Name: Bewertung von Dictyostelium Discoideum Reaktion auf akute mechanische Stimulation (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: Erfahren Sie die Bewertung zellulärer Reaktionen auf akute mechanische Stimulation bei Dictyostelium discoideum. Diese Methode untersucht Biosensor-Lokalisierung und Proteinaktivierung durch Scherströmung.

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<ol><li>Swaney, K. F., Huang, C. H., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+chemotaxis%3A+a+network+of+signaling+pathways+controls+motility%2C+directional+sensing%2C+and+polarity%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic chemotaxis: a network of signaling pathways controls motility, directional sensing, and polarity.</a> Annu Rev Biophys. 39, 265-289 (2010).</li>
<li>Sasaki, A. T., Chun, C., Takeda, K., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+Ras+signaling+at+the+leading+edge+regulates+PI3K%2C+cell+polarity%2C+and+directional+cell+movement%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Localized Ras signaling at the leading edge regulates PI3K, cell polarity, and directional cell movement.</a> J Cell Biol. 167 (3), 505-518 (2004).</li>
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<li>Parent, C. A., Blacklock, B. J., Froehlich, W. M., Murphy, D. B., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G+Protein+Signaling+Events+Are+Activated+at+the+Leading+Edge+of+Chemotactic+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">G Protein Signaling Events Are Activated at the Leading Edge of Chemotactic Cells.</a> Cell. 95 (1), 81-91 (1998).</li>
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<li>Lim, C. J., Spiegelman, G. B., Weeks, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RasC+is+required+for+optimal+activation+of+adenylyl+cyclase+and+Akt%2FPKB+during+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">RasC is required for optimal activation of adenylyl cyclase and Akt/PKB during aggregation.</a> EMBO J. 20 (16), 4490-4499 (2001).</li>
<li>Kamimura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PIP3-Independent+Activation+of+TorC2+and+PKB+at+the+Cell%27s+Leading+Edge+Mediates+Chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">PIP3-Independent Activation of TorC2 and PKB at the Cell's Leading Edge Mediates Chemotaxis.</a> Curr Biol. 18 (14), 1034-1043 (2008).</li>
<li>Kortholt, A., King, J. S., Keizer-Gunnink, I., Harwood, A. J., Van Haastert, P. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipase+C+Regulation+of+Phosphatidylinositol+3%2C4%2C5-trisphosphate-mediated+Chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Phospholipase C Regulation of Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate-mediated Chemotaxis.</a> Molecular Biology of the Cell. 18 (12), 4772-4779 (2007).</li>
<li>Huang, C. H., Tang, M., Shi, C., Iglesias, P. A., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+excitable+signal+integrator+couples+to+an+idling+cytoskeletal+oscillator+to+drive+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">An excitable signal integrator couples to an idling cytoskeletal oscillator to drive cell migration.</a> Nat Cell Biol. 15 (11), 1307-1316 (2013).</li>
<li>Nishikawa, M., Hörning, M., Ueda, M., Shibata, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitable+Signal+Transduction+Induces+Both+Spontaneous+and+Directional+Cell+Asymmetries+in+the+Phosphatidylinositol+Lipid+Signaling+System+for+Eukaryotic+Chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Excitable Signal Transduction Induces Both Spontaneous and Directional Cell Asymmetries in the Phosphatidylinositol Lipid Signaling System for Eukaryotic Chemotaxis.</a> Biophys J. 106 (3), 723-734 (2014).</li>
<li>Gerisch, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mobile+Actin+Clusters+and+Traveling+Waves+in+Cells+Recovering+from+Actin+Depolymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Mobile Actin Clusters and Traveling Waves in Cells Recovering from Actin Depolymerization.</a> Biophys J. 87 (5), 3493-3503 (2004).</li>
<li>Gerisch, G., Ecke, M., Wischnewski, D., Schroth-Diez, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+modes+of+state+transitions+determine+pattern+in+the+Phosphatidylinositide-Actin+system%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Different modes of state transitions determine pattern in the Phosphatidylinositide-Actin system.</a> BMC Cell Biol. 12 (1), 42(2011).</li>
<li>Bretschneider, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Three-Dimensional+Dynamics+of+Actin+Waves%2C+a+Model+of+Cytoskeletal+Self-Organization%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">The Three-Dimensional Dynamics of Actin Waves, a Model of Cytoskeletal Self-Organization.</a> Biophys J. 96 (7), 2888-2900 (2009).</li>
<li>Weiner, O. D., Marganski, W. A., Wu, L. F., Altschuler, S. J., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Actin-Based+Wave+Generator+Organizes+Cell+Motility%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Biol%22%5BJournal%5D)">An Actin-Based Wave Generator Organizes Cell Motility.</a> PLOS Biol. 5 (9), e221(2007).</li>
<li>Devreotes, P., Horwitz, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+Networks+that+Regulate+Cell+Migration%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Signaling Networks that Regulate Cell Migration.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (8), (2015).</li>
<li>Artemenko, Y., Lampert, T. J., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moving+towards+a+paradigm%3A+common+mechanisms+of+chemotactic+signaling+in+Dictyostelium+and+mammalian+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Moving towards a paradigm: common mechanisms of chemotactic signaling in Dictyostelium and mammalian leukocytes.</a> Cell Mol Life Sci. 71 (19), 3711-3747 (2014).</li>
<li>Dalous, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+cell+polarity+and+actin-myosin+cytoskeleton+reorganization+under+mechanical+and+chemical+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Reversal of cell polarity and actin-myosin cytoskeleton reorganization under mechanical and chemical stimulation.</a> Biophys J. 94 (3), 1063-1074 (2008).</li>
<li>Sato, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Switching+direction+in+electric-signal-induced+cell+migration+by+cyclic+guanosine+monophosphate+and+phosphatidylinositol+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Switching direction in electric-signal-induced cell migration by cyclic guanosine monophosphate and phosphatidylinositol signaling.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (16), 6667-6672 (2009).</li>
<li>Zhao, M., Pu, J., Forrester, J. V., McCaig, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+lipids%2C+EGF+receptors%2C+and+intracellular+signals+colocalize+and+are+polarized+in+epithelial+cells+moving+directionally+in+a+physiological+electric+field%5BTitle%5D)+AND+%22Faseb+j%22%5BJournal%5D)">Membrane lipids, EGF receptors, and intracellular signals colocalize and are polarized in epithelial cells moving directionally in a physiological electric field.</a> Faseb j. 16 (8), 857-859 (2002).</li>
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<li>Gaudet, P., Pilcher, K. E., Fey, P., Chisholm, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+Dictyostelium+discoideum+with+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Transformation of Dictyostelium discoideum with plasmid DNA.</a> Nat. Protocols. 2 (6), 1317-1324 (2007).</li>
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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Die hier beschriebenen Methoden bieten eine bequeme Möglichkeit, Bevölkerung und einzelne Zelle Verhalten um Strömung Scheren zu beurteilen. Wichtig ist, während frühere Studien Lokalisierung von leading und lagging Rand Markierungen während der Migration analysiert, ermöglicht das derzeitige Konzept Untersuchung der unmittelbaren Auswirkungen durch die Anwendung der Schubfluss akut. Mit dieser Methode haben wir gezeigt, dass in der Tat, die erste Reaktion der Zellen fließen Scherung Zellwanderung nicht erforderlich ist....

