Name: Studium der Hypothalamus Insulin-Signal an peripheren Glukoseintoleranz mit einem kontinuierlichen Medikament Infusion System in das Gehirn der Maus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-04T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Erfahren Sie die Rolle von CCL5 im Hypothalamus bei Insulinsignalwegen und Glukosestoffwechsel anhand von Mikro-Osmotik-Pumpen bei Mäusen. Diese Methode ermöglicht präzise Hirndrug-Delivery für metabolische Forschung.

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Wir sind dankbar, unterstützt vom Ministerium für Wissenschaft und Technologie, Taiwan – MOST105-2628-B-038-005-MY3(1-3) und Gesundheit und das Wohlergehen Zuschlag von Tabakwaren - MOHW106-TDU-B-212-144001 bis S-Y C.

Hinweis: Alle Protokolle und Methoden der tierische Themen wurden von institutionellen Animal Care und Nutzung Ausschüsse (IACUC) von Taipei Medical University genehmigt (Protokoll Zahlen: LAC-2014-0387)
1. Vorbereitung des Micro-osmotischen Pumpe Infusionssysteme
Hinweis: Bereiten Sie die Pumpe, künstliche Liquor cerebrospinalis (ACFS) Puffer und Medikament (Met-CCL5/RANTES Proteinlösung (10 ng/mL im ACFS)) unter sterilen Bedingungen mit Puffer mit 0,2 µm-Filter filtriert und führen Sie die Verfahren unter der Haube Kultur mit Handschuhen. Die Eingriffe werden wie folgt durchgeführt:
<ol>
	<li>Bereiten Sie die Mikro-osmotische Pumpen einen Tag vor der Operation: füllen Sie die Gehirn Mikro-osmotischen Pumpe mit künstlichen Liquor cerebrospinalis (ACFS) mit einer 1 mL Spritze und Nadel stumpf-Leiter zusammen mit dem Kit. Tauchen Sie die Mikro-osmotischen Pumpe in ACFS und legen Sie es auf einen Shaker und schütteln Sie es über Nacht. Achtung: Die Pumpe sollte voller ACFS und Luftblasen im Inneren der Pumpe (Abbildung 1A) vermieden werden.</li>
	<li>Bereiten Sie vor Beginn der Operation die rekombinante Met-CCL5/RANTES Proteinlösung (10 ng/mL, verdünnt in ACFS) in das Experiment verwendet werden. Entfernen Sie ACFS aus der Pumpe und füllen Sie die Pumpe mit der Wirkstofflösung langsam bis Übermaß austritt. Hinweis: 15 mL ACFS oder Met-CCL5/RANTES Lösung ist ausreichend für 5-8 Pumpen. Achtung: Wiederholen Sie den Vorgang, um sicherzustellen, dass die Pumpe mit dem Medikament ohne Luftblasen im Inneren vollständig gefüllt ist.</li>
	<li>Die Katheter-Rohre in die gewünschte Länge geschnitten und mit der stumpfen Ende Gehirn Infusion Nadel im Gehirn Infusion Kit beifügen. Füllen Sie die Infusion Kit und Rohre mit dem Medikament.</li>
	<li>Zu guter Letzt montieren Sie und befestigen Sie das Gehirn Infusion Kit zur Mikro-osmotischen Pumpe. Achtung: Keine Bläschen sollte in den Schlauch oder die Pumpe (Abbildung 1A) gebildet werden.</li>
	<li>Tauchen Sie die gesamte osmotischen Pumpe-Gehirn-Fusion inmitten ACFS in eine sterilisierte 50 mL-Tube, die Pumpe vor dem Austrocknen zu verhindern. Das osmotischen Pumpe-Gehirn-Fusion-Set ist nun bereit für Chirurgie verwendet werden. Hinweis: Die Mikro-osmotischen Pumpensysteme für langfristige Infusion der Droge einsetzbar. Dies sorgt für eine sichere und bequeme Art der Drug-Delivery in das Gehirn der Maus.</li>
</ol>
2. Intrazerebrale ventrikuläre Chirurgie-Implantation des osmotischen Mikropumpe
Achtung: Sterilisieren Sie der chirurgische Umgebung mit 75 % Ethanol zu und sicherzustellen Sie, dass die Menschen, die an der Studie beteiligten sterile Handschuhe und einen sauberen Kittel tragen. Chirurgische Instrumente / Instrumente autoklaviert und vor Gebrauch getrocknet und anschließend sterilisiert mit 75 % igem Ethanol dazwischen Mäuse Operationen sein müssen.
<ol>
	<li>Wiegen die Maus und betäuben sie mit Intra peritoneale Injektion (IP) mit Ketamin/Xylazin (Ketamin 50 mg/kg, Xylazin 10 mg/kg). Achtung: Mäuse Körpergewicht niedriger als 24 g sind nicht für die osmotischen Pumpe Implantation Operation empfohlen.</li>
	<li>Montieren Sie und befestigen Sie den Maus-Kopf auf die stereotaktische Apparatur (Abbildung 1 b).</li>
	<li>Verwenden Sie ein paar Chirurgische Scheren und Zangen die Außenhaut über den Schädel aufzuschneiden. Verwenden Sie Jod um zu den peripheren Schädel zu reinigen.</li>
	<li>Trennen Sie die äußerste Schicht der Haut von der subkutanen Haut mit Hilfe eines Paares von stumpfen Kopf Scheren in der Nähe von der Hals-Bereich für die osmotischen Pumpe-Gehirn Fusion Set Implantation (Abbildung 1).</li>
	<li>Markieren Sie den Punkt Infusion mit Bezug auf die Gehirn-Karte (Abbildung 1) mit der stereotaktische Apparatur. In diesem Experiment muss die Nadel in der Region 3rd Herzkammer implantiert werden (Bregma: 0.0 mm seitlichen, hinteren 1,3 mm, ventralen 5,7 mm).</li>
	<li>Bohren Sie ein Loch mit einem Nagel-Bohrer in der Umgebung auf den Schädel (Abbildung 1E) markiert. Achtung: Achten Sie darauf, die Maus Hirnhäute und Blutgefäße, wodurch die Störung von Mikro-Blutgefäßen im Gehirn zu brechen.</li>
	<li>Legen Sie die Mikro-osmotischen Pumpe-Gehirn-Fusion-Set mit ACFS (als Kontrolle) oder Medikamenten (Met-CCL5/RANTES Proteinlösung) unter die Haut hinter den Halsbereich und einfügen die Gehirn-Infusion Nadel in das Bohrloch, das Medikament in das Gehirn der Maus ( einfließen Abbildung 1E). Die Nadel wird der Hirnhäute eindringen und bekommen in den Ventrikel. Fixieren Sie die Nadel auf den Schädel mit Oberfläche desensibilisierende Gel (Abb. 1F) und warten Sie 1 – 2 min., bis der Leim trocknet. Als Nächstes schneiden Sie den überstehenden Teil auf die Nadel (Abbildung 1- H).</li>
	<li>Verwenden Sie ein Gewebe Klebstoff Leim, um den Betrieb, die Wunde am Kopf zu heilen. Gelten 50 µL des Klebers auf die Wunde, ziehen Sie beide Seiten der Haut zusammen und halten Sie für 30 s auf der Haut (Abb. 1I) versiegeln lassen. Achtung: Verwenden Sie 100 % Alkoholtupfer reinigen die Wunde nach der Operation und 100 Ul Penicillin mit Streptomycin, Infektion zu verhindern. Hinweis: Maus Haut wird Narbengewebe zu bilden und heilen in wenigen Tagen nach der Verabreichung des chirurgischen Klebers. Der Hauptvorteil des Klebers ist die Vermeidung von chirurgische Nähte die Reizung der Haut oder Entzündungen hervorrufen können.</li>
	<li>Statt die Maus in einem sauberen Käfig auf einem warmen Teller gehalten (bis zu 37 ° C erhitzt) und warten Sie, bis die Maus erholt sich von dem betäubenden Effekt. Achtung: Es ist entscheidend für die Maus Körpertemperatur um die Chance des Überlebens nach der Operation zu erhöhen.</li>
	<li>Nach einer einwöchigen Erholungsphase werden die Mäuse bereit für weitere Experimente, wie der orale Glukose-Toleranz-Test (OGTT) und Insulin-Toleranz-Test (ITT) sein.</li>
</ol>
(3) oralen Glukosetoleranztest (OGTT)
Hinweis: Führen Sie den oralen Glukosetoleranztest 7 Tage nach der Infusion der ACFS und MetCCL5/RANTES (10 ng/mL, 100 µL). Pflegen Sie einen 6 h schnell für die Mäuse vor OGTT mit ausreichender Wasserversorgung. Halten Sie die Tiere auf der gleichen Werkbank, wo die Experimente durchgeführt werden, so dass sie für die Umwelt zur Verringerung der Belastung während des Verfahrens akklimatisieren können.
<ol>
	<li>Vorbereitung der Glukose-Lösung: vor der Durchführung des Experiments, bereiten Sie die Glukoselösung durch Auflösen von 3,75 g Glukose in 15 mL destilliertem H2O.</li>
	<li>Richten Sie einen Zeitplan zum Aufzeichnen der Messwerte während der Versuchsdurchführung (Tabelle 1). Hinweis: Es ist wichtig, einen Zeitplan mit richtigen Abstände zwischen jeder Blutuntersuchung erlaubt genaue Aufzeichnung während des Experiments einzurichten.</li>
	<li>Wiegen Sie jede Maus nach dem Fasten und berechnen Sie die entsprechende Menge an Glukose injiziert werden.</li></ol>Wenn die Maus 30 g wiegt, sollte die Menge der Glukoselösung verabreicht werden beispielsweise 300 µL.
	<li>Die folgenden Instrumente an der Werkbank vorbereiten:<ol>
		<li>Blutzuckermessgerät (drücken Sie die Schaltfläche "Start" um den Akkuladestand, stellen Sie sicher, dass es funktioniert, bevor der Test.)</li>
		<li>Glukose-chip</li>
		<li>Insulin Spritze (0,3 mL Insulin Spritze)</li>
		<li>Rasierklingen</li>
		<li>Timer</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sobald die Bank eingerichtet, Messung und Aufzeichnung den Blutzuckerspiegel wie folgt: eine saubere und neue Glukose chip in das Blutzuckermessgerät und drücken Sie die Schaltfläche "Start" zu Null.</li>
	<li>Heben Sie die Maus von der Rückseite des Halses und streichle die Rute ein paar Mal um ausreichenden Blutfluss in die Heck-Region zu gewährleisten.</li>
	<li>Mit einer neuen Rasierklinge, ein kleines Stück der Schwanz abgeschnitten und einen kleinen Tropfen Blut auspressen (ca. 10-20 µL) in den Glukose-Chip. Das Blut sollte den Chip um genaue Messungen zu ermöglichen füllen. Das Blutzuckermessgerät wird die Glukose sofort angezeigt. Wenn die Maschine "Error" angezeigt wird, wiederholen Sie den Vorgang mit einem neuen Glukose-Chip. Hinweis: Der Glukose-Chip erfordert nur einen Tropfen Blut. Wenn die Blutprobe mehr als einmal gesammelt werden muss, Druck einfach durch Ausführen Ihre Finger entlang der Maus Rute mehrmals halten Sie das Ende der Rute direkt auf den Chip, um Blut zu sammeln. Es ist nicht notwendig, am Ende jedes Mal beim Sammeln von Blutproben schneiden.</li>
	<li>Als nächstes füttern Sie die Mäuse Glukose (0,25 g/mL) oral mit eines-Magensonde Technik. Die Menge an Glukose verabreicht werden sollte mithilfe der Formel berechnet werden: 10 X Körper Gewicht (BW) µL Glukoselösung (z. B., wenn die Maus wiegt 30 g, die Menge der Glukoselösung verabreicht werden 300 µL werden). Der Timer gestartet wird sofort nach der Verabreichung oraler Glukose.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Glukose-Messverfahren auf 15, 30, 60, 90 und 120 min.</li>
	<li>Nachdem alle Lesungen auf Glukose aufgenommen haben, verwerfen die Rasierklingen und Glukose-chips in einem Risikostoffe. Legen Sie die Lebensmittel wieder in die Mäuse Käfige und wieder in den Tierraum.</li>

