Name: Hochauflösende konfokale Bildgebung der Blut - Hirn-Schranke: Bildgebung, 3D-Rekonstruktion und Quantifizierung der Transcytosis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Lernen Sie hochauflösende konfokale Bildgebung der Blut-Hirn-Schranke mit 3D-Rekonstruktion und Quantifizierung subzellulärer Organelle in Maus-Gehirnschnitten. Diese Methode ermöglicht detaillierte Analysen des Neurovaskulären Einheits.

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R.V. wurde von einem Roche Postdoctoral Fellowship (2014-2017) unterstützt.

<ol><li>Blanchette, M., Daneman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+and+maintenance+of+the+BBB%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Formation and maintenance of the BBB.</a> Mech Dev. 138, Pt 1 8-16 (2015).</li>
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</ol>

Autoren sind unter Erwerbstätigkeit von Roche.

Die oben beschriebene Protokoll beschreibt die Vorbereitung der Gehirn frei schwebenden Abschnitte, immunofluorescent Färbung, Bildaufnahme und Analyseparameter für hochauflösende Mikroskopie der BBB. Diese Methode hat vor kurzem verwendet, um die Lokalisierung der Antikörper Lieferung Plattformen3, den Transport von endogenen IgG über die BBB-17und die Heterogenität der BBB auf Pericyte Verlust18zu untersuchen. Verschiedene Schritte im Protokoll können zur Anpassung an die spezifischen Ziel des Experiments geändert werden. Zunächst erleichtert die Verwendung von dicken (100 µm) Abschnitte ihrer Handhabung beim Verfahren Immunostaining und Montage. Es ermöglicht auch für 3D Rekonstruktion des Kapillarnetzes, die neurovaskuläre Einheit und für die Generation der Kapillare und NVU Querschnitte. Allerdings Eindringen von Antikörper innerhalb der Gewebeschnitte variieren und einige Antikörper Färbung auf die oberflächliche Schicht des Gewebes in der Nähe des Deckglases beschränkt werden kann. Das Protokoll kann geändert werden, indem man die Konzentration der Reinigungsmittel während der Permeabilisierung Schritt bzw. die Länge der die Permeabilisierung Schritt zur Verbesserung der Antikörper Eindringen in das Gewebe. Zweitens kann Bildqualität gefährdet sein, wenn Sie versuchen, Bilder tiefer in das Gewebe (in der Regel 20 bis 30 µm unterhalb der Oberfläche) durch Lichtstreuung sowie optische Aberrationen von Brechungsindex Missverhältnis zu erwerben. Um dieses Problem zu überwinden, können neue Methoden für Gewebe, clearing und aktive Antikörper eindringen20 mit diesem Protokoll zu Bild größere Mengen an Gewebe kombiniert werden. Drittens erfolgt Dekonvolution nach der Bildaufnahme, axiale Auflösung des Bildes zu verbessern. Die Wahl des blind Deconvolution Algorithmus verwendet in diesem Protokoll stützte sich auf (i) seine einfache Bedienung, da keine Vorausberechnung der Point-Spread Funktion benötigt wird, (Ii) seine Robustheit für die Verbesserung der Bild Qualität21und (Iii) das Fehlen von Artefakten auf mIgG intrazelluläre Strukturen nach der Implementierung. Abhängig von der intrazellulären Strukturen visualisiert in der Probe führen andere Dekonvolution Algorithmen höhere Bildqualität. Die folgenden Referenzen21,22 geben eine ausführliche Diskussion über die Vorteile und Grenzen der zusätzliche Algorithmen für Bild Dekonvolution. Schließlich erlaubt die Verwendung von einer Bild-Analyse-Software-Paket die Segmentierung der Kapillaren und intrazellulären Strukturen in drei Dimensionen. Klar Bildanalyse beschränkt sich nicht auf die Software, die im Protokoll und alternative Pakete, zum Beispiel die Referenz23ausführlich beschrieben, Segment Bilder genutzt werden. Die Eignung der verschiedenen Software-Programmen für die Analyse der intrazellulären Strukturen über die BBB sollte empirisch überprüft werden, durch die Beurteilung der Genauigkeit der Bild Segmentierung.
