Name: Gepoolte ShRNA Bildschirm für die Reaktivierung des MeCP2 auf dem inaktiven X-Chromosom (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 15 s
Description: Lernen Sie einen gepoolten shRNA-Bildschirm zur Identifizierung von Regulatoren der X-Chromosom-Inaktivierung in murinen Fibroblasten. Diese Methode nutzt MeCP2-Reporter und Next-Generation-Sequencing.

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Wir bedanken uns bei Ross Dickins von der University of Melbourne für die Bereitstellung von gnädig der ShRNA-Bibliothek auf dem Bildschirm verwendet. Diese Arbeit wurde durch die Rett Syndrome Research Trust (A.B) finanziert.

Alle Schritte, bei denen Tiere wurden durchgeführt mit Protokollen vom Fred Hutchinson Cancer Research Center institutionelle Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) genehmigt. Keine Reagenzien hier bekanntermaßen erhebliche menschliche Gesundheitsrisiken außer 5-Azacytidine (5-AZA) darstellen.
1. erzeugen eine Reporter-Zell-Linie mit MeCP2- LUC-HR Transgen auf der Xi
<ol><li>
Vorbereitung der Maus Sehne Fibroblasten von einer Frau XMeCP2-LUC- HR/xMeCP2 Maus
	<ol>
<li>Einschläfern täglich 10-12-alt weiblich XMeCP2-LUC-HR/xMeCP2 Maus.</li>
		<li>Mit geraden Dissektion Schere, machen Sie einen umlaufenden Schnitt durch die Haut des proximalen Heck Teil.</li>
		<li>Halten Sie den Kadaver in der Nähe der Schwanzwurzel, ziehen Sie die Haut von der Maus, die Fibrocartilaginous Teil des Hecks verfügbar zu machen. Entfernen und die Klemme 10 mm des exponierten Gewebes in 1 mm langen Fragmente mit einem chirurgischen Skalpell schneiden.</li>
		<li>Übertragung der fragmentierte Gewebe eine 15 ml konische Rohr mit 5 mL der Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM) ergänzt mit 1 U/mL Penicillin, 1 µg/mL Streptomycin und 1,5 mg/mL Kollagenase, vorgefiltert durch 0,45 µm und dann 0,2 µm Netz Filter. 3-4 h bei 37 ° C mit kontinuierliche Rotation inkubieren.</li>
		<li>Zentrifuge die Probe bei Raumtemperatur bei 500 X g für 10 min. Aufschwemmen das Pellet in 10 mL DMEM mit 10 % fötalen Rinderserum, 1 U/mL Penicillin und 1 µg/mL Streptomycin (DMEM-10) und Platte auf einer Gewebekultur 6-Well-Platte ergänzt. Durchgang der Zellen einmal und erweitern, um einen 10 cm Teller, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren.</li>
		<li>Verewigen Sie die Zellen durch eine Transduktion mit einer Expressionsvektor tragen virale Onkogene HPV-16 (E6/E7), wie zuvor beschrieben7durchführen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Auswahl einzelner Zellklonen und Charakterisierung von MeCP2 Reporter Ausdruck
	<ol>
<li>Ernten Sie die Zellen aus einer 10 cm-Platte. Fügen Sie zuerst die Medien Aspirieren, 1 mL 0,05 % Trypsin-EDTA und 2-5 min bei 37 ° c inkubieren Ablöschen mit 9 mL DMEM-10 und die resuspendierte Zellen in einem 15 mL konische Röhrchen zu sammeln.</li>
		<li>Verdünnen Sie die Zellen mit DMEM-10, eine Endkonzentration von 1 Zelle/100 µL. Transfer zum 96-Well Platten durch Pipettieren 100 µL der Suspension in jede Vertiefung.</li>
		<li>Inkubieren Sie bei 37 ° C, bis der Brunnen Zusammenfluss, sind die bis zu 2-3 Wochen dauern kann. Ersetzen Sie die Medien mit frischen DMEM-10 alle 3-5 Tage. Wenn konfluierende, die Zellen mit 20 µL 0,05 % Trypsin-EDTA pro Bohrloch zu mobilisieren und in zwei doppelte Sätze von 96-Well Platten aufgeteilt.</li>
		<li>Verwenden Sie eine Reihe von Platten, um für Luciferase-Aktivität zu bestimmen. Verwenden Sie eine homogene Firefly Luciferase Assay Kit, die keine Medien entfernen erforderlich ist. Befolgen Sie das Protokoll mit dem Kit enthalten.</li>
		<li>Verwenden Sie die Ergebnisse aus Schritt 1.2.4 Klone ohne nachweisbare Luciferase-Aktivität aus dem restlichen Satz Platten wählen. Erweitern Sie diese Klone auf 24 wohlen und dann 6-Well-Platten.</li>
		<li>Führen Sie dasselbe für einen Klon mit der höchsten Luciferase-Aktivität; Dies wird als Positivkontrolle für Überprüfungszwecke verwendet werden.</li>
		<li>Ein Aliquot von jedem Bohrloch in der 6-Well-Platte für ein Western-Blot zu ernten. Mobilisieren Sie die Zellen mit 200 µL 0,05 % Trypsin-EDTA. 2-5 min bei 37 ° c inkubieren Ablöschen mit 2 mL DMEM-10, und die Hälfte der Zellen auf 1,5 ml Zentrifugenröhrchen übertragen. Waschen Sie die Zellen einmal mit PBS vor Lyse für Western-Blot. Alternativ übertragen Sie die Hälfte der Zellen auf ein anderes 6-Well-Platte. Wenn die Zellen an der Unterseite der Platte befestigen, Spülen mit PBS und lyse für Western-Blot.</li>
		<li>Führen Sie einen Western Blot mit Anti-MeCP2 Antikörper zu bestätigen, dass Luciferase-negativen Zellen express, während die Luciferase-positiven Zellen Wildtyp MeCP2 aus dem aktiven x-Chromosom; nicht ausdrücken, Befolgen Sie die zuvor beschriebenen Protokoll8. Als Positivkontrolle verwenden Sie Hirngewebe lysate aus jedem Wildtyp-Maus.</li>
		<li>Platte mehrere negative Klone mit 2 x 105 Zellen/Brunnen in einem 6-Well-Platte. Einmal mit 10 µM 5-AZA behandeln, inkubieren 72 h ohne Veränderung der Medien und assay für Luciferase Aktivität wie in Schritt 1.2.3 beschrieben.</li>