Migration von eukaryotischen Zellen ist durch unterschiedliche chemische und physikalische Hinweise in der Umgebung, einschließlich Steigungen von löslichen oder Substrat gebunden Chemoattractants, variabler Steifigkeit der Substrate, elektrische Felder oder Schubfluss vorgespannt. Zwar gab es viele Fortschritte in unserem Verständnis der molekularen Mechanismen fahren Chemotaxis, weniger ist bekannt über andere Arten von gerichtete Migration und wie diese vielfältigen Signale auf zellulärer Ebene zu einer einheitlichen produzieren integriert sind wandernde Antwort.
Migration in Richtung einer zunehmenden Konzentration von einem Lockstoffgradient umfasst drei Verhaltens Komponenten gerichtet: Motilität, direktionale sensing und Polarität1. Motilität bezieht sich auf zufällige Bewegung der Zellen durch Pseudopod Vorsprung erreicht. Gerichtete Sensorik ist die Fähigkeit einer Zelle, die Ursache für eine Lockstoffgradient zu ermitteln, die auftreten können, auch in Zellen immobilisiert. Polarität bezieht sich auf die stabiler asymmetrische Verteilung der intrazellulären Komponenten zwischen den führenden und rückständigen Rand einer Zelle, führt zu erhöhten Persistenz in Bewegung.
Zelluläre Reaktion auf eine Lockstoffgradient hängt von der Aktivität von vier konzeptionell definierte Regulationsnetzwerke: Rezeptor / G Protein, Signaltransduktion, Aktin-Zytoskelett und Polarität1. Lockstoffgradient Bindung an den G-Protein-gekoppelten Rezeptor überträgt das Signal über Heterotrimeric G Proteine α und βγ auf die nachgeschalteten Signaltransduktion Netzwerk, das die Richtungs-Signal verstärkt. Mehrere Wege innerhalb des Netzwerks Signal Transduction parallel agieren und fließen in das Aktin Zytoskelett Netzwerk Bias Aktin-Polymerisation und konsequente Pseudopod Vorsprung, in die Richtung des Farbverlaufs. Unter wichtige Regulatoren der Chemotaxis sind Ras GTPase, TorC2, Phosphoinositide 3-Kinase (PI3K), Phosphatase und tensin Homolog (PTEN) und Guanylyl Cyclase. Feedback-Mechanismen innerhalb des Signal-Transduktion-Netzwerks und zwischen der Signaltransduktion und Aktin-Zytoskelett-Netzwerke weiter verstärken die Reaktion. Schließlich, das schlecht definierte Polarität Netzwerk erhält Eingaben aus dem Aktin-Zytoskelett und weitere Vorurteile Signal Transduction Netzwerk zur Förderung der anhaltenden Migration in die Richtung des Farbverlaufs.
Ein Großteil unserer mechanistisches Verständnis der Chemotaxis wurde aufgrund der Entwicklung von Eindringmittel getaggt Biosensoren für verschiedene Komponenten des regulatorischen Netzwerken ermöglicht. Viele Chemotaxis Regulatoren haben eine asymmetrische Verteilung der regulatorischen Molekül selbst oder seine Tätigkeit. Z. B. Biosensoren, die erkennen aktiviert Versionen von kleinen GTPases Ras und Rap1-Ras-bindende Domänen von Raf1 (bezeichnet als RBD hier) und RalGDS, bzw. – zu lokalisieren, an der Vorderkante der Chemotaxing Zelle2,3. In ähnlicher Weise PI3K und seine Produkt Phosphatidylinositol (3,4,5)-Trisphosphate (PIP3), anerkannt durch eine Pleckstrin Homologie (PH) Domäne zeigen auch Lokalisierung an der Vorderseite der Zelle4,5. Im Gegensatz dazu eine 3-Phosphatase PTEN, wandelt die PIP3 zurück zu Phosphatidylinositol (4,5)-Bisphosphate, lokalisiert an den rückständigen Rand der Zelle6. Wichtig ist, ändern Sie diese Biosensoren ihrer Lokalisation in Reaktion auf die globale Stimulation mit einem Lockstoffgradient. Vorderkante Marker, die cytosolische oder relocalize an den Spitzen der Vorsprünge in eine ruhende Zelle zum Kortex, während Rand Marker, hinkt die kortikalen Lokalisierung und Fehlen von den Spitzen der Vorsprünge in eine ruhende Zellen werden nach der cytosolischen die Stimulation. Analyse der Biosensor Verteilung in Reaktion auf die globale Stimulation mit einem Lockstoffgradient minimiert den Beitrag der Motilität und Polarität, die oft die Beobachtungen zu verwirren. Global oder gleichmäßige Stimulation eine Zellsuspension mit einem Lockstoffgradient ist auch als Werkzeug zur bevölkerungsweite Veränderungen in Protein-Aktivierung, oft röntgenologisch Protein Phosphorylierung7,8,9 . Diese biochemischen Assay dient vor allem zeitliche Informationen zu während Mikroskopie verwendet wird, um zeitliche und räumliche Informationen über das Verhalten der verschiedenen Komponenten des regulatorischen Netzwerken zu sammeln.