Da diese Methode auf festen Proben basiert, bietet es keine direkten Informationen über die Dynamik des Transcytosis über die BBB. Jedoch mit Zeitverlauf Experimente24, z. B. kombinierbar durch intravenös injizieren das Molekül des Interesses und seine Ansammlung innerhalb BECs zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Injektion zu rekonstruieren, die Kinetik der Messung intrazellulären Transport. Der Vorteil dieses Ansatzes ist, dass es für die Analyse von tiefen Hirnregionen wie gezeigt in18, die derzeit für intravitalen live bildgebenden Methoden nicht zugänglich sind. Ein wichtiger Schritt während des Protokolls ist die sorgfältige Überwachung der Gewebe Fixierung. Befestigung mit 4 % PFA drastisch reduziert die Immunogenität des intrazellulären Organellen und des endogenen oder peripher verabreichte Immunglobuline17 (Abbildung 1 b). Eine Einschränkung dieses Protokolls ist die Anforderung der qualitativ hochwertige Antikörper (d.h.niedrige unspezifische Färbung, geringe Kreuzreaktivität) geeignet für Immunfluoreszenz. Sofern solche Reagenzien zur Verfügung stehen, kann das Verfahren angewendet werden, um die intrazelluläre Lokalisation jedes Proteins des Interesses zu untersuchen. Zum Beispiel wurde das Protokoll zur Lysosomen im Gehirn endothelial Zellen17identifizieren. Es sollte auch angemerkt werden, dass da dieses Protokoll auf konfokalen Mikroskopie beruht, die laterale Auflösung durch Beugung begrenzt wird und nicht werden Strukturen, die kleiner als etwa 175 bis 250 aufgelöst kann nm (Abbildung 2).
Frühere Studien haben detaillierte Analyse der zellulären Zusammensetzung der konfokalen Mikroskopie25,26mit neurovaskuläre Einheit durchgeführt. Untersuchung von intrazellulären Transport an der BBB hängt jedoch vor allem auf die Verwendung von Transmission Electron Microscopy19,27,28. Während diese Methode die höchste laterale Auflösung der intrazellulären Strukturen bietet, bleibt Elektronenmikroskopie eine anspruchsvolle Technik mit niedrigem Durchsatz. Darüber hinaus ist die Anzahl der verschiedenen molekularen Ziele, die durch EM visualisiert werden können sehr begrenzt. Dieses Protokoll bietet eine zugängliche Alternative zu intrazellulären Transport an der BBB zu untersuchen. Die komplette Prozedur aus Gehirn Sammlung, Bildanalyse, kann in 5 bis 6 Tagen durchgeführt werden. Wenn geeignete Antikörper vorhanden sind, ermöglicht Immunfluoreszenz simultane Detektion von mehreren Zelle Arten/Moleküle innerhalb der gleichen Probe. Außerdem könnte dieses Protokoll mit Höchstauflösung Mikroskopie-Techniken zur Überwindung der Grenzen in räumlicher Auflösung29kombiniert werden. Insgesamt ermöglicht das oben beschriebene Protokoll die Quantifizierung von Veränderungen in die intrazelluläre Lokalisation innerhalb der neurovaskuläre Einheit interessierender Proteine. Seine Anwendung für verschiedene genetische oder pharmakologische Störungen ermöglicht die intrazellulären Struktur und Transport-Funktionen des BBB in Vivozu untersuchen.