		<li>Wählen Sie einen negativen Klon (Xi-Klon), die Luciferase-Aktivität mit 5-AZA erworben und beginnen, mehrere 10 cm Platten erweitert. Frieren Sie die verbleibenden negativen Klone in flüssigem Stickstoff als Backup. Der positiven Klon (Xa-Klon) kann in der Gewebekultur beibehalten oder eingefroren bis zur weiteren Verwendung.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(2) screening die Bibliothek für die Reaktivierung mit Hygromycin B Auswahl
<ol><li>
Den Test-Klon zu infizieren, Auswahl anwenden und Ernte DNA Sequenzierung
	<ol>
<li>Virale Konzentrate retrovirale Konstrukte, die mit dem Ausdruck Haarnadeln aus einer ShRNA-Bibliothek erhalten, oder produziert konzentrierte virale Überstand über das Protokoll mit der gewünschten Bibliothek enthalten.</li>
		<li>Bevor Sie mit dem Bildschirm, Titrieren der Bibliothek (mit einer GLP-Markierung, falls vorhanden). Ziel für eine Vielzahl von Infektionen zwischen 0,3 und 0,5. Hinweis: Führen Sie mindestens vier unabhängigen Bildschirmen, um falsche positive Sätze zu minimieren. Verwenden Sie 20 Platten pro Bildschirm 100-fold Abdeckung der Bibliothek zu erhalten angemessene Vertretung der Haarnadeln und vermeiden zufällige ausfallenden9zu erhalten. Angesichts positiver Selektionsbild und eine große Bibliothek-Größe, ist es jedoch wahrscheinlich, dass eine niedrigere Abdeckung ausreichen würde.</li>
		<li>Am Morgen Platte 1 x 106 Xi Zellen auf 10 cm Gewebekultur Teller.</li>
		<li>Am Nachmittag infizieren Sie die Platten durch Austauschen der Medien mit frischen DMEM-10 mit viralen überstand und 5-10 µg/mL Polybrene. Verwenden Sie die Menge der viralen Überstand in Schritt 2.1.2 ermittelten.</li>
		<li>Aspirieren Sie nach 18-24 h die Medien und 10 mL frisches DMEM-10 auf jede Platte. Kultur für eine weitere 48 h.</li>
		<li>Am Morgen die Zellen mit 1 mL Trypsin-EDTA 0,05 % pro Platte zu mobilisieren und stillen mit 9 mL DMEM-10 pro Platte. Ein Siebfilter 100 µm durchziehen Sie die Aufhängung. Bündeln Sie die gefilterten Suspensionen zusammen, und Samen Sie zwei Sätze von 10 cm Platten auf 1 x 106 Zellen/Platte.</li>
		<li>Am Nachmittag ersetzen Sie die Medien in einer Reihe von Platten mit DMEM-10-15 µg/mL Hygromycin B (Tag 0) enthält. Ersetzen Sie in der anderen Gruppe die Medien mit frischen DMEM-10 nur.</li>
		<li>Mobilisieren Sie nach 48 Stunden die Zellen aus unbehandelten Platten mit 1 ml Trypsin-EDTA 0,05 %. 2-5 min bei 37 ° c inkubieren Stillen Sie mit 9 mL DMEM-10. Übertragen Sie die Zellen auf 15 ml konische Röhrchen und Zentrifuge bei 500 X g für 5 Minuten bei Raumtemperatur. Aspirieren Sie die Überstände und gehen Sie sofort bei der Gewinnung von DNA von den Pellets. Alternativ, bündeln Sie die Zellen in größeren Röhren vor dem Zentrifugieren Schritt.</li>
		<li>Mit einer Mischung aus Phenol und Chroroform DNA extrahieren und DNA mit Natrium Acetat und kaltem Ethanol als zuvor beschriebenen10auszufällen. Die individuelle Vorauswahl DNA-Proben zu bündeln und bei-20 ° C bis zur weiteren Verwendung speichern.</li>
		<li>Weiter züchten Hygromycin B Auswahlsatz für 4 Tage. Ergänzen Sie das Auswahl-Media mit frischen DMEM-10 mit Hygromycin B nach 2 Tagen.</li>
		<li>Am 7. Tag ersetzen Sie die Auswahl-Medien mit frischen DMEM-10 nur. Ermöglichen Sie 2 bis 4 Tage für die Wiederherstellung zu, und dann ernten Sie die Zellen, wie in Schritt 2.1.8 beschrieben. Gehen Sie mit DNA-Extraktion, wie in Schritt 2.1.9 beschrieben.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Identifizierung von Haarnadeln angereichert in den Post-Auswahl-Proben
	<ol>
<li>Verwendung 5' Kontext (5'-ATCGTTGCCTGCACATCTTGG-3 ") und 3' Schleife Primer umkehren (5'-ACATCTGTGGCTTCACTA-3"), Hälfte-Haarnadeln von Pre- und Post-Auswahl DNA-Proben zu verstärken. Verwenden Sie alle extrahierten DNA in separaten PCR-Reaktionen mit 100-200 ng DNA pro Reaktion. Hinweis: Diese Kontext Primer 5' und 3' Kehrschleife Primer entsprechen die MiR 30 Rahmen Sequenz stromaufwärts der ShRNA einfügen und die Reihenfolge bei der ShRNA-Schleife. Verschiedene Bibliotheken benötigen unterschiedliche Oligos. Stellen Sie Reinigungsschritte um verschiedene Produktgrößen Bedarf zu isolieren.</li>
		<li>Verwendung Größenauswahl Perlen, Primern und genomischer DNA zu entfernen und wiederherzustellen PCR-Produkte zwischen 100 und 200 BP. folgen das Protokoll mit den Perlen enthalten.</li>
		<li>Bereiten Sie eine Sequenzierung Bibliothek um die Hälfte-Haarnadeln zu sequenzieren. Erzeugen Sie mindestens 50 Millionen Lesevorgänge pro Bildschirm. Befolgen Sie das Protokoll für die Sequenzierung Kit und Ausrüstung geeignet. Hinweis: 50 Millionen Lesevorgänge pro Bildschirm bietet, 1000-fold Darstellung der einzelnen ShRNA in der Bibliothek und ca. 10-divisibel Berichterstattung über jede unabhängige Infektion (durchgeführt am 100-fold Darstellung der einzelnen ShRNA), sorgt für angemessene Vertretung der jede Infektion Veranstaltung.</li>
		<li>Zählen Sie jede ShRNA mit einem Perl-Skript, die Sequenzen mit perfekte Treffer zählt. Wählte ShRNAs, die mindestens 10 mal gelesen in der Vorauswahl Pool zur weiteren Analyse hatte. Berechnen Sie die Bereicherungen, wie Verhältnisse des Post-Vorauswahl zählt und false Discovery Rate (FDR) auf der Grundlage von 1000 Permutationen zu bestimmen. Wählen Sie Gene gezielt durch ShRNAs mit < 5 % FDR als "hits" für weitere Tests.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Überprüfung der identifizierten Haarnadeln ("Hits")
