Studium der Hypothalamus Insulin-Signal an peripheren Glukoseintoleranz mit einem kontinuierlichen Medikament Infusion System in das Gehirn der Maus

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, die Rolle des hypothalamischen C-C-L-5-Signalwegs für die Insulinfunktion im peripheren System und den Glukosestoffwechsel zu untersuchen, indem der C-C-L-5-Signalweg manipuliert wird, indem der Antagonist Met-C-C-L-5 über ein interzerebrales ventrikuläres Verabreichungssystem, die mikroosmotische Pumpe, verabreicht wird. Dieses Arzneimittel kann helfen, die Schlüsselfragen auf dem Gebiet der biochemischen Physiologie zu beantworten, wie z. B. Chemokin C-C-L-5 bei der Kontrolle des Glukosestoffwechsels des Körpers und der Insulinreaktionsfähigkeit im Gehirn. Der Hauptvorteil dieser Maßnahme besteht darin, dass der Experimentator bestimmte Signale im Gehirn für einen bestimmten Zeitraum leicht manipulieren kann, wie z. B. das C-C-L-5 hier drin, ohne kompensatorische Wirkung oder Entwicklung einer Störung, was normalerweise passiert, wenn wir genetische Manipulationen bei Nagetieren durchführen.

visuelle Demonstration dieses Verfahrens ist wichtig, da das Einsetzen einer mikroosmotischen Pumpe und die genaue Messung des Insulin- und Glukosespiegels im Blut Geschicklichkeit und Präzision erfordern. Bereiten Sie einen Tag vor der Operation mikroosmotische Pumpen des Gehirns vor, indem Sie eine Ein-Milliliter-Spritze und eine stumpfe Kopfnadel verwenden, um die Pumpen mit künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit oder A-C-S-F zu füllen. Tauchen Sie dann die Pumpe in A-C-S-F ein und stellen Sie sie auf einen Shaker, um sie über Nacht sanft zu schütteln.

Nehmen Sie am nächsten Tag das A-C-S-F aus der Pumpe und füllen Sie es vollständig mit zuvor vorbereiteter Arzneimittellösung, verdünnt in A-C-S-F, bis der Überschuss austritt. Schneiden Sie dann mit einer chirurgischen Schere die Katheterschläuche auf die gewünschte Länge ab. Befestigen Sie die Schläuche mit einer stumpfen Hirninfusionsnadel am Gehirninfusionsset.

Füllen Sie dann die Röhrchen im Infusionskit mit der Arzneimittellösung. Nachdem Sie das Kit zusammengebaut haben, befestigen Sie es an der Mikroosmosepumpe. Um ein Austrocknen der Pumpe zu verhindern, tauchen Sie die Einstellung der osmotischen Pumpe für die Gehirninfusion in A-C-S-F in ein sterilisiertes 50-Milliliter-Röhrchen.

Um die Operation zu beginnen, montieren Sie den Kopf einer anästhesierten Maus und befestigen Sie ihn an einem stereotaktischen Gerät. Schneiden Sie mit einer chirurgischen Schere und einer Zange die äußere Haut auf, die den Schädel bedeckt. Verwenden Sie dann Jod, um den peripheren Schädel zu reinigen.

Verwenden Sie anschließend eine Schere mit stumpfem Kopf in der Nähe der Halsregion, um die äußerste Hautschicht von der subkutanen Haut für die Implantation des osmotischen Pumpen-Gehirnfusionssets zu trennen. Verwenden Sie das stereotaktische Gerät, um den Infusionspunkt in Bezug auf die Gehirnkarte zu markieren. Bohren Sie mit einem Nagelbohrer ein Loch um den markierten Bereich auf dem Schädel und achten Sie darauf, dass die Hirnhäute und Blutgefäße der Maus nicht beschädigt werden.

Platzieren Sie dann das mikroosmotische Pumpen-Gehirnfusionsset, das das interessierende Medikament oder A-C-S-F als Kontrolle enthält, unter der Haut hinter der Halsregion. Um das Medikament in das Gehirn zu infundieren, führen Sie die Gehirninfusionsnadel in das Bohrloch ein. Verwenden Sie oberflächendesensibilisierendes Gel, um die Nadel auf dem Schädel zu fixieren, und warten Sie, bis der Kleber getrocknet ist.