Die Blut - Hirn-Schranke (BBB) ist eine kontinuierliche zellulären Barriere bilden Astrozyten, Perizyten, Neuronen und Endothelzellen, die das zentrale Nervensystem (ZNS) aus dem Blutzirkulation1trennt. Die Regulierung der Transport über die BBB spielt eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Homöostase des Gehirns und wird durch spezielle Eigenschaften des Gehirns Endothelzellen (BECs) vermittelt. Das Vorhandensein von enge interzelluläre Verbindungen zwischen BECs und eine niedrige basale Transcytosis begrenzen den parazellulär und intrazelluläre Transport von Blut übertragbare Molekülen, bzw.2. Vor kurzem hat Transcytosis Weg in BECs genutzt, um Lieferung von therapeutischen große Moleküle an das Gehirn3,4zu erhöhen. Jedoch wurden die Mechanismen der Transcytosis über die BBB vollständig charakterisierten5,6noch nicht.
Umfangreiche Arbeit geleistet in Vitro zu entziffern, die zellulären und molekularen Mechanismen intrazellulären Transport über BECs7,8,9,10, 11, aber solche Systeme nicht die komplexe Architektur und Physiologie des Referats neurovaskuläre (NVU) rekapitulieren. Auf der anderen Seite Studien in Vivo12,13 enthalten detaillierte quantitative Informationen zu Frachten über die BBB aber keine Einblicke in die intrazellulären Mechanismen des Verkehrs. Untersuchung der zellulären und intrazellulären Komponenten der NVU bleibt in Vivo und ex Vivo daher sehr anspruchsvoll14. Nur eine begrenzte Anzahl von Techniken sind zugänglich, subzelluläre Strukturen in den Zellen der NVU zu analysieren. Die meisten Studien verwenden Elektronenmikroskopie, aber diese Technik ist begrenzt durch die komplexe Protokolle erforderlich für die ordnungsgemäße Gewebe Vorbereitung und Probenbehandlung. Daher haben wir eine Methode basiert auf hochauflösenden konfokalen Mikroskopie, die die Verarbeitung von Gehirn-Proben, die Analyse und Quantifizierung der subzelluläre Kompartimente innerhalb der Zellen von der NVU erleichtern würde.
Hier beschreiben wir ein Protokoll, das nutzt Maus Gehirn frei schwebenden Abschnitte um quantitative Bildgebung des BBB und NVU auf zellulärer und subzellulärer Ebene durchzuführen. Wir haben getestet und validiert eine Anzahl von Antikörpern gegen Bild und NVU in drei Dimensionen zu rekonstruieren. Darüber hinaus ermöglicht dieses Protokolls Bildgebung mit der maximalen optischen Beugung begrenzte Auflösung des Organellen innerhalb Gehirn-Kapillaren. Zusammen mit Bildanalyse kann dieses Protokoll verwendet werden, um den intrazellulären Transport von Makromolekülen in der BBB unter verschiedenen experimentellen Bedingungen, zum Beispiel in Mausmodellen Krankheit der Neurodegeneration zu untersuchen.