<ol><li>
Verpackung-Lentiviren mit ShRNAs identifiziert auf dem Bildschirm
	<ol>
<li>8 x 106 293 FT Samenzellen pro Platte auf 10 cm Platten.</li>
		<li>Ersetzen Sie am folgenden Tag, die Medien mit 9 mL antibiotikafreien DMEM-10 pro Platte; Diese 30 Minuten vor Transfektion zu tun.</li>
		<li>Während der 30-Minuten-Intervall bereiten Sie zwei Mischungen zur Transfektion:<ol>
<li>Bereiten Sie Mix 1 (pro Platte/ShRNA; skalieren nach der Gesamtzahl von ShRNAs): 10 µL 2 mg/mL Polyethylenimine (PEI) in 0,5 mL optimale minimale wesentlichen Medien. Mischen von pipettieren und in 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
			<li>Mix 2 (pro ShRNA) vorbereiten: 4 µg des Vektors zu verpackenden ShRNA, 1,5 µg des VSV-G Umschlag Vektors (pMD2.G) und 2,5 µg des Vektors Verpackung (psPAX2), in 0,5 mL der optimale minimale wesentlichen Medien gemischt. Hinweis: Enthalten Sie einen leeren Lentivirale Vektor in der Verpackung, bei späteren Infektionen als Negativkontrolle zu verwenden.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Jedes aliquoten Mix 2 0,5 mL Mischung 1 hinzu, und mischen Sie leicht durch pipettieren. Im Dunkeln bei Raumtemperatur für 20 min inkubieren.</li>
		<li>Tragen Sie das Gemisch auf jede Platte aus Schritt 3.1.2 tropfenweise Weise; Schwenken Sie die Platte vorsichtig mischen.</li>
		<li>Ersetzen Sie am folgenden Tag, die Medien mit 5 mL frischem DMEM-10.</li>
		<li>48 Stunden nach der ersten Transfektion den Überstand zu sammeln und führen Sie es durch einen 0,22 µm-Filter. Vornässen des Filters mit DMEM-10 um Erholung zu maximieren.</li>
		<li>Aliquot der gefilterten Überstand in Mengen ideal für eine 6-Well-Platte gut zu infizieren.</li>
		<li>Frieren Sie die Aliquote bei-80 ° C zur späteren Verwendung ein, oder gehen Sie sofort mit Transduktion.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Transduktion und Erprobung von einzelnen Haarnadeln für Luciferase Reporter Reaktivierung und Reaktivierung von Wildtyp MeCP2-gen auf der Xi.
	<ol>
<li>Am Morgen Platte 1 x 105 Xi Zellen/gut auf 6-well-Platten.</li>
		<li>Am Nachmittag infizieren Sie die Platten durch Austauschen der Medien mit 2 mL frisches DMEM-10, Lentivirale überstand und 5-10 µg/mL des Polybrene enthält. Infizieren Sie ein Steuerelement mit viralen überstand produziert aus ein leerer Lentivirale Vektor.</li>
		<li>Ersetzen Sie am folgenden Tag, die Medien mit 2 mL DMEM-10 enthält 1 mg/mL Puromycin. Kultur für vier Tage.</li>
		<li>Ersetzen Sie die Medien mit 2 mL frisches DMEM-10 und ermöglichen Sie 48-72 h für die Wiederherstellung zu.</li>
		<li>Mobilisieren Sie die Zellen mit 150 µL 0,05 % Trypsin-EDTA. 2-5 min bei 37 ° c inkubieren Stillen Sie mit 1,5 mL DMEM-10. Übertragen Sie die Zellen auf 15 ml konische Röhrchen und Zentrifuge bei 500 X g für 10 Minuten bei Raumtemperatur.</li>
		<li>Entfernen Sie das Medium und Aufschwemmen der Zellen in 100 µL Lyse Puffer im Luciferase Assay Kit enthalten. 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Übertragen Sie die Lysates zu einem weißen 96-Well-Platte und Assay für Luciferase-Aktivität unter Verwendung des Protokolls mit dem Kit enthalten. Verwenden Sie Xa Zellen als Positivkontrolle und Xi Zellen infiziert mit ein leerer Lentivirale Vektor als Negativkontrolle. Hinweis: Aussetzen Sie die weißen Platten, fluoreszierendes Licht vor dem Test; Dies reduziert den Hintergrund und Assay Empfindlichkeit erhöhen. Das Protokoll im Assay Kit enthalten erwies sich am wirksamsten, wenn in der Dunkelheit nach Möglichkeit durchgeführt werden.</li>
		<li>Um festzustellen, ob die Haarnadel auf die Expression von MeCP2 auf dem aktiven X-Chromosom auswirkten, isolieren Sie RNA aus Tranduced Xi Zellen zu und zu messen Sie MeCP2 mRNA-Ebene mit quantitativer PCR Primer konzipiert, um nur Wildtyp MeCP2 (F: verstärken 5'-TTCCATGCCAAGGCCAAACAG-3', R: 5'-CCCATAAGGAGAAGAGACAACAGC-3 ").</li>
		<li>
Optional: Erhöhen Sie die Empfindlichkeit des Tests durch eine Endkonzentration von 0,2 µM 5-AZA hinzufügen, nachdem die Zellen von Puromycin Auswahl erholt haben. Kulturzellen 72 h ohne austauschen der Medien, und dann für Luciferase-Aktivität mit dem kommerziellen Luciferase Assay Kit assay.</li>
		<li>Reaktivierung der schallgedämpften Wildtyp MeCP2 zu messen. Infizieren Sie Xa-Zellen, die dem Wildtyp MeCP2 auf der Xi mit der Vektor mit einzelnen Haarnadeln, Protokoll folgendermaßen 3.2.1 beherbergen. -3.2.4. RNA aus Zellen zu isolieren und zu messen MeCP2 mRNA-Ebene mit quantitativer PCR Primer konzipiert, um nur Wildtyp MeCP2 verstärken (F: 5 '- TTCCATGCCAAGGCCAAACAG - 3', R: 5' - CCCATAAGGAGAAGAGACAACAGC - 3').</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Amir, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rett+syndrome+is+caused+by+mutations+in+X-linked+MECP2%2C+encoding+methyl-CpG-binding+protein+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Rett syndrome is caused by mutations in X-linked MECP2, encoding methyl-CpG-binding protein 2.</a> Nat Genet. 23, 185-188 (1999).</li>
<li>Guy, J., Gan, J., Selfridge, J., Cobb, S., Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+neurological+defects+in+a+mouse+model+of+Rett+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reversal of neurological defects in a mouse model of Rett syndrome.</a> Science. 315, 1143-1147 (2007).</li>
