Live-Bilder von GLUT4 Protein Menschenhandel Maus primäre hypothalamische Neurone mit Dekonvolution Mikroskopie

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, den Echtzeit-Proteintransport in primären neuronalen Zellen wie GLUT4 in hypothalamischen Neuronen mit minimaler Schädigung zu beobachten. Diese Methode kann Schlüsselfragen im Zusammenhang mit der neuronalen Regulation der Insulinsignalübertragung und des Insulinstoffwechsels klären, wie z. B. im Fall von Typ-2-Diabetes mellitus. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass Forscher primäre Zellkulturen isolieren und die medikamenteninduzierte Wirkung in Echtzeit beobachten können.

Die Implikation dieser Technik besteht darin, eine Therapie für Typ-2-Diabetes oder hirnbedingte Insulinresistenz zu wählen, da wir jetzt wissen, wie dieses Insulinsignal durch das Chemokin CCL5 in hypothalamischen Neuronen verändert wird. Zu Beginn dieses Verfahrens beschichten Sie die Kulturschalen einen Tag vor der Kultur mit Poly-D-Lysin. Für eine Sechs-Well-Schale fügen Sie 1,5 ml Poly-D-Lysin mit 0,05 mg/ml in jede Vertiefung hinzu.

Am nächsten Tag Poly-D-Lysin entfernen und das Geschirr zweimal mit 2 mL ddH2O spülen. Füllen Sie dann die 10 cm großen Petrischalen mit 20 mL Waschmedium und stellen Sie sie auf Eis. Füllen Sie die 15-ml-Röhrchen mit Waschmedium und halten Sie sie auf Eis.

Für die Isolierung von Hirngewebe sterilisieren Sie die Plattform, das Präpariermikroskop und die chirurgischen Instrumente mit 75 % Ethanol, um eine Kontamination zu vermeiden. Schneiden Sie danach um den Nabelschnurbereich herum, um die Welpen zu isolieren, ohne sie zu beschädigen. Entfernen Sie als Nächstes den Kopf jedes Welpen und befestigen Sie ihn mit der feinen geraden Pinzette.

Entfernen Sie mit einer weiteren feinen gebogenen Pinzette die Außenhaut und den Schädel von beiden Seiten und ziehen Sie sie von der vorderen zur dorsalen Richtung ab. Bewahren Sie dann die isolierten Gehirne in einer sauberen Petrischale mit eiskaltem Waschmittel auf. Drehen Sie das Gehirn um und halten Sie die Bauchseite nach oben.

Isolieren Sie anschließend das Hypothalamusgewebe mit einer gekrümmten Pinzette mit feiner Spitze. Halten Sie den Riechlappen mit der scharfen Pinzette fest und ziehen Sie mit der gekrümmten Pinzette die dünnen Hirnhäute ab, die das gesamte Gehirn umgeben. Drehen Sie sich zur Unterseite der Rinde und trennen Sie den Hippocampus von der Rinde, indem Sie ihn zur Seite ziehen.

Wenn alle Regionen des Gehirns isoliert wurden, zerkleinern Sie dieses Gewebe in den 15-ml-Röhrchen mit eiskaltem Waschmedium. Spülen Sie bei diesem Verfahren das Gewebe, indem Sie das gewebehaltige Röhrchen zwei- bis dreimal umdrehen. Halten Sie dann den Schlauch gerade, damit sich das Gewebe absetzen kann.

Entfernen Sie das obere Medium mit der Pasteurpipette aus Glas, die an einem Vakuumsystem befestigt ist. Um das Tuch zu waschen, fügen Sie 15 ml eiskaltes Waschmedium hinzu und drehen Sie das Röhrchen zwei- bis dreimal um. Entfernen Sie nach der letzten Wäsche das Waschmedium mit Hilfe einer 1-mL-Pipette.

Inkubieren Sie das Gewebe mit Papain-Trypsin-Verdauungspuffer in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad für sieben bis 14 Minuten. Neutralisieren Sie anschließend die Aktivität der Enzyme, indem Sie ein Volumen fötales Rinderserum hinzufügen. Lassen Sie das Röhrchen auf dem Gestell und warten Sie ein bis zwei Minuten, damit sich das Gewebe setzen kann.

Entfernen Sie anschließend den Überstand vorsichtig mit einer 1-ml-Pipette. Geben Sie 6 ml Plattierungsmedium in das Reagenzglas und pipettieren Sie das Gewebe 50 Mal vorsichtig mit einer 5-ml-Pipette auf und ab. Lassen Sie den Schlauch auf dem Gestell und warten Sie ein bis zwei Minuten, damit sich das klobige, undissoziierte Gewebe absetzen kann.