4. Insulin-Toleranz-Test (ITT)
Hinweis: Toleranztest Insulin und oralen Glukosetoleranztest sollte mindestens 7 Tage auseinander geplant werden, um das Fasten Wirkung auf Tiere zu reduzieren. Für die Insulin-Toleranz-Test (ITT) wird Humaninsulin (0,75 U/Kg) durch IP-Injektion verabreicht werden.
<ol>
	<li>Vorbereitung von 0,25 U Insulinlösung: 100U Humaninsulin, das Verhältnis von 1: 400 in Kochsalzlösung zu verdünnen.</li>
	<li>Wiegen jeder Maus nach dem Fasten, und entsprechend die eingespritzte Menge an Insulin berechnen: Volumen (µL) von 0,25 U Insulin sein injiziert IP = 3 X BW (0,75 U Insulin/Kg Körpergewicht). Zum Beispiel: für eine Maus mit einem Gewicht von 28,8 g, injizieren: 28,8 X 3 = 86,4 µL (0,25 U verdünnt Insulin) (Tabelle 2). Achtung: Die gleichen Tiere möglicherweise unterschiedliche Körpergewichte nach 6 Stunden an verschiedenen Tagen Fasten. Daher ist es notwendig, das Körpergewicht zu messen, vor und nach dem Fasten und Verhalten, die die OGTT und ITT zu testen. Maus des Körpergewichts konnte je nach Spezies, Geschlecht und Fasten Dauer gelöscht werden. Höhere Dosen von Insulin Insulin Schock verursachen könnte und würde bis zum Tod des Tieres führen.</li>
	<li>Einrichten einer Tabelle (Tabelle 2) zum Aufzeichnen der Messwerte während der Versuchsdurchführung. Wiederholen Sie die Schritte 3.4. auf 3.8. für die Messung des Blutzuckerspiegels.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Der Mechanismus der chronischen Entzündung und damit verbundenen Chemokine wie CCL5 und seinen Rezeptor – unklar CCR5 bei der Entwicklung von Typ-2-Diabetes. Chronischer Entzündung verursacht Makrophagen Eindringen in Fettgewebe und wirkt sich auf die Regulierung der Adipokine; in der Zwischenzeit außerdem zieht β-Zellen und beeinträchtigt die Insulin-Sekretion von Langerhans-Inseln in Reaktion auf den Blutzucker. Hypothalamus im Gehirn spielt eine wichtige Rolle als ein Control-Center bei der Koordinierung von Insulin und Adipokine Signale aus dem systemischen peripheren Gewebe bei der Regulierung der Appetit, periphere Blut-Glukose-Stoffwechsel und Insulin-Reaktion. Viele Studien zeigen auch, dass Hypothalamus Entzündung zu mangelhaften Regulierung der Energiehomöostase sowie defekte Pankreas Inselchen und Leberfunktion2,3,9,10 führt. CCL5 im Gehirn trägt zur Aufnahme und Körper Temperatur Lebensmittelverordnung in den Hypothalamus11,12; die Korrelation von CCL5, Hypothalamus und systemische Insulin-Signal ist jedoch unklar. CCL5 Ganzkörper Knockout Maus (CCL5- / -) wurde erstellt, um die ein Insulin Widerstand Phänotyp mit höheren Insulinspiegel und hohe Blutzuckerwerte im Blut8zeigt mit dieser Frage beschäftigen. Allerdings erfordert es eine lange Zeit den T2DM-Phänotyp zu entwickeln und es ist schwierig, die Rolle und CCL5 im Hypothalamus Insulin-Signal durch mögliche Langzeitwirkungen kompensatorische Mechanismus zu untersuchen. Daher ist eine direkte Manipulation der CCL5 signalisieren in den Hypothalamus Neuronen der beste Ansatz. Allerdings gibt es mehrere Arten von Neuronen im Hypothalamus Region und es ist ziemlich teuer und zeitaufwendig, Zelle spezifische Knockout-Mäusen zu generieren. Unter Verwendung einer ICV kann Infusion System so sparen Sie Zeit und einen konkreteren Ansatz um CCL5 Funktion direkt in das Gehirn unter Umgehung mögliche peripheren Entzündungsreaktionen zu manipulieren.
Studien unter Verwendung osmotische Pumpen wurden bereits zuvor veröffentlicht bietet großartige Beispiele und Demonstrationen von Techniken die Implantation der osmotische Pumpen in Nagetieren13beteiligt. Allerdings standen wir ein paar Herausforderungen während im Anschluss an diese Protokolle in unserer Studie. Erstens ist ein Teil der Ausrüstung benutzt im Protokoll recht teuer, einschließlich (1) die elektrische Anlage zu erreichen, zeichnen und einsetzen der Nadel ins Gehirn der Maus, (2) das Thermo-System für die Aufrechterhaltung der Körpertemperatur Maus und (3) die Sauerstoff-Isofluran System für die Verwaltung der Anästhesie zu Mäusen zu liefern. Zweitens waren die Techniken, die in anderen Artikeln beschrieben schwer nachzuahmen, da wir nur Tiere innerhalb eines kleinen Bereichs von Körpergewicht und in bestimmten Altersstufen für unsere Studie nutzen konnten. Wir sind uns bewusst, dass größere Mäuse für Chirurgie und Implantation besser geeignet sind. Allerdings mussten wir in unserer Studie, kleinere und jüngere Mäuse verwenden Sie zur Vermeidung von Übergewicht und Alterungseffekte auf Insulin und Blut-Glukose-Verordnung: nur männliche Mäuse mit Körper 25 ± 2 g und Alter Gewicht ca. 2 Monate alt wurden in der Studie ausgewählt. Daher ist es schwierig zu operieren und Naht die Wunde auf den Maus-Kopf. Drittens muss die entzündliche Reaktion nach der Operation minimiert werden, da eine entzündliche Cytokine das Ziel dieser Studie ist. Mäuse und Ratten können Naht zu entfernen und offenen Wunden leicht nach der Operation, die führt zu Entzündungen und Chemokin Reaktionen zu erhöhen. Daher ist eine Strategie, die Position erreichen und ziehen und stechen die Nadel ins Gehirn der Maus, der Sekundärinfektion vermeidet notwendig. Daher haben wir die zuvor beschriebenen Protokolle, um diese Technik kostengünstiger, einfacher und weniger schädlich für die Tiere machen, wie im folgenden Absatz beschrieben geändert.
Erstens haben wir einen Nagel bohren um manuell ein Loch um den Zielbereich markiert auf dem Schädel zu bohren, wie unter Punkt 2.6 beschrieben. Diese Methode ist kostengünstig und ermöglicht es uns, das gesamte Verfahren um nicht zu beschädigen die Maus Hirnhäute und Blutgefäße zu überwachen. Blut-Glukose-Verordnung wird nach akutem Schlaganfall, wie z. B. eine Blutung im Gehirn beeinträchtigt. Akuten Hyperglykämie und Diabetes-ähnliche Syndrome wurden auch nach einem Schlaganfall im klinischen Umfeld14,15beobachtet. Ebenso fanden wir auch wertgemindert Glukose-Ebene und Insulin-Reaktion bei Mäusen mit Blutungen und Eiter im Gehirn. Wir sind uns bewusst, dass bessere Kontrolle der Handbuch-basierte Chirurgie zur Sicherstellung der Konsistenz der Ergebnisse notwendig ist. Zweitens, nutzten wir eine neu entwickelte medizinische Biomaterial allgemein verwendet in Kliniken, Gewebe Klebstoff Leim (Schritt 2,8), um die Haut zu versiegeln auf den Maus-Kopf nach der Operation, daher Stiche zu vermeiden und die Rate der Heilung zu beschleunigen. Dies erleichtert chirurgische Eingriffe durchführen und verringert die Gefahr von sekundären Entzündung. Drittens ist der Zeitaufwand für das gesamte chirurgische Verfahren durchzuführen vergleichsweise kürzer, das erhöht die Chance des Überlebens für die Mäuse und senkt die Dosierung der betäubende Droge injiziert intraperitoneal. Wir beobachteten eine hohe Überlebensrate (95 %) und relativ genaue Ergebnisse durch Anschluss an diese geänderte Protokoll erhalten.
Die Einschränkung dieser Technik ist die relativ kurzen Zeitrahmen der Drug-Delivery. Obwohl eine osmotische Pumpe in den Körper der Maus Alternativ platziert werden kann ohne erneute Öffnung des Gehirns, unsere Studie nur konzentriert sich auf die entzündlichen Chemokin-Wirkung auf das Gehirn, die peripheren systemischen Insulin Signalisierung zu regulieren. Zusätzliche Operation in peripheren Geweben könnte möglicherweise eine Entzündungsreaktion in peripheren Geweben, induzieren, die dann entzündliche Chemokin Ausdruck zu erhöhen und die Ergebnisse beeinflussen. Zweitens, die Halbwertszeit des Medikaments schränkt auch die Dauer der Studie. Rekombinante Proteine wie Chemokin haben in der Regel eine kürzere Halbwertszeit, die ihre Tätigkeit im Laufe der Zeit verliert, obwohl es auch erlaubt, die Wirkung von blockierenden CCL5 Signalisierung im Gehirn kurzfristig zu untersuchen. Unsere früheren Studien haben auch einen genetische Veränderung Ansatz zur Generierung von CCL5 Knockout Maus, bietet ein Modell mit langfristigen Auswirkungen8beschrieben.
Es gibt einige neue Techniken und alternative Methoden, Drogen ins Gehirn zu liefern. Nanotechnologie ist eine leistungsstarke Technik, die verwendet werden können, um Drogen in das zentrale Nervensystem zu liefern. Viele Medikamente sind wärmeempfindlichen jedoch und können zerstört werden, wenn Sie versuchen, sie in Nanopartikel16zu verpacken. Darüber hinaus Nanopartikel können BBB durchlaufen und werden Uptaken von Zellen, die für SiRNA oder am häufigsten verwendeten Medikamente geeignet sind, aber es ist keine ideale Methode für Ligand-Rezeptor-Bindung.CCL5 erfordert Bindung an seinen Rezeptor CCR5, in den Hypothalamus ARC Neuronen zu Effekt8, und die Lieferung von CCL5 Antagonist MetCCL5 in Neuronen durch Nanopartikel könnten dazu führen, dass einen Verlust der Fähigkeit zu binden und CCR5 auf der Zelle blockieren Oberfläche.
Der Blutzuckerspiegel war signifikant höher bei Mäusen in der oralen Glukosetoleranztest mit CCL5-Antagonist MetCCL5 im Vergleich zu den Steuerelementen (Mäuse mit ACFS verabreicht) verabreicht. Zusätzliche Insulingaben (Insulin-Toleranz-Test) war auch nicht in der Lage, den Blutzuckerspiegel in MetCCL5 erhalten Mäuse (Abbildung 4 b), zu senken, was darauf hindeutet, dass endogene und externe Insulin den Blutzuckerspiegel senken können beim Hypothalamus CCL5 Signalisierung blockieren. Mäuse wurden Insulin resistent ohne CCL5 Aktivität im Hypothalamus. Erhöhte serine302 Phosphorylierung des IRS-1 wurde bei den Mäusen, die Met-CCL5 im Vergleich zu Kontroll-Mäusen erhalten ACFS (Abbildung 5A-B) Eingang gefunden. Serin 302 Phosphorylierung des IRS-1 hat gezeigt, dass eine physikalische Dissoziation des IRS-1 aus der Insulinrezeptor, induzieren, die eine der Hauptursachen der Insulin-Resistenz-6; Insulin ist nicht nachgelagerten Signale wie der PI3K-Akt-Signalweg aktivieren. Eine ex-Vivo -Insulin-Stimulation-Studie bestätigt das Insulin, die nachgeschalteten Signalmolekül Akt (p-AktS473) nicht durch Insulin im Hypothalamus Gewebe Maus aktiviert wurde angereichert mit Met-CCL5 und stattdessen die Serin 302 Phosphorylierung erhöht. Insgesamt zeigen physiologische Daten (OGTT und ITT) und molekulare Studie, dass Hypothalamus CCL5 Signalisierung die Hypothalamus Insulin-Signal-Verordnung, vermittelt die systematische Insulin-Resistenz und Glukose-Stoffwechsel beiträgt.
Die Rolle und die Mechanismen der CCL5 und CCR5 bei Adipositas-assoziierten Diabetes bleibt unklar. Kitade Et Al. berichteten, dass CCR5-Mangel von Fettleibigkeit bedingte Entzündung, Makrophagen Rekrutierung und Insulin-Resistenz-17Mäusen geschützt. Jedoch haben andere Studien von Kennedy Et Al. entgegengesetzte Ergebnisse darauf hinweist, dass CCR5-Mangel beeinträchtigt systemische Glukosetoleranz sowie Adipocyte und Muskel Insulin Signalisierung18gefunden. Beide Studien angewendet eine fettreiche Ernährung, Übergewicht, induzieren die Ganzkörper chronische Entzündung und kompensatorische Reaktion führt. Diese Studien haben keine saubere und klare Mechanismen von CCL5 und CCR5 in Insulin Signalisierung Verordnung vorgelegt. Auf der anderen Seite die osmotischen Pumpe-Technik ermöglicht eine Gehirn-spezifische-Infusion und vermeidet kompensatorische Reaktion mit der zeitlich befristeten Lieferung.
Zusammenfassend, obwohl die osmotische Pumpe mit dem Gehirn Infusion System eine "altmodische" Technik zu sein scheint, bietet es eine billigere, einfachere und weniger schädliche Methode der Drug-Delivery und hilft untersuchen die Funktion des Ligand-Rezeptor Signalgebung der Gehirn.