<li>Maduro, C., de Hoon, B., Gribnau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fitting+the+Puzzle+Pieces%3A+the+Bigger+Picture+of+XCI%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Fitting the Puzzle Pieces: the Bigger Picture of XCI.</a> Trends Biochem Sci. 41, 138-147 (2016).</li>
<li>Disteche, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dosage+compensation+of+the+sex+chromosomes+and+autosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Dosage compensation of the sex chromosomes and autosomes.</a> Semin Cell Dev Biol. 56, 9-18 (2016).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wild-type+microglia+do+not+reverse+pathology+in+mouse+models+of+Rett+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Wild-type microglia do not reverse pathology in mouse models of Rett syndrome.</a> Nature. 521, E1-E4 (2015).</li>
<li>Sripathy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screen+for+reactivation+of+MeCP2+on+the+inactive+X+chromosome+identifies+the+BMP%2FTGF-beta+superfamily+as+a+regulator+of+XIST+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Screen for reactivation of MeCP2 on the inactive X chromosome identifies the BMP/TGF-beta superfamily as a regulator of XIST expression.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114, 1619-1624 (2017).</li>
<li>Foster, S. A., Galloway, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+papillomavirus+type+16+E7+alleviates+a+proliferation+block+in+early+passage+human+mammary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Human papillomavirus type 16 E7 alleviates a proliferation block in early passage human mammary epithelial cells.</a> Oncogene. 12, 1773-1779 (1996).</li>
<li>Hnasko, T. S., Hnasko, R. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26160567">The Western Blot.</a> Methods Mol Biol. 1318, 87-96 (2015).</li>
<li>Strezoska, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+PCR+conditions+and+increased+shRNA+fold+representation+improve+reproducibility+of+pooled+shRNA+screens%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Optimized PCR conditions and increased shRNA fold representation improve reproducibility of pooled shRNA screens.</a> PLoS One. 7, e42341(2012).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+High-Molecular-Weight+DNA+from+Mammalian+Tissues+Using+Proteinase+K+and+Phenol%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of High-Molecular-Weight DNA from Mammalian Tissues Using Proteinase K and Phenol.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2017, (2017).</li>
<li>Goto, Y., Takagi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetraploid+embryos+rescue+embryonic+lethality+caused+by+an+additional+maternally+inherited+X+chromosome+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Tetraploid embryos rescue embryonic lethality caused by an additional maternally inherited X chromosome in the mouse.</a> Development. 125, 3353-3363 (1998).</li>
<li>Csankovszki, G., Nagy, A., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergism+of+Xist+RNA%2C+DNA+methylation%2C+and+histone+hypoacetylation+in+maintaining+X+chromosome+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Synergism of Xist RNA, DNA methylation, and histone hypoacetylation in maintaining X chromosome inactivation.</a> J Cell Biol. 153, 773-784 (2001).</li>
<li>Minajigi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomes.+A+comprehensive+Xist+interactome+reveals+cohesin+repulsion+and+an+RNA-directed+chromosome+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Chromosomes. A comprehensive Xist interactome reveals cohesin repulsion and an RNA-directed chromosome conformation.</a> Science. 349, (2015).</li>
<li>McHugh, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Xist+lncRNA+interacts+directly+with+SHARP+to+silence+transcription+through+HDAC3%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3.</a> Nature. 521, 232-236 (2015).</li>
<li>Bhatnagar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+pharmacological+reactivation+of+the+mammalian+inactive+X+chromosome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genetic and pharmacological reactivation of the mammalian inactive X chromosome.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 12591-12598 (2014).</li>
<li>Minkovsky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mbd1-Atf7ip-Setdb1+pathway+contributes+to+the+maintenance+of+X+chromosome+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics+Chromatin%22%5BJournal%5D)">The Mbd1-Atf7ip-Setdb1 pathway contributes to the maintenance of X chromosome inactivation.</a> Epigenetics Chromatin. 7, 12(2014).</li>
<li>Minkovsky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+screen+of+inactive+X+chromosome+reactivation+identifies+the+enhancement+of+DNA+demethylation+by+5-aza-2%27-dC+upon+inhibition+of+ribonucleotide+reductase%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics+Chromatin%22%5BJournal%5D)">A high-throughput screen of inactive X chromosome reactivation identifies the enhancement of DNA demethylation by 5-aza-2'-dC upon inhibition of ribonucleotide reductase.</a> Epigenetics Chromatin. 8, 42(2015).</li>
</ol>

