drei bis fünf Tage durch frisches DMEM-10. Wenn sie zusammenfließen, mobilisieren Sie die Zellen mit 20 Mikrolitern 0,05 % Trypsin-EDTA pro Vertiefung und teilen Sie sie in zwei doppelte Sätze von 96-Well-Platten auf.

Assay für die Luciferase-Aktivität in einem Satz Platten. Verwenden Sie einen homogenen Firefly-Luciferase-Assay, der keine Entfernung des Mediums erfordert, gemäß dem Protokoll, das im Luciferase-Assay-Kit enthalten ist. Verwenden Sie die Assay-Ergebnisse, um Klone ohne nachweisbare Luciferase-Aktivität aus dem verbleibenden Satz von Platten auszuwählen.

Erweitern Sie diese Klone zuerst auf eine 24-Well-Platte und dann auf eine Sechs-Well-Platte. Führen Sie dasselbe für einen Klon mit der höchsten Luciferase-Aktivität aus. Dies wird als Positivkontrolle zu Validierungszwecken verwendet.

Nach der Expansion in der Sechs-Well-Platte wird ein Aliquot jeder Well für einen Western Blot geerntet. Mobilisieren Sie die Zellen mit 200 Mikrolitern 0,05% Trypsin EDTA. Inkubieren Sie die Zellen für zwei bis fünf Minuten bei 37 Grad Celsius.

Schrecken Sie die Zellen mit zwei Millilitern DMEM-10 ab und übertragen Sie die Hälfte der Zellen auf eine weitere Sechs-Well-Platte. Warten Sie, bis sich die Zellen an der Unterseite der Platte festsetzen. Waschen Sie dann die Zellen einmal mit PBS, bevor Sie für den Western Blot lysieren.

Platten Sie mehrere negative Klone mit 0,2 Millionen Zellen pro Well in einer Sechs-Well-Platte. Behandeln Sie die Zellen einmal mit 10 mikromolaren 5-Azacytidin. Inkubieren Sie dann 72 Stunden lang, ohne das Medium zu wechseln, bevor Sie wie zuvor auf Luziferase-Aktivität testen.

Wählen Sie als Nächstes einen negativen Klon aus, der Luziferase-Aktivität mit 5-Azacytidin für den Bildschirm gewonnen hat, und beginnen Sie, ihn auf mehrere 10-Zentimeter-Platten zu erweitern. Frieren Sie die verbleibenden negativen Klone als Backup in flüssigem Stickstoff ein. Der positive Klon kann in der Gewebekultur aufbewahrt oder bis zur weiteren Verwendung eingefroren werden.

Morgens plättieren Sie eine Million inaktive X-Zellen auf 10 Zentimeter große Gewebekulturplatten. Infizieren Sie die Platten am Nachmittag, indem Sie das Medium durch frisches DMEM-10 ersetzen, das eine vorher festgelegte Menge an Virusüberstand und fünf bis 10 Mikrogramm pro Milliliter Polybren enthält. Nach 18 bis 24 Stunden aspirieren Sie das Medium und geben Sie 10 Milliliter frisches DMEM-10 auf jede Platte.

Kulturplatten für weitere 48 Stunden. Mobilisieren Sie die Zellen morgens mit einem Milliliter 0,05 % Trypsin-EDTA pro Platte und löschen Sie die Zellen mit 9 Millilitern DMEM-10 pro Platte. Lassen Sie die Suspension durch einen 100-Mikron-Maschensiebfilter laufen.

Ziehen Sie die gefilterten Suspensionen zusammen und säen Sie zwei Sätze von 10-Zentimeter-Platten mit einer Million Zellen pro Platte. Ersetzen Sie am Nachmittag das Medium in einem Satz Platten durch DMEM-10, das 15 Mikrogramm pro Milliliter Hygromycin enthält, B.In das andere Set das Medium nur durch frisches DMEM-10 ersetzen. Mobilisieren Sie nach 48 Stunden die Zellen aus unbehandelten Hygromycin B-Platten mit einem Milliliter 0,05 % Trypsin-EDTA.

bis fünf Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Als nächstes löschen Sie die Zellen mit 9 Millilitern DMEM-10. Entnehmen Sie die einzelnen Proben und fahren Sie sofort mit der DNA-Extraktion fort.

Kultivieren Sie das Hygromycin B-Selektionsset für weitere sechs Tage und füllen Sie das Selektionsmedium jeden zweiten Tag mit frischem DMEM-10 auf, das Hygromycin B enthält. Ersetzen Sie am sechsten Tag die Auswahlmedien nur durch frisches DMEM-10. Warten Sie vier Tage für die Genesung und ernten Sie dann wie zuvor die DNA der Probe nach der Auswahl.