Das Signal Transduction Netzwerk enthält Merkmale eines erregbar System10,11. Reaktionen auf supra-Schwelle chemotaktische Reize sind "verdeutlichen" und feuerfeste Perioden anzeigen. Antworten sind auch stochastisch ausgelöst und oszillierenden Verhalten zeigen können. Signal-Transduktion Ereignisse sind in Regionen des Cortex lokalisiert, die wie Wellen12,13,14,15zu propagieren. Vorne, zurück, Marker zu rekrutieren oder distanziert, die aktiven Zonen der propagierende Wellen. Aufgrund der feuerfesten Region hinter der aktiven Zone vernichten die entgegengesetzt gerichteten Wellen treffen. Die verbreitende Signal Transduction Wellen unterliegen die zelluläre Vorsprünge, die Zelle Migration10vermitteln.
Viele der genannten Informationen über Chemotaxis kam aus den Studien auf die soziale Amöbe Dictyostelium Discoideum, obwohl ähnliche Regulationsmechanismen auch auf Neutrophilen und andere Säugetier-Zelle Arten16 anwendbar sind . Dictyostelium ist ein gut etabliertes Modellorganismus, der hat eine robuste chemotaktische Reaktion während der Hungersnot, wenn Tausende von einzelnen Zellen in einer Aggregation Mitte, schließlich bildet eine vielzellige Fruchtkörper mit Sporen migrieren. Chemotaxis ist auch während der einzelligen Wachstumsphase dieses Organismus zur Ortung von bakteriellen Nahrungsmittelquellen wichtig. Wichtig ist, ist die Migration von Einzelzellen Dictyostelium bemerkenswert ähnlich wie die Migration von Säugetieren Neutrophile oder metastatischen Krebszellen, die sehr schnelle amöboiden Typ Migration zu unterziehen. In der Tat sind sowohl die allgemeine Topologie der regulatorischen Netzwerke, sowie viele der einzelnen Transduktion Signalwege beteiligt Chemotaxis zwischen Dictyostelium und Säugetieren Leukozyten17konserviert. Darüber hinaus nutzen andere Zellen, wie Fibroblasten, Rezeptor-Tyrosin-Kinasen (RTK) anstelle von GPCRs; jedoch kann RTKs in ähnliche Netze einspeisen.
Im Gegensatz zur Chemotaxis fehlt gründliches Verständnis der Signalisierung Mechanismen, die verschiedenen Verkehrsträger gerichtete Migration zu fahren. In ähnlicher Weise auf Zellen in einem Lockstoffgradient Verlauf migrieren mehrere Studien haben berichtet Aktivierung und/oder Lokalisierung von typischen Vorderkante Markierungen, einschließlich Aktin-Polymerisation, PIP3 und/oder extrazelluläre Signal-regulierte Kinase (ERK) 1/2, bei der Vorderseite der Zellen gerichtet Migration als Reaktion auf Flow oder Änderungen in elektrischen Feldern18,19,20,21zu scheren. Führte jedoch in diesen Studien Dauerbelastung auf den Stimulus auch Zellwanderung, lassen offen die Frage, ob beispielsweise die Vorderkante Marker speziell in Reaktion auf einen Reiz zu lokalisieren, oder wenn sie einfach an der Vorderkante zu lokalisieren aufgrund erhöhten Anzahl von Scheinfüßchen an der Vorderseite des eine wandernde Zelle.
Wir entwickelten Assays, die uns erlauben, die Reaktion der Zellen auf akute mechanische Störung geliefert als Schubfluss sowohl auf Bevölkerungsebene sowie Einzelzellen22zu beobachten. Ähnlich wie bei globalen Stimulation mit einem Lockstoffgradient, akute stimulaTion mit Schubfluss ermöglicht die Studie eine zelluläre Reaktion auf einen mechanischen Reiz ohne verwirrende Beitrag von Motilität oder Polarität. Kombinieren diese mikroskopische und biochemische Tests mit genetischen oder pharmakologische Störungen ermöglicht es uns, erfahren über wie mechanische Reize wahrgenommen werden und übermittelt werden. Darüber hinaus bietet dieser Ansatz auch eine neuartige Methode zur Erschließung des Systems unterhalb des Lockstoffgradient-Rezeptors in Ermangelung eines Lockstoffgradient, damit das Signal Transduktion und Aktin Zytoskelett Netzwerke aus dem Rezeptor/G zu isolieren Protein-Netzwerk.
Mit den Techniken, die wir kürzlich beschriebenen demonstrierte, dass akute Scherbeanspruchung führt zu Aktivierung mehrerer Komponenten der chemotaktische Signal Transduction und Aktin Zytoskelett Netzwerke22. Durch die Anwendung des akute mechanischen Reizes in unterschiedlichen Abständen, haben wir bewiesen, dass in ähnlicher Weise zu Chemoattractants, Reaktion auf mechanische Reize auch bietet eine erregbare Systems, einschließlich das verdeutlichen Verhalten die Reaktion unter Ausstellungen Bedingungen und das Vorhandensein von einer Refraktärzeit zu sättigen. Durch die Kombination von mechanischen und chemischen Stimulation haben wir schließlich gezeigt, dass die beiden Reize teilen Signal Transduction und Aktin Zytoskelett Netzwerke, die wahrscheinlich für die Integration von mehreren reizen, Bias Zellwanderung ermöglichen.