Insulin wirkt sich eine Vielzahl von Geweben, einschließlich des Gehirns. Insulin führt durch die Blut - Hirn-Schranke, tritt in das zentrale Nervensystem (ZNS) und bindet mit Insulin-Rezeptor (IR) im Hypothalamus, Nahrungsaufnahme, Aktivität des sympathischen Nervensystems und periphere Insulin-Reaktion zu regulieren. Chronische Entzündungen im peripheren Fettgewebe soll dazu beitragen, Typ 2 Diabetes Mellitus (T2DM), aber wie diese Entzündungsreaktionen Insulin beeinflussen, systemische Insulin-Reaktion und Glukose-Intoleranz vermitteln im Hypothalamus Signale bleibt unklar. Einige Chemokine Teilnahme an Appetit Verordnung und Regulierung der Körpertemperatur im Hypothalamus1 wie Tumor-Nekrose-Faktor-Alpha (TNF), Interleukin (IL) -6, IL-1β, Monocyte Lockstoffgradient Protein-1 (MCP-1) und CCL5 (C-C Motif Ligand 5 ). Darüber hinaus führt die Entzündung im Hypothalamus zu einer Insulinresistenz bei T2DM2,3.
Unter diese Chemokine, die Änderung der Ausdruck Niveaus der Chemokin CCL5 und seinen Rezeptor wurde CCR5, in Fettgewebe mit Arteriosklerose und Glukose-Intoleranz in T2DM im Menschen als auch Tiere in Verbindung gebracht. CCL5 hat auch neuroendokrine Funktionen, einschließlich der Regulierung von Essen-Aufnahme und die Körpertemperatur, im Hypothalamus. Es ist daher wichtig zu untersuchen, ob CCL5 an Insulin Signal Aktivierung innerhalb der Hypothalamus oder der peripheren Geweben beteiligt ist.
Insulin-Signal ist streng in den Zellen reguliert. Die Bindung von Insulin, Insulin-Rezeptoren (IR) aktiviert Insulin Rezeptorproteine Substrat (IRS), gefolgt von Phosphatidylinositol-3-Kinase (PI3K) und Protein Kinase B (PKB/AKT) Aktivierung und Glukose-Transporter-4 (GLUT4) Membran Translokation4 . IRS-Proteine sind die wichtigsten Regulatoren in dieser Signalweg: sie haben mehrere Tyrosin und Serin Rückstände, die als Reaktion auf Positive phosphoryliert werden können oder negative Insulin signalisiert5. Zum Beispiel kann Serin 302 Phosphorylierung von IRS-1 führen zu die physische Trennung von IRS-1 von IR und Insulin-Signaltransduktion, führt zu Insulin-Resistenz-6zu blockieren. Die Aktivität Beeinträchtigung der IRS Proteine im Hypothalamus hat sich gezeigt, Insulin-Resistenz und Glukoseintoleranz in Mäusen7zu induzieren.
Eine gängige Methode, um die Funktion eines bestimmten Gens zu untersuchen ist die Manipulation des Ausdrucks der Zielgene verteilt über den gesamten Körper des Organismus. Dies kann jedoch einige Nachteile haben: (1) es könnte im Laufe der Zeit verschiedene Rückkopplungseffekte regulatorischen oder kompensatorische erzeugen und (2) diese Methode nicht hilft uns die Rolle des Zielproteins in bestimmten Gehirnregionen zu veranschaulichen. Auch Gewebe und zellspezifische gen Knockout Tiere sehr lange dauern, zu züchten und sind teuer. So verwenden wir eine kurzfristige Infusion osmotischen Pumpe Hirnsystem - eine relativ schnelle und bequeme Möglichkeit, stören die Signalisierung des Zielproteins in das Gehirn der Antagonist Droge verwenden, um die genannten Probleme zu überwinden. Stereotaktische Injektionen verwendet, um komplizierte chirurgische Kompetenz und umfangreiche Investitionen in Instrumentierung und Zeit erfordern. In diesem Protokoll bieten wir eine einfache und sichere Möglichkeit, stereotaktische Injektion und eine schnell, weniger schädlich und momentane Methode, um die Konzentration von Glukose im Blut zu erkennen und untersuchen die Rolle von CCL5 im Hypothalamus Insulin Signalisierung Verordnung durchführen.