<table><tbody><tr><td>Monoklonaler Antikörperklon ER-MP12 für Ratten gegen CD31/PECAM</td><td>Novus Biologicals</td><td></td><td>MCA2388 Labels Brain Endothelial Cells Verwendung in einer Verdünnung von 1:100 Nachweis mit polyklonalem Anti-Ratten-IgG (H+L) mit einem geeigneten AlexaFluor-Farbstoff, verwendet in einer Verdünnung von 1:400</td></tr><tr><td>Monoklonaler Antikörper an Ratten gegen Podocalyxin</td><td>R& D Systems</td><td>MAB1556</td><td>Labels Lumen of Capillaries Anwendung bei Verdünnung 1:100 Nachweis mit Esel polyklonales Anti-Ratten-IgG (H+L) gekoppelt mit geeignetem AlexaFluor-Farbstoff, verwendet bei Verdünnung 1:400</td></tr><tr><td>Kaninchen polyklonaler Antikörper gegen CollagenIV</td><td>Biotrend</td><td>BT21-5014-70</td><td>Labels Basalmembran von Kapillaren Verwendung bei Verdünnung 1:100 Nachweis mit Esel polyklonales Anti-Kaninchen-IgG (H+L) in Verbindung mit geeignetem AlexaFluor-Farbstoff, verwendet in einer Verdünnung von 1:400</td></tr><tr><td>polyklonaler Antikörper aus der Ziege gegen CD13</td><td>R& D Systems</td><td>AF2335</td><td>Etiketten Perizyten Verwendung bei Verdünnung 1:100 Nachweis mit Esel polyklonales Anti-Ziegen-IgG (H+L) gekoppelt mit geeignetem AlexaFluor-Farbstoff, verwendet bei Verdünnung 1:400</td></tr><tr><td>Monoklonaler Maus-Antikörperklon G-A-5 gegen GFAP, gekoppelt an Cy3</td><td>Abcam</td><td>ab49874</td><td>Markierungen Astrozyten Verwendung bei Verdünnung 1:100</td></tr><tr><td>Polyklonaler Kaninchen-Antikörper gegen Iba-1</td><td>Wako</td><td>019-19741</td><td>Etiketten Microglia Verwendung bei Verdünnung 1:100 Nachweis mit polyklonalem Anti-Ratten-IgG (H+L) mit Esel in Verbindung mit geeignetem AlexaFluor-Farbstoff, verwendet bei Verdünnung 1:400</td></tr><tr><td>monoklonaler Antikörper für Ratte ABL93 gainst LAMP2</td><td>Fitzgerald</td><td>10R-CD107BBMSP</td><td>Etiketten Lysosomen Verwendung bei Verdünnung 1:100 Nachweis mit polyklonalem Anti-Ratten-IgG (H+L) mit Esel, gekoppelt mit geeignetem AlexaFluor-Farbstoff, Anwendung in Verdünnung 1:400</td></tr><tr><td>Polyklonaler Esel-Antikörper gegen Maus-IgG (H+L) AlexaFluor594</td><td>LifeTechnologies</td><td>A21203</td><td>Verwendung in Verdünnung 1:400</td></tr><tr><td>Polyklonaler Esel-Antikörper gegen Maus-IgG (H+L) AlexaFluor488</td><td>LifeTechnologies</td><td>A21202</td><td>Verwendung in Verdünnung 1:400</td></tr><tr><td>polyklonaler Ziegen-Antikörper gegen Maus-IgG (H+L) AlexaFluor555</td><td>LifeTechnologies</td><td>A21422</td><td>Verwendung in Verdünnung 1:400</td></tr><tr><td>Filterpapier</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WHA10334347</td><td>Whatman vorgefaltetes qualitatives Filterpapier Grade 0858 1/2, genarbter</td></tr><tr><td>Cyanacrylat-Kleber</td><td>Roth Carl</td><td>258.1</td><td>Roti Coll 1</td></tr><tr><td>Fluoreszierendes Eindeckmedium</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td>Dako fluoreszierendes Eindeckmedium</td></tr><tr><td>Ausgewachsene Mäuse</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>000664</td><td>C57BL/6J männliche oder weibliche Mäuse im Alter zwischen 9 und 19 Monaten</td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica Biosystems</td><td>14047235612</td><td>Leica VT100S vibrierendes Klingenmikrotom</td></tr><tr><td>Laser Scanning Konfokales Mikroskop</td><td>Leica Microsystems</td><td>NA</td><td>Leica TCS SP8 X mit HyD-Detektoren und Weißlichtlaser</td></tr><tr><td>Bildverarbeitungssoftware</td><td>Leica Microsystems</td><td>NA</td><td>Leica Application Suite AF Version 3.1.0 build 8587</td></tr><tr><td>Bildanalysesoftware</td><td>Bitplane scientific software</td><td>NA</td><td>Imaris Version 7.6.5 build 31770 für x64</td></tr><tr><td>Fluoreszenzspektrenanschauer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NA</td><td>https://www.thermofisher.com/ch/en/home/life-science /cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html</td></tr></tbody></table>

hochauflösende konfokale bildgebung der blut - hirn-schranke: bildgebung, 3d-rekonstruktion und quantifizierung der transcytosis

High-resolution Confocal Imaging of the Blood-brain Barrier: Imaging, 3D Reconstruction, and Quantification of Transcytosis