<table><tbody><tr><td>Reagenzien</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Fisher</td><td>D16-1</td><td>Zur Herstellung von HL-5-Medien und SM-Platten (Schritte 1.1, 1.2)</td></tr><tr><td>Proteose-Pepton</td><td>Fisher</td><td>DF0120-17-6</td><td>Zur Herstellung von HL-5-Medien (Schritt 1.1)</td></tr><tr><td>Hefeextrakt</td><td>Fisher</td><td>50-550-445</td><td>Zur Herstellung von HL-5-Medien und SM-Platten (Schritte 1.1, 1.2)</td></tr><tr><td>Na2HPO4&middot; 7H2O</td><td>Fisher</td><td>S373-500</td><td>Zur Vorbereitung von HL-5-Medien und 10X Phosphatpuffer (Schritte 1.1, 1.3)</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fisher</td><td>P386-500</td><td>Zur Vorbereitung von HL-5-Medien, SM-Platten und 10X Phosphatpuffer (Schritte 1.1-1.3)</td></tr><tr><td>Streptomycin (Dihydrostreptomycinsulfat)</td><td>Fisher</td><td>ICN10040525</td><td>Zur Herstellung von HL-5-Medien (Schritt 1.1)</td></tr><tr><td>Peptone (Bacto)</td><td>Fisher</td><td>DF0118-17-0</td><td>Zur Vorbereitung von SM-Platten (Schritt 1.2)</td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Fisher</td><td>P288-100</td><td>Zur Vorbereitung von SM-Platten (Schritt 1.2)</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher</td><td>BP1423-500</td><td>Zur Vorbereitung von SM-Platten (Schritt 1.2)</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Fisher</td><td>M65-500</td><td>Zur Vorbereitung von DB Buffer (Schritt 1.4)</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher</td><td>C79-500</td><td>Zur Herstellung von DB-Puffer (Schritt 1.4)</td></tr><tr><td>Koffein</td><td>Fisher</td><td>O1728-500</td><td>Zur Zubereitung von Koffein (Schritt 1.5)</td></tr><tr><td>cAMP (EMD Millipore Calbiochem Adenosin 3 ft.,5 ft.-cyclisches Monophosphat, Natriumsalz)</td><td>Fisher</td><td>11-680-1100MG</td><td>Zur Herstellung von cAMP (Schritt 1.6)</td></tr><tr><td>Folsäure</td><td>Sigma</td><td>F7876</td><td>Zur Herstellung von Folsäure Saure (Schritt 1.7)</td></tr><tr><td>Trisbase</td><td>Fisher</td><td>BP152-500</td><td>Zur Herstellung von 3X Probenpuffer (Schritt 1.8)</td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfat (SDS)</td><td>Fisher</td><td>BP166-500</td><td>Zur Herstellung von 3X Probenpuffer (Schritt 1.8)</td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Fisher</td><td>G33-500</td><td>Zur Herstellung von 3X Probenpuffer (Schritt 1.8)</td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Bio-Rad</td><td>1610610</td><td>Zur Herstellung von 3X Probenpuffer (Schritt 1.8)</td></tr><tr><td>Bromphenolblau</td><td>Bio-Rad</td><td>1610404</td><td>Zur Herstellung von 3X Probenpuffer (Schritt 1.8)</td></tr><tr><td>NaF</td><td>Fisher</td><td>S299-100</td><td>Zur Herstellung von Probenpuffer mit Protease- und Phosphatase-Inhibitoren (Schritt 1.8)</td></tr><tr><td>Na3VO4</td><td>Fisher</td><td>50-994-911</td><td>Zur Herstellung von Probenpuffer mit Protease- und Phosphatase-Inhibitoren (Schritt 1.8)</td></tr><tr><td>Natriumpyrophosphat-Decahydrat</td><td>Fisher</td><td>S390-500</td><td>Zur Herstellung von Probenpuffer mit Protease- und Phosphatase-Inhibitoren (Schritt 1.8)</td></tr><tr><td>Vollständiger EDTA-freier Protease-Inhibitor-Cocktail (Roche)</td><td>Sigma</td><td>11873580001</td><td>Zur Herstellung von Probenpuffer mit Protease- und Phosphatase-Inhibitoren (Schritt 1.8)</td></tr><tr><td>Latrunculin A</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>BML-T119-0100</td><td>Zur Herstellung von Latrunculin A (Schritt 1.9)</td></tr><tr><td>4-15 % Tris-HCl Polyacrylamid-Gel</td><td>Bio-Rad</td><td>3450029</td><td>Zur Verwendung beim Immunblotting (Schritt 3.3)</td></tr><tr><td>Polyvinylidenfluorid-Membran</td><td>Bio-Rad</td><td>1620177</td><td>Zur Verwendung beim Immunblotting (Schritt 3.3)</td></tr><tr><td>Phospho-PKC (pan) (zeta Thr410) (190D10) Kaninchen-Antikörper</td><td>Cell Signaling</td><td>2060</td><td>Primärer Antikörper zur Verwendung beim Immunblotting (Schritt 3.3)</td></tr><tr><td>Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) ( D13.14.4E) XP-Antikörper</td><td>Cell Signaling</td><td>4370</td><td>Primärer Antikörper zur Verwendung beim Immunblotting (Schritt 3.3)</td></tr><tr><td>Kaninchen-IgG HRP Linked Whole Ab (von Esel)</td><td>GE Healthcare</td><td>NA934-100UL</td><td>Sekundärer Antikörper zur Verwendung beim Immunblotting (Schritt 3.3)</td></tr><tr><td>Verstärktes Chemilumineszenzsubstrat (Clarity Western ECL-Substrat)</td><td>Bio-Rad</td><td>1705060</td><td>Verwendung beim Immunblotting (Schritt 3.3)</td></tr><tr><td>Stripping-Puffer (Restore Plus Western-Blot-Stripping-Puffer)</td><td>Pierce</td><td>PI46430</td><td>Verwendung für Immunblotting (Schritt 3.3)</td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue</td><td>Fisher</td><td>PI20278</td><td>Verwendung für Immunblotting (Schritt 3.3)</td></tr><tr><td>K. aerogenes Stamm (nicht pathogen)</td><td>Dicty Stock Center (dictybase.org)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</strong<></td><td>strong>Company</td><td>Katalognummer</td><td>Kommentare</td></tr><tr><td>Materialien und Ausrüstung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Orbitalschüttler (Modell G-33 oder eine vergleichbare Alternative)</td><td>New Brunswick Scientific</td><td></td><td>Zur Züchtung von K. aerogenes (Schritt 2.1.1) und zur Stimulation von D. discoideum-Zellen (Schritt 3). Der Drehradius für diesen Shaker beträgt 9,5 mm.