<table><tbody><tr><td>Vetbond Tissue Adhesive</td><td>3M</td><td>#1049SB</td><td>Der Klebstoff, der verwendet wird, um die Läsionsstelle auf dem Mauskopf zu versiegeln</td></tr><tr><td>LOCTITE 454 Sofortklebstoff</td><td>Durect Corporation</td><td>#8670</td><td>Der Kleber, der verwendet wird, um die Nadel am Mäuseschädel zu befestigen</td></tr><tr><td>Alzet Mikroosmotische Pumpe</td><td>Durect Corporation</td><td>#9922</td><td>0.11 &mu; l pro Stunde, 28 Tage</td></tr><tr><td>Gehirninfusionssystem</td><td>Durect Corporation</td><td>#8851</td><td>1-3 mm, wird verwendet, um das Medikament in das Gehirn der Maus zu perfundierten</td></tr><tr><td>Blutzuckermessgerät</td><td>Roche</td><td>#06870244001</td><td>Wird verwendet, um den Blutzuckerspiegel</td></tr><tr><td>zu messen Glukosechip</td><td>Roche</td><td>#06454011020</td><td>Wird verwendet, um die Blutprobe zu laden</td></tr><tr><td>Evans blaues</td><td>Sigma</td><td>#MKBK0523V</td><td>Um die Medikamenteninfusion zu demonstrieren Bereich</td></tr><tr><td>Insulinspritze</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>#3232145 C</td><td>Zur intraperitonealen Verabreichung</td></tr> von <tr><td>Insulin MIO NE116 CONTROL UNIT (Nagelbohrer)</td><td>Mio System</td><td>#E235-015</td><td>Zum Bohren eines Lochs in den Schädel der Maus</td></tr><tr><td>CCL5/Met-RANTES Protein</td><td>R& D</td><td>#ADB0111081</td><td>Rekombinantes humanes CCL5, E-coli abgeleitetes</td></tr><tr><td>aCSF-Rezept</td><td>119 mM NaCl 26,2 mM NaHCO3 2,5 mM KCl 1 mM NaH2PO4 1,3 mM MgCl2 10 mM Glukosefilter</td><td></td><td>sterilisieren mit einem 0,22 μm m filtrieren und bei 4°C. lagern aCSF ist 3-4 Wochen lang stabil</td></tr><tr><td>Phospho-IRS-1 Serin302 Antikörper</td><td>Zellsignalisierung</td><td>#12879</td><td>1:1000 Verdünnung</td></tr><tr><td>IRS-1 (D23G12) Antikörper</td><td>Zellsignalisierung</td><td>#12879</td><td>1:1000 Verdünnung</td></tr><tr><td>Phospho-Akt Serin 473 Antikörper</td><td>Zellsignalisierung</td><td>#9916</td><td>1:2000 Verdünnung</td></tr><tr><td>Akt (pan) (C67E7) Antikörper</td><td>Zellsignalisierung</td><td>#9916</td><td>1:1000 Verdünnung</td></tr><tr><td>Tiere: C57BL/6</td><td>NAR Labs Wildtyp-Mäusestamm</td><td></td>, <td>der in der Studie verwendet wurde</td></tr></tbody></table>