Die Blut - Hirn-Schranke (BBB) ist eine dynamische mehrzelligen Schnittstelle, die den Transport von Molekülen zwischen den Kreislauf und das Gehirn reguliert. Transcytosis über die BBB regelt die Lieferung von Hormonen, Metaboliten und therapeutische Antikörper, die in Anwesenheit von. Hier präsentieren wir eine Protokoll, die Immunfluoreszenz frei schwebenden Abschnitte mit Laser kombiniert-scanning-konfokalen Mikroskopie und Bildanalyse subzellularen Organellen innerhalb von Endothelzellen an der BBB zu visualisieren. Kombination dieser Datensatz mit 3D Bildanalyse-Software ermöglicht für die semi-automatischen Segmentierung und Quantifizierung der Kapillare Volumen und Fläche, sowie die Anzahl und Intensität von intrazellulären Organellen an der BBB. Die Erkennung der Maus endogenen Immunglobulin (IgG) in intrazellulären Vesikeln und deren Quantifizierung an der BBB wird verwendet, um die Methode zu veranschaulichen. Dieses Protokoll kann potenziell auf die Untersuchung der Mechanismen Steuern BBB Transcytosis von unterschiedlichen Molekülen in Vivoangewendet werden.

Repräsentative Beispiele von Bildern aus dem hier beschriebenen Protokoll abgerufen, Maus Gehirn Abschnitte waren voller Flecken mit Antikörpern, die verschiedene Komponenten der NVU, einschließlich die Basalmembran, die Astrozyten, die Perizyten zu erkennen sowie endothelialen Zellen (siehe Tabelle der Materialien für spezifische Antikörper verwendet) (Abbildung 1A, D und E). Bei dieser Auflösung ist es möglich, den astrocytic Einzelprozesse und Ende-Füße, die in direktem Kontakt mit Kapillaren sind zu unterscheiden.
Um die Eignung dieses Protokolls zur Erkennung von intrazellulären Strukturen hervorzuheben, wurden Gehirn Teile von Tieren, die am Rande mit den menschlichen Anti-Tau-mAb86 Antikörper16 injiziert mit einem Fluoreszent markierten Anti-Human-Antikörper ( gefärbt. Abbildung 1B). mAb86 ist speziell Ziel Neuronen mit dem Ausdruck einer pathologischen Form der Tau16bekannt. Hierin beschriebene Protokoll verwenden, wurde mAb86 mit Beugung begrenzte Auflösung innerhalb der einzelnen vesikuläre Strukturen innerhalb der Neuronen (Abbildung 1B-C) erkannt. Darüber hinaus war endogenen Maus IgG in intrazellulären Strukturen innerhalb der Endothelzellen, aber nicht in Perizyten (Abbildung 1-D-E und Abbildung 2) erkannt.
Der Erwerb von hochauflösenden konfokalen Z-Stapel des Gehirns Gefäßsystems ermöglicht dreidimensionale Segmentierung der Kapillaren und intrazellulären Vesikeln an der BBB. Abbildung 2 zeigt ein Beispiel für den Prozess der Rendern und Segmentierung eine Kapillare beschriftet mit CollagenIV und Maus IgG-positiven intrazellulären Vesikeln. Durch Quantifizierung der vollständigen Dataset segmentierte Bilder, zum Beispiel durch die Anzahl der Bläschen pro Kapillare Volumen messen, ist es möglich, Veränderungen in intrazelluläre Transportprozesse unter verschiedenen Bedingungen zu studieren. Abbildung 3 B-C zeigt die Unterschiede in mIgG Vesikel Anzahl und Fluoreszenz Intensität entsprechend mIgG bei der in Anwesenheit von, bzw. nach Erschöpfung der Pericyte im Mausmodell Pdgf-bret/ret als zuvor gemeldeten 17. der gleiche Ansatz wurde auch vor kurzem verwendet, um Änderungen in intrazellulären Transport an der BBB zwischen verschiedenen Regionen18zu analysieren.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56407/56407fig1.jpg"> 