Dr. Leko trug zu diesem Artikel als Angestellter des Fred Hutchinson Cancer Research Center.  Die geäußerten Ansichten sind seine eigenen und repräsentieren nicht notwendigerweise die Ansichten von den National Institutes of Health oder Regierung der Vereinigten Staaten

In unserer letzten Studie6, erzielten wir eine murinen Zelllinie mit Luciferase und Hygromycin-Resistenz-Gene mit MeCP2 auf der Xi verschmolzen und mit einer Bibliothek von ausgestrahlt > 60.000 ShRNAs targeting > 25.000 Gene. Wir fanden 30 Gene deren Knock-down übertragenen Überlebensvorteil unter Hygromycin B-Auswahl, was ihre Rolle in der Steuerung von MeCP2 und X-Chromosom zum Schweigen zu bringen. Diese Ergebnisse wurden durch transducing die gemeldeten Zell-Linie mit einzel...

Eine der häufigsten Formen der erblichen psychischen Beeinträchtigung bei Frauen, Rett-Syndrom, wird verursacht durch heterozygoten Mutationen im MeCP2, ein X-Chromosom-gen, das ein Protein wichtig für normale neuronale Funktion1kodiert. Eine mögliche Ansatz zur Behandlung dieser Erkrankung wäre Reaktivierung der Wildtyp MeCP2 Allel auf Xi, wie Wiederherstellung von MeCP2 Ausdruck zeigte umzukehrenden neurologische Defizite in einem Mausmodell der diese Krankheit1, 2 , 4. jedoch epigenetische silencing von einem der beiden X-Chromosomen in weiblichen Zellen fest bleibt, während der gesamten Lebensdauer eines Organismus3,4, und robuste Reaktivierung eines Gens Xi müsste wahrscheinlich a-Dur Störungen in mehreren epigenetische Regulierung Bahnen.
Ermittlung der Faktoren, die für Wartung von MeCP2 zum Schweigen zu bringen, haben wir zuerst entwickelt einem transgenen Mausmodell tragen eine MeCP2- Luciferase - Hygromycin Widerstand gen Fusion (MeCP2-LUC-HR) auf einem der beiden X-Chromosomen (X MeCP2-LUC-HR/xMeCP2)5. Obwohl die MeCP2 von Fusion Konstrukt ausgedrückt erwies sich als instabil und führte zu einem Verlust der Funktion, phänotypisch imitiert MeCP2 Löschung bei Hemizygous Männern (XMeCP2-LUC-HR/y), die Expression der Gene reporter war in einem Muster entsprechen der Ausdruck der endogenen MeCP25leicht nachweisbar. Wir dann verewigt Fibroblasten Klone mit dem Konstrukt auf entweder inaktiv oder aktiv X-Chromosom erzeugt, und bestätigte, dass der ehemalige Wildtyp MeCP2 und nicht das Reporter-Konstrukt zum Ausdruck gebracht; die Inverse galt für Letzteres. Wenn ein DNA-demethylating Agent bekannt, Gen-silencing, aufzuheben 5-Azacytidine (5-AZA) ausgesetzt gewonnen Zellen mit dem Reporter auf der Xi ("Reporter-Zellen") Aktivität in einem Biolumineszenz-Assay, darauf hinweist, dass unsere Konstrukt reaktiviert werden könnten und daher für genetisches Screening verwendet.
Wir entwickelt als nächstes einen Hochdurchsatz-genetischen Bildschirm für Regulatoren des MeCP2 zum Schweigen zu bringen. Die Reporter-Zell-Linie wurde zuerst mit einem antiretroviralen Bibliothek mit infiziert > 60.000 verschiedene ShRNAs targeting > 25.000 Gene in der Maus Genom5,6, und dann Hygromycin B Auswahl unterzogen. Haarnadel Frequenz verglich in Pre- und Post-Auswahl Proben mit Sequenzierung der nächsten Generation, als Reporter Reaktivierung Wachstum Vorteil unter Hygromycin B Auswahl und Anreicherung der Verantwortlichen Haarnadeln führte. Mit diesem Ansatz, wir 30 Gene verwickelt in MeCP2 zum Schweigen zu bringen und anschließend bestätigte die Ergebnisse von transducing die Reporter Zellen mit einzelnen Haarnadeln und Messung ihrer Luciferase-Aktivität.