</td></tr><tr><td>10 cm Petrischale</td><td>Fisher</td><td>FB0875712</td><td>Zur Vorbereitung von SM-Platten (Schritt 1.2)</td></tr><tr><td>Hämozytometer</td><td>Fisher</td><td>02-671-51B</td><td>Zur Zählung von D. discoideum Zellen (Schritt 2.1.2)</td></tr><tr><td>35-mm-Schale (Corning Falcon Easy-Grip Gewebekulturschale)</td><td>Fisher</td><td>08-772A</td><td>Zur Platte von D. discoideumZellen für die mechanische Stimulation und anschließende Zelllyse (Schritt 3.1.1)</td></tr><tr><td>Becher aus Polystyrol (5 mL)</td><td>VWR</td><td>13915-985</td><td>Zur Stimulation von D. discoideum Zellsuspension mit einem Chemoattraktivstoff (Schritt 3.2.2)</td></tr><tr><td>Fluidische Einheit mit Pumpe (ibidi Pump System)</td><td>Ibidi</td><td>10902</td><td>Zur mechanischen Stimulation von d. discoideum Zellen in einem Kanal (Schritte 4.1, 4.2 und 5)</td></tr><tr><td>Objektträger mit Kanal (&mu;-Objektträger III 3in1 ibiTreat: #1.5 Polymer-Deckglas, Gewebekultur behandelt, sterilisiert)</td><td>Ibidi</td><td>80316</td><td>Zur Platte von D. discoideum-Zellen für die mechanische Stimulation, die von einem fluidischen Gerät abgegeben wird (Schritte 4.1, 4.2 und 5)</td></tr><tr><td>50-ml-Reservoire (Ibidi Reservoirhalter für Fluidik-Einheit)</td><td>Ibidi</td><td>10978</td><td>Verwenden Sie diese Option, um die fluidische Vorrichtung für die Verabreichung mechanischer Stimulation an d. discoideum Zellen in einem Kanal einzurichten (Schritte 4.1, 4.2 und 5)</td></tr><tr><td>Leitungen für die fluidische Einheit (Perfusionsset GELB-und-GRÜN)</td><td>Ibidi</td><td>10964</td><td>Verwenden Sie diese Option, um die fluidische Vorrichtung für die Verabreichung mechanischer Stimulation an D. discoideum Zellen in einem Kanal einzurichten (Schritte 4.1, 4.2 und 5). Hinweis: Die beiden Leitungen können auch aus dem 1,6 mm Schlauch (Katalognummer 10842) geschnitten werden.</td></tr><tr><td>Leitung für den Abfluss (Schlauch mit einem Innendurchmesser von 1,6 mm)</td><td>Ibidi</td><td>10842</td><td>Zum Einrichten des fluidischen Geräts zur Verabreichung mechanischer Stimulation von d. discoideum Zellen in einem Kanal (Schritte 4.1, 4.2 und 5).</td></tr><tr><td>Zeiss Observer.Z1 inverses Mikroskop mit einem 40X/1,3 Ölobjektiv und einem 20X/0,3 Luftobjektiv (oder einer vergleichbaren Alternative)</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Zur Abbildung von D. discoideum Küvetten mit Phasenkontrast- oder Fluoreszenzbeleuchtung (Schritte 4 und 5)</td></tr><tr><td>UltraView Konfokalmikroskop mit Spinning-Disk, ausgestattet mit einem 40-fachen;/1,25&ndash; 0,75 Ölobjektiv (oder eine vergleichbare Alternative)</td><td>Perkin-Elmer</td><td>DM 16000</td><td>Alternative zur Abbildung von D. discoideum Zellen (Schritt 4.1.4)</td></tr><tr><td>FemtoJet Microinjector (Eppendorf; Modell 5247 oder eine vergleichbare Alternative) mit Eppendorf InjectMan</td><td>Eppendorf</td><td>5252000021D und 5192000027</td><td>Zur mechanischen Stimulation von D. discoideumZellen durch eine Mikropipette (Schritt 4.3). Hinweis: Die Katalognummern beziehen sich auf die neueste Version des Gerätes (4i).</td></tr><tr><td>Mikropipette (Femtotip; 1 &mu; m Außendurchmesser, 0,5 &mu; m Innendurchmesser )</td><td>Eppendorf</td><td>930000035</td><td>Zur mechanischen Stimulation von D. discoideum Zellen mit einer Mikropipette (Schritt 4.3)</td></tr><tr><td>Microloader-Spitzen (Eppendorf Femtotips Microloader-Spitzen für Femtojet Microinjector)</td><td>Eppendorf</td><td>5242956.003</td><td>Zum Befüllen der Mikropipette (Femtospitze) mit Puffer (Schritt 4.3.1)</td></tr><tr><td>1-Well-Kammer (Thermo Scientific Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass)</td><td>Fisher</td><td>12-565-472</td><td>Zur Platte von D. discoideum Zellen für die mechanische Stimulation durch eine Mikropipette (Schritt 4.3.2)</td></tr><tr><td>8-Well-Kammer (Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II Kammer-Deckglas)</td><td>Fisher</td><td>12-565-338</td><td>Zur Platte von D. discoideum Zellen für die mechanische Stimulation durch Bulk-Pufferzugabe (Schritt 4.4.1)</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalognummer</td><td>Comments<</td></tr><tr><td>strong>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image Analysis Software (Fiji)</td><td>NIH</td><td>https://fiji.sc/</td> <td>Zur Quantifizierung der Reaktion auf mechanische Stimulation (Schritt 4.5)</td></tr><tr><td>Migrationsanalysesoftware (Tracking Tool PRO)</td><td>Gradientech</td><td>http://gradientech.se/tracking-tool-pro/</td> <td>Zur Quantifizierung der Zellgeschwindigkeit und -persistenz (Schritt 5.4)</td></tr></tbody></table>