studium der hypothalamus insulin-signal an peripheren glukoseintoleranz mit einem kontinuierlichen medikament infusion system in das gehirn der maus

Studying the Hypothalamic Insulin Signal to Peripheral Glucose Intolerance with a Continuous Drug Infusion System into the Mouse Brain

Insulin reguliert den Stoffwechsel systematisch in den Hypothalamus und die peripheren Insulinreaktion. Eine Entzündungsreaktion im peripheren Fettgewebe trägt zu Typ-2 Diabetes Mellitus (T2DM) Entwicklung und Appetit Verordnung im Hypothalamus. Chemokine CCL5 und C-C-Chemokin-Rezeptor Typ 5 (CCR5) Stufen vorgeschlagen worden, um Arteriosklerose und Glukose-Intoleranz bei Typ 2 Diabetes Mellitus (T2DM) zu vermitteln. Darüber hinaus Rolle CCL5 eine neuroendokrine im Hypothalamus geregelt Essen Einnahme und die Körpertemperatur, so fordert uns, seine Funktion im Hypothalamus Insulin-Signal und die Regulierung der peripheren Glukose-Stoffwechsel zu untersuchen.
Das Mikro-osmotischen Pumpe Gehirn Infusion System ist eine schnelle und präzise Weise zu manipulieren CCL5 Funktion und seine Wirkung im Gehirn zu studieren. Es bietet auch eine bequeme alternative Herangehensweise zur Erzeugung einer transgenen Ko-Tieres. In diesem System wurde CCL5 Signalisierung von Intracerebroventricular (ICV) Infusion von seinen Gegenspieler, MetCCL5, mit einem Mikro-osmotischen Pumpe blockiert. Die peripheren Glukose-Stoffwechsel und Insulin Reaktionsfähigkeit wurde durch den oralen Glukose-Toleranz-Test (OGTT) und Insulin-Toleranz-Test (ITT) festgestellt. Insulin Signalisierung Aktivität wurde dann durch Protein-Blot aus Gewebeproben, die von den Tieren abgeleitet analysiert.
Nach 7-14 Tagen von MetCCL5 Aufguss, den Metabolismus von Glukose und Insulin wurde bei Mäusen, Reaktionsfähigkeit beeinträchtigt, wie in den Ergebnissen der OGTT und ITT gesehen. Die IRS-1 serine302 Phosphorylierung wurde erhöht und die Akt-Aktivität wurde in Mäusen Hypothalamus Neuronen nach CCL5 Hemmung reduziert. Insgesamt zufolge unsere Daten blockieren CCL5 in das Gehirn der Maus erhöht die Phosphorylierung des IRS-1 S302 und unterbricht Hypothalamus Insulin-Signal, führt zu einem Rückgang der Insulinfunktion in peripheren Geweben sowie die Beeinträchtigung der Glukose Stoffwechsel.