<table><tbody><tr><td>293FT Zelllinie</td><td>Invitrogen</td><td>R700-07</td><td></td></tr><tr><td>5-Azacytidin</td><td>Sigma</td><td>A2385-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP</td><td>Beckman-Coulter</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>Anti-MECP2-Antikörper</td><td>Millipore</td><td>07-013</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase</td><td>Sigma</td><td>C2674-1G</td><td></td></tr><tr><td>Corning 96-Well Festplatte aus weißem Polystyrol</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-336</td><td></td></tr><tr><td>Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Expression Arrest microRNA-adaptierter retroviraler Vektor (pMSCV)</td><td>Offene Biosysteme</td><td>EAV4679</td><td></td></tr><tr><td>Expression Arrest pSM2 Retrovirale shRNAmir-Bibliothek</td><td>Offene Biosysteme</td><td>RMM3796</td><td></td></tr><tr><td>fötales Rinderserum</td><td>Fisherbrand</td><td>03-600-511</td><td></td></tr><tr><td>HiSeq 2500</td><td>Illumina</td><td>SY&ndash; 401&ndash; 2501</td><td>oder gleichwertiges</td></tr><tr><td>Hygromycin B</td><td>Calbiochem</td><td>400051-1MU</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>Bright-Glo Luciferase Assay System</td><td>Promega</td><td>E2610</td><td>Homogener Assay zum Screening von Kolonien</td></tr><tr><td>Luciferase Assay System</td><td>Promega</td><td>E4530</td><td>Inhomogener Assay zum Testen einzelner Haarnadeln</td></tr><tr><td>Luminometer TopCount NXT</td><td>Perkin Elmer</td><td>N/A</td><td>Oder ähnliches Luminometer</td></tr><tr><td>MiSeq Reagent Kit v2</td><td>Illumina</td><td>MS-102-2001</td><td>Verwenden Sie ein mit Ihrem Gerät kompatibles Kit</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>#12259</td><td>VSV-G Hüllkurvenvektor</td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylenimin</td><td>Polysciences</td><td>23966-1</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2</td><td>Addgen</td><td>#12260</td><td>Verpackungsvektor</td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Gibco</td><td>A11138-02</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,05%), phenolrot</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr></tbody></table>