bewertung von dictyostelium discoideum reaktion auf akute mechanische stimulation

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Chemotaxis oder Migration eine Steigung von einem Lockstoffgradient ist die am besten verstanden gerichtete Migration. Studien über soziale Amöbe Dictyostelium Discoideum ergab, dass ein komplexes Signal Transduction Netzwerk von parallelen Bahnen die Reaktion auf Chemoattractants verstärkt und zu voreingenommen Aktin-Polymerisation und Vorwölbung des Pseudopod in führt der Richtung eines Verlaufs. Im Gegensatz dazu sind die molekulare Mechanismen fahren andere Arten von gerichtete Migration, z. B. durch Einwirkung von Strom oder elektrische Felder, Scheren nicht bekannt. Viele Regulatoren der Chemotaxis Lokalisierung am führenden oder rückständigen Rand einer wandernden Zelle aufweisen, sowie vorübergehende Änderungen in Lokalisierung oder Aktivierung nach globalen Stimulation mit einer Lockstoffgradient zu zeigen. Um zu verstehen, die molekularen Mechanismen der anderen Arten von gerichtete Migration entwickelten wir eine Methode, die Untersuchung der zellulären Reaktion auf akute mechanische Stimulation basierend auf kurze (2 bis 5 s) Exposition, Flow zu scheren ermöglichen. Diese Stimulation kann in einem Kanal geliefert werden, während der Bildgebung Zellen Eindringmittel beschriftet Biosensoren untersuchen einzelne Zelle Verhalten zum Ausdruck zu bringen. Darüber hinaus kann Zellpopulation angeregt werden, in einen Teller, lysiert, und Immunoblotted mit Antikörpern, die aktive Versionen der interessierenden Proteine erkennen. Durch die Kombination beider Assays, kann man eine Vielzahl von Molekülen, die durch Veränderungen der subzellulären Lokalisierung und/oder Phosphorylierung aktiviert untersuchen. Mit dieser Methode haben wir festgestellt, dass akute mechanische Stimulation Aktivierung der chemotaktische Signal Transduction und Aktin Zytoskelett Netze auslöst. Die Möglichkeit zu prüfen, zelluläre Reaktionen auf akute mechanische Stimulation ist wichtig für das Verständnis der auslösenden Ereignisse notwendig für Scherung strömungsinduzierte Motilität. Dieser Ansatz bietet auch eine Tool für das Studium der chemotaktische Signal Transduction Netzwerk ohne verwirrende Einfluss des Lockstoffgradient-Rezeptors.