Chirurgische Implantationen von osmotischen Infusionspumpen, enthalten entweder ACFS als Kontrolle oder CCL5 Antagonist MetCCL5 (zu CCL5 Wirkungen im Gehirn blockieren) wurden an den Mäusen durchgeführt. Bei 7 bis 14 Tage nach der Operation wurden die peripheren Glukosetoleranz und Insulin Reaktionsfähigkeit von Mäusen mit OGTT (nach 7 Tagen) und ITT (nach 14 Tagen), wie im Protokoll erwähnt analysiert. Die oralen Glukosetoleranztest (OGTT) und Insulin-Toleranz-Test (ITT) von Mäusen waren nach 6 Stunden Fasten durchgeführt. Mäuse wurden mit Glukose oral, mit dem Betrag anhand ihrer jeweiligen Körpergewicht verabreicht. Die Änderungen in den Blutzuckerspiegel wurden aufgezeichnet, wie in Abbildung 3dargestellt. Die Insulin-Empfindlichkeit-Test wurde von intraperitoneal (IP)-Insulin-Injektion in Mäusen durchgeführt und die Änderung des Blutzuckerspiegels wurde sofort gemessen. Die Veränderungen der Blutzuckerwerte nach Insulin-Stimulation bei Mäusen mit verschiedenen Infusion Medikamente wurden aufgezeichnet, wie in Abbildung 4dargestellt. Der Blutzuckerspiegel wurde nach Glukose-Verwaltung (Abb. 3 b) und Insulininjektion (Abbildung 4 b) bei Mäusen mit CCL5 Antagonist (MetCCL5) Infusion im Vergleich zu Mäusen mit ACFS Infusion nur geringfügig reduziert. Diese Ergebnisse zeigen Beeinträchtigungen der Insulinfunktion auf periphere Glukosestoffwechsel bei Mäusen mit MetCCL5 in das Gehirn verabreicht.
Als nächstes haben wir die Aktivierung der Insulin-Signal durch die Auswertung der IRS-1 Phosphorylierung und Akt Aktivierungsniveaus im Hypothalamus Gewebe analysiert. Die Serin-Phosphorylierung auf 302 des IRS-1 wurde hochreguliert bei Mäusen mit Antagonisten (MetCCL5) behandelt (Abbildung 5 b-C) als Mäuse normal gefüttert wurden. In der Kontrollgruppe wurde an Mäusen Hypothalamus ACFS verwaltet und die Insulin-Herausforderung aktiviert das nachgeschaltete Signalmolekül Akt (phosphorylierten Akt Serin 473) (Abbildung 5, F) ohne Erhöhung der IRS-1 (serine302) Aktivierung Abbildung 5 -E) und Akt serine473 Phosphorylierung. Im Gegensatz dazu das Akt-Signal wurde nicht erhöht, bei Mäusen mit MetCCL5 infundiert, aber stattdessen gab es eine Zunahme der Phosphorylierung des IRS-1 Serin 302. Unterdessen unterbrochen, blockiert das CCL5 Signal im Gehirn Maus Insulin Aktivität im Hypothalamus und beeinträchtigt peripheren Insulinfunktion. Von unserer generellen Feststellungen, z. B. die Ergebnisse von ITT, OGTT und ex Vivo Insulin Herausforderung schlossen wir, dass CCL5 im Hypothalamus zu Insulin Signal Aktivierung und peripheren Glukosestoffwechsel nach Insulin Stimulation beiträgt.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56410/56410fig1.jpg"> 
Abbildung 1: Osmotischen Pumpe Vorbereitung und Implantation chirurgischen Eingriff in Maus. (A) die Gehirn-Infusion Kit und Pumpe Vorbereitung mit Wirkstofflösung durchblutet. Rote Pfeile zeigen die Katheter-Röhrchen mit Flüssigkeit gefüllt. (B) Fix und montieren den Maus-Kopf auf die stereotaktische Apparatur. (C) trennen die äußerste Schicht der Haut von der subkutanen Haut für die Implantation von Mikro-osmotischen Pumpe-Gehirn-Infusions-Set; Strich-Linien geben den Standort der osmotischen Pumpe Implantate. (D) den Pfeil zeigt die Aufguss-Seite. (E) Bohrer ein Loch um den markierten Bereich auf dem Schädel. (F) Ort der osmotischen Pumpe-Gehirn-Infusion in der Rückseite der Maus und Nadel Gehirn Infusion in das gebohrte Loch (Strich eingekreist). (G) die Nadel auf den Schädel mit Gewebe-Klebeband Klebstoff befestigen und lösen die Spitze der Nadel (Schere spitz in G), wie in (H) gezeigt. (ich) die Wunde mit Klebstoff Gewebekleber. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56410/56410fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56410/56410fig2.jpg"> 
Abbildung 2. Repräsentative Bilder des Bereichs Verbreitung Droge, wenn das Medikament in der ventrikulären Region mit der osmotischen Pumpe verabreicht wird. Evan blau ist das repräsentative Medikament in der osmotischen Pumpe Medikament Infusion Abbildung in der ventrikulären Region (A) und Diffusion in Seiten- und dritten Ventrikel (B) verwendet. Maßstabsleiste = 0,5 cm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56410/56410fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56410/56410fig3.jpg"> 
Abbildung 3. Glukose-Stoffwechsel der Mäuse nach der Operation durch den oralen Glukosetoleranztest (OGTT) gemessen. Die Verteilung der Blutzuckerspiegel verändert folgt die orale Verabreichung von Glukose im WT Mäuse mit ACFS (A) und Antagonist, MCCL5 infundiert (B). Angaben als Mittelwert ± se. (Abbildung modifiziert aus:8). * p &lt; 0,05, durch zwei-Wege-ANOVA. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56410/56410fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56410/56410fig4.jpg"> 
Abbildung 4. Insulinfunktion in Mäusen den Blutzucker - Insulin-Toleranztest (ITT). Die Verteilung der Blutzuckerspiegel verändert nach Insulininjektion bei WT-Mäusen mit ACFS (A) infundiert und infundiert mit Antagonist, MCCL5 (B). Angaben als Mittelwert ± SE (Abbildung modifiziert aus:8). p &lt; 0,001, durch zwei-Wege-ANOVA. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56410/56410fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56410/56410fig5.jpg"> 
Abbildung 5. Insulin-Signal Aktivität bei Mäusen nach der Operation. (A) westliche Beflecken der hemmenden Serin 302 Phosphorylierung Form der IRS-1 (Insulin Antwort Substrat-1, pIRS1S302) in Mäusen Hypothalamus Gewebe mit ACFS oder CCL5 Antagonist, MetCCL5 behandelt (MCCL5) Infusionspumpe. (B) damit verbundenen Ebenen der Phosphor-IRS-1S302 nach der Infusion in Mäusen Hypothalamus mit der normalen Fütterung.(C) westliche Beflecken der S302 Phosphorylierung des IRS-1 und Akt Aktivierung (Phosphor-Akt S473, pAktS473) mit oder ohne Insulin Stimulation im Hypothalamus Gewebe nach ACFS oder METCCL5 Infusion. (D-E) Relativen Pegel der pIRS-1S302, pS6KT421und pAktS473. ("2" in jeder Bar Graph steht für: n = 2 für alle Quantifizierungen). (Die leere Balken 5D-e, Links: die Streifen-Bars in 5D-E, ohne Insulin; rechts: mit Insulin). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56410/56410fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#</td>
			<td>Maus-ID</td>
			<td>Körper</td>
			<td>Glukose</td>
			<td>Start</td>
			<td>0</td>
			<td>15</td>
			<td>30</td>
			<td>60</td>
			<td>90</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Gewicht</td>
			<td>Μl = 10xBW</td>
			<td>Zeit</td>
			<td>min.</td>
			<td>min.</td>
			<td>min.</td>
			<td>min.</td>
			<td>min.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>501</td>
			<td>25,8 g</td>
			<td>258</td>
			<td>09:00</td>
			<td>09:00</td>
			<td>09:00</td>
			<td>09:15</td>
			<td>09:30</td>
			<td>10:00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>502</td>
			<td>25,3 g</td>
			<td>253</td>
			<td>09:07</td>
			<td>09:07</td>
			<td>09:07</td>
			<td>09:22</td>
			<td>09:37</td>
			<td>10:07</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabelle 1. Zeitplan für oraler Glucose-Toleranz-Test (OGTT) Aufnahme
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#</td>
			<td>Maus-ID</td>
			<td>Körper</td>
			<td>Insulin 0,25 IU</td>
			<td>Start</td>
			<td>0</td>
			<td>15</td>
			<td>30</td>
			<td>60</td>
			<td>90</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Gewicht</td>
			<td>Μl = 3xBW</td>
			<td>Zeit</td>
			<td>min.</td>
			<td>min.</td>
			<td>min.</td>
			<td>min.</td>
			<td>min.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>501</td>
			<td>28,8 g</td>
			<td>86,4</td>
			<td>09:00</td>
			<td>09:00</td>
			<td>09:15</td>
			<td>09:30</td>
			<td>10:00</td>
			<td>10:30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>502</td>
			<td>25,3 g</td>
			<td>75,9</td>
			<td>09:07</td>
			<td>09:07</td>
			<td>09:22</td>
			<td>09:37</td>
			<td>10:07</td>
			<td>10:37</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabelle 2. Zeitplan für die Insulin-Toleranz-Test (ITT) Aufnahme

Dieses Protokoll untersucht die Rolle der Chemokin (C-C-Motiv) Liganden 5 (CCL5) im Hypothalamus durch die Bereitstellung von Antagonist MetCCL5, in das Gehirn der Maus mit einem Mikro-osmotischen Pumpe Gehirn Infusion System. Diese vorübergehende Hemmung der CCL5 Aktivität unterbrochen Hypothalamus Insulin Signalisierung, Glukoseintoleranz und periphere systemische Insulinsensitivität führen.