gepoolte shrna bildschirm für die reaktivierung des mecp2 auf dem inaktiven x-chromosom

Pooled shRNA Screen for Reactivation of MeCP2 on the Inactive X Chromosome

Nach vorne genetische Bildschirme mit Reporter-Gene in das Heterochromatin eingefügt wurden ausgiebig zur epigenetischen Kontrollmechanismen in Modellorganismen untersuchen. Technologien einschließlich kurze Haarnadel RNAs (ShRNAs) und gruppierten regelmäßig dazwischen kurze palindromische Wiederholungen (CRISPR) haben solche Bildschirme in diploiden Säugetier-Zellen aktiviert. Hier beschreiben wir einen groß angelegte ShRNA-Bildschirm für Regulatoren der X-Chromosom Inaktivierung (XCI), mit einem murinen Zelllinie mit Firefly Luciferase und Hygromycin-Resistenz-Gene klopfte am C-Terminus von Methyl CpG verbindliches Protein 2 (MeCP2) gen auf dem inaktiven X-Chromosom (Xi). Reaktivierung des Konstrukts in der Reporter-Zellinie übertragenen Überlebensvorteil unter Hygromycin B Auswahl ermöglicht uns eine große ShRNA-Bibliothek und Haarnadeln, die die Reporter reaktiviert durch Messen, ihre Post-Auswahl Bereicherung zu identifizieren Sequenzierung der nächsten Generation. Die angereicherten Haarnadeln wurden dann einzeln testen ihre Fähigkeit zur Aktivierung der Luciferase Reporters auf Xi validiert.

Maus Sehne Fibroblasten geerntet wurden aus einer zuvor beschriebenen XMeCP2-LUC-HR/xMeCP2 weibliche Maus, verewigt von retrovirale Transduktion von E6 und E7 Onkogene von HPV-16 virus7, geklont mit einschränkenden Verdünnung und getestet für Luciferase Aktivität und Expression von Wildtyp MeCP2 Protein (Abb. 1A und 1 b). Luciferase Aktivität war robust, wenn der Reporter auf Xa war und nicht nachweisbar wenn auf Xi; der native MeCP2 Ausdruck ausgestell...

Wir berichten über eine kleine Hairpin RNA (ShRNA) und die nächste Generation Sequencing-basiertes Protokoll zur Identifizierung von Regulatoren der X-Chromosom Inaktivierung in einem murinen Zelllinie mit Firefly Luciferase und Hygromycin-Resistenz-Gene verschmolzen, das Methyl CpG verbindliches Protein 2) MeCP2) gen auf dem x-Chromosom inaktiv.