Abbildung 1: Kennzeichnung von mehreren Zelltypen und subzelluläre Strukturen der neurovaskuläre Einheit Repräsentative Bilder der neurovaskuläre Einheit (A und D) und intrazellulären Vesikeln enthaltenen Neuronen (B) oder Endothelzellen (E) erhalten mit diesem Protokoll. Die maximale Intensität Projektionsbild in A (oben) zeigt die Verteilung der Astroglia-positiven Astrozyten (rot) umgebenden Kapillaren vom CollagenIV (grün) gekennzeichnet. Pfeile zeigen auf astrocytic Einzelprozesse. Maßstabsleiste = 20 µm. Bei dieser Auflösung sind die einzelnen Astrozyten Prozesse und Ende-Füße deutlich sichtbar, wie im gezoomten Bild die boxed Region (unten) dargestellt. Pfeilspitzen zeigen auf astrocytic Ende-Füße. Maßstabsleiste = 10 µm. Das Bild in B zeigt die Anhäufung von einem peripher injiziert Antikörper, mAb86 (grün), innerhalb einer hippocampal Neuronen. Pfeilspitzen zeigen, individuelle mAb86-positiven Vesikeln. Maßstabsleiste = 10 µm. Die Grafik in C zeigt die Linie Profil Intensität eines einzigen Vesikels. Die Vesikelgröße wurde aus die volle Breite am halben Maximum von einem "glockenförmig" Anfall (schwarze durchgezogene Linie) von der Intensitätskurve (grüne Linie und Kreis) geschätzt. Die Bilder in D zeigen eine dreidimensionale Rekonstruktion einer endothelial Zelle (grün), umgeben von einer Pericyte (rot) innerhalb der Basallamina (CollagenIV, grau). Die unteren Platten zeigen die einzelnen Fluoreszenz-Kanäle. Maßstabsleiste = 10 µm. Die Bilder in E zeigen die Lokalisierung von mIgG (rot) in intrazellulären Vesikeln innerhalb endothelial Zellen (CD31 in grün-Panel links) aber nicht im Perizyten (rechte Abbildung, CD13 in grün). In allen Bildern DAPI gefärbt Kerne sind in blau dargestellt. Maßstabsleiste = 5 µm. Platten D und E von Referenz17geändert wurden. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56407/56407fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56407/56407fig2.jpg"> 
Abbildung 2 : Dreidimensionale Darstellung der Kapillaren und intrazellulären Vesikeln an der Blut - Hirn-Schranke. Mit dem beschriebenen Protokoll erwarb hochauflösende konfokale Bilder von CollagenIV-Positive Kapillaren (grün) und Maus IgG intrazelluläre Vesikeln (rot) wurden (A). Die linke Tafel zeigt einen optischen Bereich mit Querschnitten. Die Pfeile verweisen auf einzelne mIgG-positiven Vesikeln innerhalb Gehirn endothelial Zellen. Das Gremium für die rechts zeigt die 3D Rekonstruktion des Z-Fullstack mit image-Processing-Software (siehe Tabelle der Materialien). Die Kapillare Volumen (B) und einzelne Vesikel (C) wurden in drei Dimensionen gerendert und quantifiziert mit Bildbearbeitungssoftware (siehe Tabelle der Materialien). In allen Bildern DAPI gefärbt Kerne sind in blau dargestellt. Skalieren von Balken = 5 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56407/56407fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56407/56407fig3.jpg"> 
Abbildung 3 : Quantifizierung von mIgG intrazelluläre Lokalisation an der BBB. Repräsentative Bilder zeigen (A) dreidimensionale Rekonstruktionen der Kapillaren (beschriftet mit CollagenIV, grüne) und die Verteilung von mIgG (rot) bei C57BL/6 Mäusen und Pdgf-bret/ret Pericyte erschöpft Mäuse zuvor beschrieben im19. Skalieren von Balken = 10 µm. Die Bilder in B zeigen die Segmentierung von intrazellulären Vesikeln innerhalb der CollagenIV-Maske. The Graphen in B zeigt die Quantifizierung und Vergleich von mIgG Vesikel Anzahl pro Volumen der Kapillare. Jeder Punkt entspricht Messungen aus einzelnen Kapillaren Blöcken. Die durchgezogene Linie zeigt den Mittelwert und die Fehlerbalken repräsentieren die Standardabweichung der Daten. Die Bilder in C zeigen die mIgG Fluoreszenzsignal außerhalb der CollagenIV-Maske. Ebenso zeigt das Diagramm in C die Quantifizierung und Vergleich der Fluoreszenzintensität mIgG in das Gehirn Parenchym zwischen C57BL/6 Mäusen und Pdgf-bret/ret Pericyte erschöpft Mäuse. Fluoreszenz-Intensität-Einheiten wurden von der durchschnittlichen mIgG Parenchym Intensität gemessen an allen C57BL/6 Mäusen normalisiert. Diese Zahl wurde von Referenz17geändert. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56407/56407fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