Studium der Hypothalamus Insulin-Signal an peripheren Glukoseintoleranz mit einem kontinuierlichen Medikament Infusion System in das Gehirn der Maus

Insulin regulates systematic metabolism in the hypothalamus and the peripheral insulin response. An inflammatory reaction in peripheral adipose tissues ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, die Rolle des hypothalamischen C-C-L-5-Signalwegs für die Insulinfunktion im peripheren System und den Glukosestoffwechsel zu untersuchen, indem der C-C-L-5-Signalweg manipuliert wird, indem der Antagonist Met-C-C-L-5 über ein interzerebrales ventrikuläres Verabreichungssystem, die mikroosmotische Pumpe, verabreicht wird. Dieses Arzneimittel kann helfen, die Schlüsselfragen auf dem Gebiet der biochemischen Physiologie zu beantworten, wie z. B. Chemokin C-C-L-5 bei der Kontrolle des Glukosestoffwechsels des Körpers und der Insulinreaktionsfähigkeit im Gehirn. Der Hauptvorteil dieser Maßnahme besteht darin, dass der Experimentator bestimmte Signale im Gehirn für einen bestimmten Zeitraum leicht manipulieren kann, wie z. B. das C-C-L-5 hier drin, ohne kompensatorische Wirkung oder Entwicklung einer Störung, was normalerweise passiert, wenn wir genetische Manipulationen bei Nagetieren durchführen.Die visuelle Demonstration dieses Verfahrens ist wichtig, da das Einsetzen einer mikroosmotischen Pumpe und die genaue Messung des Insulin- und Glukosespiegels im Blut Geschicklichkeit und Präzision erfordern. Bereiten Sie einen Tag vor der Operation mikroosmotische Pumpen des Gehirns vor, indem Sie eine Ein-Milliliter-Spritze und eine stumpfe Kopfnadel verwenden, um die Pumpen mit künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit oder A-C-S-F zu füllen. Tauchen Sie dann die Pumpe in A-C-S-F ein und stellen Sie sie auf einen Shaker, um sie über Nacht sanft zu schütteln.Nehmen Sie am nächsten Tag das A-C-S-F aus der Pumpe und füllen Sie es vollständig mit zuvor vorbereiteter Arzneimittellösung, verdünnt in A-C-S-F, bis der Überschuss austritt. Schneiden Sie dann mit einer chirurgischen Schere die Katheterschläuche auf die gewünschte Länge ab. Befestigen Sie die Schläuche mit einer stumpfen Hirninfusionsnadel am Gehirninfusionsset.Füllen Sie dann die Röhrchen im Infusionskit mit der Arzneimittellösung. Nachdem Sie das Kit zusammengebaut haben, befestigen Sie es an der Mikroosmosepumpe. Um ein Austrocknen der Pumpe zu verhindern, tauchen Sie die Einstellung der osmotischen Pumpe für die Gehirninfusion in A-C-S-F in ein sterilisiertes 50-Milliliter-Röhrchen.Um die Operation zu beginnen, montieren Sie den Kopf einer anästhesierten Maus und befestigen Sie ihn an einem stereotaktischen Gerät. Schneiden Sie mit einer chirurgischen Schere und einer Zange die äußere Haut auf, die den Schädel bedeckt. Verwenden Sie dann Jod, um den peripheren Schädel zu reinigen.Verwenden Sie anschließend eine Schere mit stumpfem Kopf in der Nähe der Halsregion, um die äußerste Hautschicht von der subkutanen Haut für die Implantation des osmotischen Pumpen-Gehirnfusionssets zu trennen. Verwenden Sie das stereotaktische Gerät, um den Infusionspunkt in Bezug auf die Gehirnkarte zu markieren. Bohren Sie mit einem Nagelbohrer ein Loch um den markierten Bereich auf dem Schädel und achten Sie darauf, dass die Hirnhäute und Blutgefäße der Maus nicht beschädigt werden.Platzieren Sie dann das mikroosmotische Pumpen-Gehirnfusionsset, das das interessierende Medikament oder A-C-S-F als Kontrolle enthält, unter der Haut hinter der Halsregion. Um das Medikament in das Gehirn zu infundieren, führen Sie die Gehirninfusionsnadel in das Bohrloch ein. Verwenden Sie oberflächendesensibilisierendes Gel, um die Nadel auf dem Schädel zu fixieren, und warten Sie, bis der Kleber getrocknet ist.Schneide den überstehenden Teil oben auf der Nadel ab. Bevor Sie mit dem Glukosetoleranztest beginnen, bereiten Sie die Glukoselösung vor, indem Sie 3,75 Gramm Glukose und 15 Milliliter destilliertes Wasser auflösen. Erstellen Sie einen Zeitplan mit angemessenen Abständen zwischen den einzelnen Blutuntersuchungen, um die Messwerte während des Experiments aufzuzeichnen.Wiegen Sie als Nächstes jede Maus nach dem Fasten, um die geeignete Menge an Glukose für die Injektion zu berechnen. Bereiten Sie dann an der Werkbank einen Timer, einen Glukosechip, ein Blutzuckermessgerät, eine Insulinspritze und Rasierklingen vor. Um den Blutzuckerspiegel zu messen, setzen Sie zunächst einen neuen Glukosechip in das Blutzuckermessgerät ein und drücken Sie die Starttaste, um den Nullpunkt zu stellen.Nehmen Sie dann die Maus im Nacken und streichen Sie über ihren Schwanz, um eine ausreichende Durchblutung zu gewährleisten. Schneide mit einer neuen Rasierklinge ein kleines Stück des Schwanzes ab und drücke dann einen Tropfen Blut in den Glukosechip. Füttern Sie die Maus mit Hilfe der intragastrischen Spültechnik mit Glukose und starten Sie sofort den Timer.Messen Sie die Glukose zu verschiedenen Zeitpunkten. Um den Insulintoleranztest zu starten, bereiten Sie 0,25 Einheiten Humaninsulinlösung vor. Wiegen Sie dann jede Maus nach dem Fasten, um die geeignete Insulinmenge für die Injektion zu berechnen.Richten Sie als Nächstes einen Zeitplan ein, um die Messwerte während des Experiments aufzuzeichnen. Messen Sie abschließend nach der Insulininjektion den Blutzuckerspiegel wie zuvor. Der Glukosestoffwechsel wurde durch den oralen Glukosetoleranztest nach der Operation nach der oralen Verabreichung von Glukose bei Mäusen gemessen.Die Veränderungen des Blutzuckerspiegels bei Mäusen, die mit A-C-S-F oder mit dem C-C-L-5-Antagonisten infundiert wurden, werden hier aufgezeichnet und gezeigt. Der Insulinsensitivitätstest wurde ebenfalls durchgeführt und der Blutzuckerspiegel bei Mäusen, die mit einem C-C-L-5-Antagonisten infundiert waren, war im Vergleich zu Kontrollmäusen nur geringfügig reduziert, was auf Beeinträchtigungen der Insulinfunktion des peripheren Glukosestoffwechsels bei Mäusen hindeutet, die mit C-C-L-5 behandelt wurden. Um die Aktivierung des Insulinsignals zu analysieren, wurde das Insulinrezeptor-Substratprotein oder die I-R-S-1-Phosphorylierung im Hypothalamus untersucht.Bei Mäusen, die bei normaler Fütterung mit einem C-C-L-5-Antagonisten behandelt wurden, war die I-R-S-1-Phosphorylierung im Vergleich zur Kontrollgruppe hochreguliert. Um die Aktivierung des Insulinsignals weiter zu analysieren, wurden auch die Spiegel von phosphoryliertem Serin 4-7-3 Akt, dem Insulin-nachgeschalteten Signalmolekül, untersucht. Danach war das A-K-T-Signal der Insulinprovokation bei den mit A-C-S-F behandelten Kontrollmäusen erhöht, jedoch nicht bei Mäusen, die mit C-C-L-5-Antagonisten behandelt wurden.Sobald das Einsetzen der Mikroosmosepumpe gemeistert ist, dauert es nur eine halbe Stunde, wenn es richtig gemacht wird. Bei diesem Verfahren ist darauf zu achten, dass der Mauskopf leicht angehoben ist und die Wirbelsäule gerade auf dem stereotaktischen Gerät liegt. Diese Technik bietet dem Forscher in der Endokrinologie die Möglichkeit, die Wirkung eines Medikaments, eines Chemokins oder einer Proteinfunktion im Gehirn des Nagetiers zu untersuchen.Im Anschluss an dieses Verfahren kann eine zusätzliche Maßnahme wie die Manipulation der Genexpression mit einer intrazerebralen Verabreichung eines Virus oder Crisper 9 durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. wie das C-C-L-5 und der Rezeptor C-C-L-5 an den Schaltkreisen der Nahrungsverdauung und des Stoffwechsels beteiligt sind.