Gepoolte ShRNA Bildschirm für die Reaktivierung des MeCP2 auf dem inaktiven X-Chromosom

Forward genetic screens using reporter genes inserted into the heterochromatin have been extensively used to investigate mechanisms of epigenetic control ...

Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Präparation von Maussehnenfibroblasten, wie im Textprotokoll beschrieben. Ernten Sie die Zellen aus einer 10 Zentimeter großen Platte, indem Sie zuerst das Medium ansaugen. Fügen Sie dann einen Milliliter 0,05 % Trypsin-EDTA hinzu und inkubieren Sie zwei bis fünf Minuten bei 37 Grad Celsius.Nach der Inkubation wird das Trypsin mit neun Millilitern DMEM-10 abgeschreckt und die resuspendierten Zellen in einem konischen 15-Milliliter-Röhrchen gesammelt. Verdünnen Sie die Zellen mit DMEM-10 auf eine Endkonzentration von einer Zelle pro 100 Mikroliter. Übertragen Sie dann die Zellen auf 96-Well-Platten, indem Sie 100 Mikroliter der Suspension in jede Vertiefung pipettieren.Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius, bis die Vertiefungen zusammenfließen, was bis zu zwei bis drei Wochen dauern kann. Ersetzen Sie das Medium alle drei bis fünf Tage durch frisches DMEM-10. Wenn sie zusammenfließen, mobilisieren Sie die Zellen mit 20 Mikrolitern 0,05 % Trypsin-EDTA pro Vertiefung und teilen Sie sie in zwei doppelte Sätze von 96-Well-Platten auf.Assay für die Luciferase-Aktivität in einem Satz Platten. Verwenden Sie einen homogenen Firefly-Luciferase-As

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Hier verwenden wir ein menschliches LentiPlex gebündelt Bibliothek und traditionelle Methoden zur Sequenzierung Gen-Targets zu fördern Überleben der Zelle zu identifizieren. Wir zeigen, wie die Einrichtung und Dekonvolution ein LentiPlex Bildschirm und Validierung der Ergebnisse.

MISSION LentiPlex Pooled shRNA Bibliothek Screening in Säugerzellen

Periventrikulären noduläre Heterotopie (PNH) ist die häufigste Form der Fehlbildung der kortikalen Entwicklung (MCD) im Erwachsenenalter, aber seine genetische Basis bleibt bei den sporadischen Fällen unbekannt. Vor kurzem haben wir eine Strategie, um neue Kandidatengene für MCDs zu identifizieren und direkt ihre ursächliche Rolle in Vivobestätigen.

Eine neuartige Strategie verbindet Array-CGH, ganze Exome Sequenzierung und In Utero Elektroporation bei Nagetieren verursachenden Gene für Hirnfehlbildungen identifizieren

Hier präsentieren wir Ihnen ein detailliertes Protokoll zur Identifizierung von homologen Rekombinationsereignisse in embryonalen Stammzellen der Maus mit Southern blotting und/oder PCR. Diese Methode ist durch die Generierung von Nonmuscle Myosin II genetische Ersatz Mausmodellen mit traditionellen embryonalen Stammzell-basierte homologe Rekombination-vermittelten targeting-Technologie veranschaulicht.

Identifikation der homologen Rekombinationsereignisse in embryonalen Stammzellen der Maus mit Southern Blotting und Polymerase-Kettenreaktion

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Generierung eines lebensfähigen weiblichen Murinmodells mit nicht zufälliger X-Chromosomeninaktivierung, d.h. das mütterlich vererbte X-Chromosom ist in 100% der Zellen inaktiv. Wir beschreiben auch ein Protokoll zur Prüfung der Machbarkeit, Verträglichkeit und Sicherheit der pharmakologischen Reaktivierung des inaktiven X-Chromosoms in vivo.

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Ein robuster Polymerase-Kettenreaktions-basierter Assay zur Quantifizierung von Cytosin-Guanin-Guanin-Trinukleotid-Wiederholungen in fragilen X Mental Retardation-1 Gen

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Das RNAi-Screening (High-Throughput-RNA-Interferenz) unter Verwendung eines Pools lentiviraler shRNAs kann ein Werkzeug sein, um therapeutisch relevante synthetische tödliche Ziele in Malignomen nachzuweisen. Wir bieten einen gepoolten shRNA-Screening-Ansatz zur Untersuchung der epigenetischen Effektoren bei akuter myeloischer Leukämie (AML).

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Lernen Sie einen gepoolten shRNA-Bildschirm zur Identifizierung von Regulatoren der X-Chromosom-Inaktivierung in murinen Fibroblasten. Diese Methode nutzt MeCP2-Reporter und Next-Generation-Sequencing.

Gepoolte ShRNA Bildschirm für die Reaktivierung des MeCP2 auf dem inaktiven X-Chromosom

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