Hier präsentieren wir eine Mikroskopie-basiertes Protokoll für hochauflösende Bildgebung und eine dreidimensionale Rekonstruktion der Maus neurovaskuläre Einheit und Blut - Hirn-Schranke mit Gehirn frei schwebenden Abschnitten. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung, Analyse und Quantifizierung der intrazellulären Organellen an der BBB.

Hochauflösende konfokale Bildgebung der Blut - Hirn-Schranke: Bildgebung, 3D-Rekonstruktion und Quantifizierung der Transcytosis

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. ...

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, ein mikroskopiebasiertes Protokoll für die hochauflösende Bildgebung und 3-dimensionale Rekonstruktion der Blut-Hirn-Schranke der Maus bereitzustellen. Es kombiniert die Immunfluoreszenz von frei schwebenden Schnitten mit konfokaler Mikroskopie, um subzelluläre Organellen innerhalb der Endothelzellen des Gehirns zu analysieren. Diese Methode ergänzt die Präparation von frei schwebenden Schnitten des Gehirns, die Immunfluoreszenzfärbung, die Bildaufnahme und die Analyse von Parametern für die hochauflösende Mikroskopie der Blut-Hirn-Schranke. Der Hauptvorteil der Technik besteht darin, dass sie die Quantifizierung subzellulärer Organellen innerhalb der Zellen der neurovaskulären Einheit ermöglicht. Das Verfahren wird von Roberto Villase vorgeführt

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Hier beschreiben wir eine schnelle und einfache Methode, um Bild fluoreszenzmarkierten Zellen in semi-dicken Hirnschnitten. Durch die Fixierung, Schneiden und optisch Clearing Hirngewebe beschreiben wir, wie Standard-epifluoreszenten oder konfokale Bildgebung verwendet werden, um einzelne Zellen und neuronalen Netzwerken im intakten Nervengewebe zu visualisieren.

Eine schnelle Annäherung an High-Resolution Fluoreszenz-Imaging in Semi-Thick Hirnschnitten

Quelle: Villaseñor, R und Collin. L. Hochauflösende konfokale Bildgebung der Blut-Hirn-Schranke: Bildgebung, 3D-Rekonstruktion und Quantifizierung der Transzytose. J. Vis. Exp. (2017)Dieses Video zeigt eine hochauflösende 3D-Bildgebung der Blut-Hirn-Schranke (BHS) mittels konfokaler Mikroskopie und zeigt Antikörper-gefärbte Maushirnschnitte zur Analyse von BHS-Komponenten und intrazellulären Strukturen, die für die Untersuchung der Hirnhomöostase, neurovaskulärer Wechselwirkungen und...

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Hochauflösende konfokale Bildgebung der Blut - Hirn-Schranke: Bildgebung, 3D-Rekonstruktion und Quantifizierung der Transcytosis (Video) | JoVE Journal

Hochauflösende konfokale Bildgebung der Blut - Hirn-Schranke: Bildgebung, 3D-Rekonstruktion und Quantifizierung der Transcytosis

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