Zeitliche Reaktion der Chemotaxis Regulierungsbehörden auf akute mechanische stimulation
Um die Reaktion von D. Discoideum Zellen auf mechanische Stimulation zu beurteilen, wurden anhaftende Aggregation-kompetente Zellen einen kurzen Impuls von Schubfluss ausgesetzt. Zusammenfassung-kompetente D. Discoideum Zellen absondern, Lager, das von benachbarten Zellen zu spüren. Um den Beitrag der Zell-Zell-Signalisierung ...

Hier beschreiben wir Methoden zur Bewertung der zelluläre Reaktion auf akute mechanische Stimulation. In der Mikroskopie-basierten Test untersuchen wir Lokalisierung von Eindringmittel beschriftet Biosensoren nach kurzer Stimulation mit Schubfluss. Wir testen auch biochemisch Aktivierung verschiedener Proteine des Interesses in Reaktion auf akute mechanische Stimulation.

Bewertung von Dictyostelium Discoideum Reaktion auf akute mechanische Stimulation

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Aktivität verschiedener Komponenten des intrazellulären Signaltransduktionsnetzwerks nach kurzer mechanischer Störung zu untersuchen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Zellmigration zu beantworten, z. B. wie Zellen verschiedene Umweltreize, einschließlich mechanischer Reize, wahrnehmen und in diese Richtung wandern. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Untersuchung der anfänglichen Reaktion auf mechanische Reize ermöglicht, ohne den verwirrenden Beitrag von Motilität oder Polarität zur Reaktion.Wir hatten die Idee zu dieser Methode, als wir die Reaktion der adhärenten Zellen auf das Chemolockstoff testeten, das mit einer leichten Bewegung verabreicht wurde, und wir eine robuste Reaktion der Zellen bemerkten, die mit Vehikelkontrolle stimuliert wurden. Bereiten Sie zunächst Klebsiella aerogenes vor, indem Sie eine kleine Anzahl von Zellen aus gefrorenem Stamm ohne Antibiotika in HL5-Medium inokulieren und die Kultur über Nacht inkubieren. Das Wachstum von Dictyostelium in Gegenwart von Klebsiella aerogenes-Bakterien reduziert die Anzahl der Makropinosomen, was die Reaktion

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Die Anwendung der Elektrophysiologie, barrierefreie Synapsen eine quantifizierbare Messung der synaptischen Aktivität, nützlich bei der Analyse synaptischer Mutanten. Dieser Artikel beschreibt ein Dissektion Methode verwendet, um die motorischen Endplatten (NMJ) von...