Fahren Sie fort, um Haarnadeln zu identifizieren, die in den Nachauswahlproben angereichert sind, wie im Textprotokoll beschrieben. Um die Treffer zu validieren, säen Sie zunächst acht Millionen 293-FT-Zellen pro Platte auf 10-Zentimeter-Platten. Ersetzen Sie das Medium am nächsten Tag 30 Minuten vor der Durchtrennung durch neun Milliliter antibiotikafreies DMEM-10 pro Platte.

Fügen Sie als nächstes 0,5 Milliliter Transfektionsmischung eins zu jedem Aliquot der Transfektionsmischung zwei hinzu und mischen Sie vorsichtig durch Pipettieren. Dann die Mischung 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Tragen Sie die Mischung tropfenweise auf jeden Teller auf und schwenken Sie den Teller vorsichtig, um ihn zu mischen.

Ersetzen Sie am nächsten Tag das Medium durch fünf Milliliter frisches DMEM-10,48 Stunden nach der ersten Transfektion, sammeln Sie den lentiviralen Überstand und lassen Sie ihn durch einen 0,22-Mikron-Filter laufen, der mit DMEM-10 vorbefeuchtet wurde, um die Wiederherstellung zu maximieren. Am nächsten Morgen werden 0,1 Millionen inaktive X-Zellen pro Vertiefung auf sechs Vertiefungsplatten aufgefüllt. Infizieren Sie am Nachmittag die Platten, indem Sie das Medium durch zwei Milliliter frisches DMEM-10 ersetzen, das lentiviralen Überstand und fünf bis 10 Mikrogramm pro Milliliter Polybren enthält.

Infizieren Sie eine Kontrollvertiefung mit einem viralen Überstand, der aus einem leeren lentiviralen Vektor hergestellt wurde. Ersetzen Sie das Medium am nächsten Tag durch zwei Milliliter DMEM-10, die ein Milligramm pro Milliliter Puromycin enthalten. Verwenden Sie die Auswahl für vier Tage.

Ersetzen Sie das Medium nach vier Tagen durch zwei Milliliter frisches DMEM-10 und warten Sie 48 bis 72 Stunden für die Genesung. Nachdem Sie die Zellen mit 150 Mikrolitern 0,05%igem Trypsin-EDTA mobilisiert haben, inkubieren Sie sie zwei bis fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Die Zellen werden mit 1,5 Millilitern DMEM-10 abgeschreckt, bevor sie in konische Röhrchen überführt und 10 Minuten lang bei Raumtemperatur bei 500 mal G zentrifugiert werden.

Entfernen Sie das Medium und resuspendieren Sie die Zellen in 100 Mikrolitern Lysepuffer, der im Luciferase-Assay-Kit enthalten ist. Inkubieren Sie die Suspension fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Übertragen Sie die Suspension nach fünf Minuten auf eine weiße 96-Well-Platte.

Führen Sie den Assay in der Dunkelkammer gemäß dem im Kit enthaltenen Protokoll durch. Verwenden Sie aktive X-Zellen als Positivkontrolle und negative X-Zellen, die mit einem leeren lentiviralen Vektor infiziert sind, als Negativkontrolle. Immortalisierte Fibroblastenklone von Maussehnen zeigen entweder eine positive oder eine negative Firefly-Luciferase-Aktivität, die mit der Platzierung des Reporters auf dem aktiven bzw. inaktiven X-Chromosom übereinstimmt.

Die MeCP2-Expression, wie sie durch den Western Blot bestimmt wird, weist das reziproke Muster auf. Beachten Sie, dass die Luciferase-Aktivität von Firefly bei negativen Klonen durch Verabreichung von 5-Azacitidin induziert werden kann. Wenn das Hygromycin-Resistenzgen auf dem aktiven X-Chromosom vorhanden ist, bietet es einen Überlebensvorteil bei der Hygromycin-Selektion im Vergleich zu den Zellen mit dem Gen auf dem inaktiven X-Chromosom.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie ein Screening für Regulatoren der X-Chromosomen-Inaktivierung mit Reportern entwerfen und durchführen, die selektiv auf inaktives X-Chromosom eingefügt werden. Mein Labor hat bereits Berichte über Basen-Screenings für Chromatinregulatoren in Hefe durchgeführt, und unser Erfolg mit diesem Ansatz hat mich dazu inspiriert, dieses Screening für Regulatoren der X-Chromosomen-Inaktivierung in Säugetierzellen zu entwickeln. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden, wie z. B. die Verwendung kleiner, interferierender RNAs, CRISPR und kleiner Moleküle durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur Inaktivierung des X-Chromosoms in Säugetierzellen zu beantworten.