Schneide den überstehenden Teil oben auf der Nadel ab. Bevor Sie mit dem Glukosetoleranztest beginnen, bereiten Sie die Glukoselösung vor, indem Sie 3,75 Gramm Glukose und 15 Milliliter destilliertes Wasser auflösen. Erstellen Sie einen Zeitplan mit angemessenen Abständen zwischen den einzelnen Blutuntersuchungen, um die Messwerte während des Experiments aufzuzeichnen.

Wiegen Sie als Nächstes jede Maus nach dem Fasten, um die geeignete Menge an Glukose für die Injektion zu berechnen. Bereiten Sie dann an der Werkbank einen Timer, einen Glukosechip, ein Blutzuckermessgerät, eine Insulinspritze und Rasierklingen vor. Um den Blutzuckerspiegel zu messen, setzen Sie zunächst einen neuen Glukosechip in das Blutzuckermessgerät ein und drücken Sie die Starttaste, um den Nullpunkt zu stellen.

Nehmen Sie dann die Maus im Nacken und streichen Sie über ihren Schwanz, um eine ausreichende Durchblutung zu gewährleisten. Schneide mit einer neuen Rasierklinge ein kleines Stück des Schwanzes ab und drücke dann einen Tropfen Blut in den Glukosechip. Füttern Sie die Maus mit Hilfe der intragastrischen Spültechnik mit Glukose und starten Sie sofort den Timer.

Messen Sie die Glukose zu verschiedenen Zeitpunkten. Um den Insulintoleranztest zu starten, bereiten Sie 0,25 Einheiten Humaninsulinlösung vor. Wiegen Sie dann jede Maus nach dem Fasten, um die geeignete Insulinmenge für die Injektion zu berechnen.

Richten Sie als Nächstes einen Zeitplan ein, um die Messwerte während des Experiments aufzuzeichnen. Messen Sie abschließend nach der Insulininjektion den Blutzuckerspiegel wie zuvor. Der Glukosestoffwechsel wurde durch den oralen Glukosetoleranztest nach der Operation nach der oralen Verabreichung von Glukose bei Mäusen gemessen.

Die Veränderungen des Blutzuckerspiegels bei Mäusen, die mit A-C-S-F oder mit dem C-C-L-5-Antagonisten infundiert wurden, werden hier aufgezeichnet und gezeigt. Der Insulinsensitivitätstest wurde ebenfalls durchgeführt und der Blutzuckerspiegel bei Mäusen, die mit einem C-C-L-5-Antagonisten infundiert waren, war im Vergleich zu Kontrollmäusen nur geringfügig reduziert, was auf Beeinträchtigungen der Insulinfunktion des peripheren Glukosestoffwechsels bei Mäusen hindeutet, die mit C-C-L-5 behandelt wurden. Um die Aktivierung des Insulinsignals zu analysieren, wurde das Insulinrezeptor-Substratprotein oder die I-R-S-1-Phosphorylierung im Hypothalamus untersucht.

Bei Mäusen, die bei normaler Fütterung mit einem C-C-L-5-Antagonisten behandelt wurden, war die I-R-S-1-Phosphorylierung im Vergleich zur Kontrollgruppe hochreguliert. Um die Aktivierung des Insulinsignals weiter zu analysieren, wurden auch die Spiegel von phosphoryliertem Serin 4-7-3 Akt, dem Insulin-nachgeschalteten Signalmolekül, untersucht. Danach war das A-K-T-Signal der Insulinprovokation bei den mit A-C-S-F behandelten Kontrollmäusen erhöht, jedoch nicht bei Mäusen, die mit C-C-L-5-Antagonisten behandelt wurden.

Sobald das Einsetzen der Mikroosmosepumpe gemeistert ist, dauert es nur eine halbe Stunde, wenn es richtig gemacht wird. Bei diesem Verfahren ist darauf zu achten, dass der Mauskopf leicht angehoben ist und die Wirbelsäule gerade auf dem stereotaktischen Gerät liegt. Diese Technik bietet dem Forscher in der Endokrinologie die Möglichkeit, die Wirkung eines Medikaments, eines Chemokins oder einer Proteinfunktion im Gehirn des Nagetiers zu untersuchen.

Im Anschluss an dieses Verfahren kann eine zusätzliche Maßnahme wie die Manipulation der Genexpression mit einer intrazerebralen Verabreichung eines Virus oder Crisper 9 durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. wie das C-C-L-5 und der Rezeptor C-C-L-5 an den Schaltkreisen der Nahrungsverdauung und des Stoffwechsels beteiligt sind.