Als nächstes wird die obere Phase, die die dissoziierten Zellen enthält, in ein neues Röhrchen überführt und mit Plattierungsmedium verdünnt. Geben Sie dann 2 ml vollständiges Nährmedium in jede Vertiefung der Sechs-Well-Schale. Um die Zellen für die Live-Bildgebung vorzubereiten, entfernen Sie vorsichtig mit einer Pinzette die Deckgläser mit Neuronen und legen Sie sie vorsichtig auf den Objektträger.

Entfernen Sie dann überschüssiges Medium mit zarten Arbeitstüchern, indem Sie sie zweimal falten und vorsichtig auf den Deckschein legen, ohne ihn zu bewegen. Es ist wichtig, überschüssige Menge an Medium zu entfernen, um unnötige Bewegungen auf dem Deckglas zu vermeiden. Behandeln Sie anschließend die ausgewählten Zellproben eine Minute lang mit CCL5 bei 10 ng/ml oder Insulin bei 10 Einheiten/ml.

Geben Sie anschließend 1,5 μl verdünntes Insulin auf den Rand der Deckgläser. Geben Sie dann Immersionsöl auf ein Objektiv mit 60-facher Vergrößerung und 1,52 NA. Legen Sie anschließend die Deckgläser mit den Deckgläsern nach unten auf den Dekonvolutionsmikroskoptisch, wobei die Deckgläser nach unten zeigen und richtig befestigt sind.

Verwenden Sie Hellfeld- oder Fluoreszenzbeleuchtung, um die Zielzellen zu identifizieren. Passen Sie anschließend den Fokus an, bis die Zielzellen deutlich zu erkennen sind. Bewegen Sie die Objektivlinse nicht außerhalb des Deckglasbereichs, um unnötige Kratzspuren zu vermeiden.

Identifizieren Sie als Nächstes GFP-GLUT4 anhand des GFP-Signals. Identifizieren Sie dann die gewünschten Zielzellen für die Bildaufnahme. Stellen Sie anschließend die richtigen experimentellen Parameter für jede Zielzelle ein, einschließlich Pixelzahl, Anregungswellenlänge, Transmissionsprozentsatz, Belichtungszeit, Stapeldicke, Zeitintervall und Gesamtbildgebungszeit.

Stellen Sie den Belichtungsparameter auf ca. 2000 bis 3000 Zählungen ein, um die maximale Pixelintensität zu erreichen. Um das Fluoreszenz-Photobleichen zu minimieren, reduzieren Sie den Prozentsatz der Anregungslichtdurchlässigkeit so weit wie möglich und halten Sie die Belichtungszeit auf weniger als eine Sekunde. Legen Sie die obere und untere Grenze des Z-Stapels für jede Zielzelle fest, indem Sie den Mikroskoptisch so bewegen, dass sowohl die Ober- als auch die Unterseite der Zielzelle leicht unscharf sind.

Es ist sehr wichtig, das fluoreszierende Photobleichen beim Neuronentod nach dem Lichtbild zu minimieren. Diese Abbildung zeigt, dass die primär kultivierten hypothalamischen Neuronen mit dem Neuronenmarker MAP2 markiert wurden. Der hypothalamische neuronale Marker POMC und ihre Co-Expression von CCR5.

Das co-lokalisierte Bild zeigt, dass CCL5 in POMC-positiven hypothalamischen Neuronen exprimiert wird. Diese Bilder zeigen die Expression des GFP-GLUT4-Proteins in Wildtyp-Hypothalamus-Neuronen und CCR5-Doppel-negativen Hypothalamus-Neuronen. Neuronen wurden mit Insulin oder CCL5 stimuliert.

Die Pfeile zeigen auf das GFP-GLUT4-Punktat in der Neuritis vor oder nach der Insulin- oder CCL5-Stimulation, und Sternchen zeigen die Oberfläche von GLUT4-GFP vor oder nach der CCL5-Stimulation an. Einmal gemeistert, kann diese Laboraufzeichnung der primären Zelltechnik zwischen einer und vier Stunden durchgeführt werden, abhängig von den Anforderungen des Experiments und ob es richtig durchgeführt wird. Diese Technik ebnete den Forschern auf dem Gebiet der Neurowissenschaften den Weg, um die Möglichkeit zu erforschen, die unmittelbare medikamenteninduzierte Wirkung in primären Zellkulturen zu charakterisieren.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein primäres hypothalamisches Neuron, ein Hippocampus-Neuron und ein kortikales Neuron isoliert. Neben dem Labor können Sie auch lernen, wie Sie eine Live-Aufnahme des seriellen Moleküls bei verschiedenen Stimulationen durchführen können. Vergessen Sie nicht, Ihren Laborkittel und Ihre Handschuhe anzuziehen und häufig Ethanol zu verwenden, um eine Kontamination durch Bakterien und Pilze von Tieren zu vermeiden.

Seien Sie auch sehr vorsichtig beim Umgang mit Deckgläsern und Neuronen während dieses Verfahrens.