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Forschung

JoVE Journal

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Medizin

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Hippocampus Insulin Mikroinjektion und<em&gt; In vivo</em&gt; Microdialysis Während Spatial Memory Testing

Dieses Video zeigt, wie man einen oralen Glukosetoleranztest an einer Labormaus durchführt.

Oraler Glukosetoleranztest (OGTT): Messung des Glukosestoffwechsels bei Mäusen

In diesem Video demonstrieren wir den Zusammenbau eines mikroosmotischen Pumpen-Gehirninfusionssystems, gefolgt von seiner chirurgischen Implantation in den Schädel der Maus. Dieses System ermöglicht die kontinuierliche Verabreichung potenzieller Medikamente und erleichtert die Untersuchung ihrer Auswirkungen auf das Gehirn und das Hirngewebe.

Kontinuierliches Medikamenteninfusionssystem im Mausmodell: Ein chirurgischer Eingriff zur Implantation eines mikroosmotischen Pumpeninfusionssystems in das Gehirn der Maus für eine kontinuierliche Wirkstoffabgabe

Dieses Video zeigt die Wirkung einer kontinuierlichen Infusion von Medikamenten in das Gehirn von Mäusen auf den Blutzuckerspiegel. Der Glukosestoffwechsel wird beurteilt, indem Blut aus dem Schwanz einer nüchternen Maus entnommen und der Glukosespiegel vor und nach der oralen Glukoseverabreichung gemessen wird. Die Insulintoleranz wird durch Injektion von Insulin in die Maus bewertet, wobei der Glukosespiegel in bestimmten Abständen aufgezeichnet wird.

Bewertung der Wirkung einer kontinuierlichen Infusion von Medikamenten in das Gehirn von Mäusen auf den peripheren Glukosespiegel

Dieses Protokoll beschreibt eine Technik für die Beobachtung von Echtzeit-grüne Fluoreszenz Protein (GFP) Glucose Transporter 4 (GLUT4) Protein Menschenhandel auf Insulin-Stimulation und Charakterisierung der biologischen Rolle der CCR5 in Insulin-GLUT4 markiert Signalweg mit Dekonvolution Mikroskopie.

Live-Bilder von GLUT4 Protein Menschenhandel Maus primäre hypothalamische Neurone mit Dekonvolution Mikroskopie

Der aktuelle Artikel beschreibt die Erzeugung und metabolische Charakterisierung von fettreichen Diät gefütterten Mäusen als Modell für Diät-induzierten Insulinresistenz und Fettleibigkeit. Freuen Sie sich auf weitere detaillierte Protokolle, um die oralen Glukose-Toleranz-Test und die Insulin-Toleranz-Test, Ganzkörper-Veränderungen der Glukose Stoffwechsel in VivoÜberwachung durchführen.

Studie von In Vivo Metabolismus von Glukose in fettreichen Diät gefüttert Mäuse mit oralen Glukosetoleranztest (OGTT) und Insulin-Toleranz-Test (ITT)

Hier beschreiben wir eine einfache Methode, um Mäusen ein kommerzielles kontinuierliches Glukosemessgerät zu implantieren, das für Patienten entwickelt wurde, und stellen die Skripte zur Analyse der Ergebnisse zur Verfügung.

Einfache kontinuierliche Glukosemessung bei frei beweglichen Mäusen

Dieser Artikel beschreibt ein detailliertes Protokoll zur Erhöhung der Glukosekonzentration im Liquor cerebrospinalis (CSF) von Mäusen. Dieser Ansatz kann nützlich sein, um die Auswirkungen einer hohen Liquorglukose auf die Neurodegeneration, die Kognition und den peripheren Glukosestoffwechsel bei Mäusen zu untersuchen.

Osmotische Minipump-Implantation zur Erhöhung der Glukosekonzentration im Liquor der Maus

Eine hyperglykämische Klemme wird zur Messung der Insulinfreisetzung bei anhaltend höherer Blutzuckerkonzentration verwendet. Eine hypoglykämische Klemme dient zur Messung der Glukoseproduktion, die durch gegenregulatorische Reaktionen induziert wird. Beide Methoden verwenden das gleiche chirurgische Verfahren. Hier stellen wir eine Clamp-Technik zur Beurteilung des systemischen Glukosestoffwechsels vor.

Hyperglykämische Klemme und hypoglykämische Klemme bei bewussten Mäusen

Hier geben wir Details zur Durchführung der glukosestimulierten Insulinsekretion (GSIS) durch Perfusion durch das Gefäßsystem von Mäusen mit intakter Bauchspeicheldrüse als zusätzliche Technik zur Beurteilung der endokrinen Pankreasfunktion mit Reduktion möglicher Störfaktoren.

Glukosestimulierte Insulinsekretion über Perfusion durch das Gefäßsystem der Maus mit intakter Bauchspeicheldrüse

Erfahren Sie die Rolle von CCL5 im Hypothalamus bei Insulinsignalwegen und Glukosestoffwechsel anhand von Mikro-Osmotik-Pumpen bei Mäusen. Diese Methode ermöglicht präzise Hirndrug-Delivery für metabolische Forschung.

Studium der Hypothalamus Insulin-Signal an peripheren Glukoseintoleranz mit einem kontinuierlichen Medikament Infusion System in das Gehirn der Maus (Video) | JoVE Journal

Studium der Hypothalamus Insulin-Signal an peripheren Glukoseintoleranz mit einem kontinuierlichen Medikament Infusion System in das Gehirn der Maus

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