Dissecting und Aufnahme von C. elegans neuromuskulären Synapse

Dieses Papier soll den Leser in den Betrieb eines integrierten atomic force-optische Bildgebung Mikroskop für die mechanische Stimulation von lebenden Zellen in Kultur zu unterrichten. Eine Schritt-für-Schritt-Protokoll vorgestellt. Eine repräsentative Datenmenge, die Live-Zell-Antwort auf mechanische Stimulation zeigt vorgestellt.

Live Cell Reaktion auf mechanische Stimulation von Integrated Optical und Atomic Force Microscopy Studium

Infektion der Prostata kann ein Faktor bei der Vermittlung Schmerzen im Beckenbereich bei chronischer Prostatitis sein. Wir beschreiben das Verfahren zur Herstellung von standardisierten bakteriellen Inokulums Instillation von Bakterien in die Harnröhre des männlichen Mäusen und Methodik zur Messung taktile Allodynie bei Mäusen über die Zeit.

Messung der taktile Allodynie in einem Mausmodell der bakteriellen Prostatitis

Ein Protokoll beschrieben, das Anoxie / Hunger in C verwendet elegans zu modellieren Ischämie / Reperfusion. Funktionelle Ergebnisse sind eine erhöhte Sterblichkeit, sichtbare Veränderungen in GFP-markierten neuronalen Prozesse und die Beeinträchtigung der Verhaltensreaktionen, die neuronale Funktion benötigen.

Ein Anoxia-Hunger-Modell für Ischämie / Reperfusion in<em&gt; C. elegans</em

Dieses Video demonstriert ein Protokoll zur Durchführung elektrophysiologischer Einzelfaser-Aufzeichnungen an einem in vitro Maus-Darmnervenpräparat.

In-vitro-Funktionelle Charakterisierung von Maus Colorectal Afferente Endings

Die Verwendung eines angepassten "olfaktorischen Chips" für die effiziente Kalzium Imaging von C. Elegans Männchen ist hier beschrieben. Studien über männliche Einwirkung von Glycerin und ein Pheromon werden ebenfalls angezeigt.

Verwenden einen angepasste mikrofluidischen olfaktorische Chip für die Bildgebung neuronaler Aktivität als Reaktion auf Pheromone in männlichen C. Elegans Kopf Neuronen

Anormale sensorische Funktion zugrunde liegt, viszerale Schmerzen und andere Symptome von funktionellen und entzündlichen Darmerkrankungen. Ein Protokoll für die elektrophysiologische Aufzeichnung der Kolon afferenten Nerven in eine ex Vivo Ratte Colorectum Vorbereitung wird hier vorgestellt.

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Neue Werkzeuge für die Mechanobiology Forschung sind erforderlich, um verstehen, wie mechanischen Beanspruchung biochemische Stoffwechselwege aktiviert und biologische Reaktionen hervorruft. Hier präsentieren wir eine neue Methode zur selektiven mechanischen Stimulation der immobilisierten Tiere mit einem mikrofluidischen Trap ermöglicht hochauflösende Bildgebung der zellulären Antworten.

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Wir haben eine Multi-well-Format Polyacrylamid-basierten Test zum Sondieren der Wirkung der extrazellulären Matrix Steifigkeit auf bakterielle Infektion von adhärenten Zellen entwickelt. Dieser Assay ist kompatibel mit Durchflusszytometrie, Immunostaining und Traktion Rasterkraftmikroskopie, zulassend quantitative Messungen der biomechanischen Wechselwirkungen zwischen Zellen, extrazelluläre Matrix und Pathogene Bakterien.

Ein Multi-well-Format Polyacrylamid-basierten Test zur Untersuchung der Wirkung der extrazellulären Matrix Steifigkeit auf die bakterielle Infektion von adhärenten Zellen

Mechanische Kräfte sind wichtig für die Steuerung der Zellmigration. Dieses Protokoll demonstriert die Verwendung von elastischen Hydrogelen, die mit einer Glasmikropipette und einem Mikromanipulator verformt werden können, um Zellen mit einem lokalen Steifigkeitsgradienten zu stimulieren, um Veränderungen in der Zellstruktur und Migration hervorzurufen.

Einzelzelle Durotaxis Assay zur Beurteilung der mechanischen Steuerung der zellulären Bewegung und verwandter Signalereignisse

Das Ziel dieses Protokolls ist es, zu zeigen, wie ein verbesserter Test für mechanische Nociception in Drosophila Larven durchzuführen. Wir verwenden den Test hier, um zu zeigen, dass mechanische Überempfindlichkeit (Allodynie und Hyperalgesie) in Drosophila Larven existiert.

Ein verbesserter Assay und Werkzeuge zur Messung der mechanischen Nociception in Drosophila Larven

Erfahren Sie die Bewertung zellulärer Reaktionen auf akute mechanische Stimulation bei Dictyostelium discoideum. Diese Methode untersucht Biosensor-Lokalisierung und Proteinaktivierung durch Scherströmung.

Bewertung von Dictyostelium Discoideum Reaktion auf akute mechanische Stimulation

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