Name: Bewertung von Dictyostelium Discoideum Reaktion auf akute mechanische Stimulation (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: Erfahren Sie die Bewertung zellulärer Reaktionen auf akute mechanische Stimulation bei Dictyostelium discoideum. Diese Methode untersucht Biosensor-Lokalisierung und Proteinaktivierung durch Scherströmung.

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<ol><li>Swaney, K. F., Huang, C. H., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+chemotaxis%3A+a+network+of+signaling+pathways+controls+motility%2C+directional+sensing%2C+and+polarity%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic chemotaxis: a network of signaling pathways controls motility, directional sensing, and polarity.</a> Annu Rev Biophys. 39, 265-289 (2010).</li>
<li>Sasaki, A. T., Chun, C., Takeda, K., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+Ras+signaling+at+the+leading+edge+regulates+PI3K%2C+cell+polarity%2C+and+directional+cell+movement%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Localized Ras signaling at the leading edge regulates PI3K, cell polarity, and directional cell movement.</a> J Cell Biol. 167 (3), 505-518 (2004).</li>
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<li>Lim, C. J., Spiegelman, G. B., Weeks, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RasC+is+required+for+optimal+activation+of+adenylyl+cyclase+and+Akt%2FPKB+during+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">RasC is required for optimal activation of adenylyl cyclase and Akt/PKB during aggregation.</a> EMBO J. 20 (16), 4490-4499 (2001).</li>
<li>Kamimura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PIP3-Independent+Activation+of+TorC2+and+PKB+at+the+Cell%27s+Leading+Edge+Mediates+Chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">PIP3-Independent Activation of TorC2 and PKB at the Cell's Leading Edge Mediates Chemotaxis.</a> Curr Biol. 18 (14), 1034-1043 (2008).</li>
<li>Kortholt, A., King, J. S., Keizer-Gunnink, I., Harwood, A. J., Van Haastert, P. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipase+C+Regulation+of+Phosphatidylinositol+3%2C4%2C5-trisphosphate-mediated+Chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Phospholipase C Regulation of Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate-mediated Chemotaxis.</a> Molecular Biology of the Cell. 18 (12), 4772-4779 (2007).</li>
<li>Huang, C. H., Tang, M., Shi, C., Iglesias, P. A., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+excitable+signal+integrator+couples+to+an+idling+cytoskeletal+oscillator+to+drive+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">An excitable signal integrator couples to an idling cytoskeletal oscillator to drive cell migration.</a> Nat Cell Biol. 15 (11), 1307-1316 (2013).</li>
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<li>Gerisch, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mobile+Actin+Clusters+and+Traveling+Waves+in+Cells+Recovering+from+Actin+Depolymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Mobile Actin Clusters and Traveling Waves in Cells Recovering from Actin Depolymerization.</a> Biophys J. 87 (5), 3493-3503 (2004).</li>
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<li>Bretschneider, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Three-Dimensional+Dynamics+of+Actin+Waves%2C+a+Model+of+Cytoskeletal+Self-Organization%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">The Three-Dimensional Dynamics of Actin Waves, a Model of Cytoskeletal Self-Organization.</a> Biophys J. 96 (7), 2888-2900 (2009).</li>
<li>Weiner, O. D., Marganski, W. A., Wu, L. F., Altschuler, S. J., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Actin-Based+Wave+Generator+Organizes+Cell+Motility%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Biol%22%5BJournal%5D)">An Actin-Based Wave Generator Organizes Cell Motility.</a> PLOS Biol. 5 (9), e221(2007).</li>
<li>Devreotes, P., Horwitz, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+Networks+that+Regulate+Cell+Migration%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Signaling Networks that Regulate Cell Migration.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (8), (2015).</li>
<li>Artemenko, Y., Lampert, T. J., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moving+towards+a+paradigm%3A+common+mechanisms+of+chemotactic+signaling+in+Dictyostelium+and+mammalian+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Moving towards a paradigm: common mechanisms of chemotactic signaling in Dictyostelium and mammalian leukocytes.</a> Cell Mol Life Sci. 71 (19), 3711-3747 (2014).</li>
<li>Dalous, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+cell+polarity+and+actin-myosin+cytoskeleton+reorganization+under+mechanical+and+chemical+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Reversal of cell polarity and actin-myosin cytoskeleton reorganization under mechanical and chemical stimulation.</a> Biophys J. 94 (3), 1063-1074 (2008).</li>
<li>Sato, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Switching+direction+in+electric-signal-induced+cell+migration+by+cyclic+guanosine+monophosphate+and+phosphatidylinositol+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Switching direction in electric-signal-induced cell migration by cyclic guanosine monophosphate and phosphatidylinositol signaling.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (16), 6667-6672 (2009).</li>
<li>Zhao, M., Pu, J., Forrester, J. V., McCaig, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+lipids%2C+EGF+receptors%2C+and+intracellular+signals+colocalize+and+are+polarized+in+epithelial+cells+moving+directionally+in+a+physiological+electric+field%5BTitle%5D)+AND+%22Faseb+j%22%5BJournal%5D)">Membrane lipids, EGF receptors, and intracellular signals colocalize and are polarized in epithelial cells moving directionally in a physiological electric field.</a> Faseb j. 16 (8), 857-859 (2002).</li>
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<li>Gaudet, P., Pilcher, K. E., Fey, P., Chisholm, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+Dictyostelium+discoideum+with+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Transformation of Dictyostelium discoideum with plasmid DNA.</a> Nat. Protocols. 2 (6), 1317-1324 (2007).</li>
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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Die hier beschriebenen Methoden bieten eine bequeme Möglichkeit, Bevölkerung und einzelne Zelle Verhalten um Strömung Scheren zu beurteilen. Wichtig ist, während frühere Studien Lokalisierung von leading und lagging Rand Markierungen während der Migration analysiert, ermöglicht das derzeitige Konzept Untersuchung der unmittelbaren Auswirkungen durch die Anwendung der Schubfluss akut. Mit dieser Methode haben wir gezeigt, dass in der Tat, die erste Reaktion der Zellen fließen Scherung Zellwanderung nicht erforderlich ist....

Migration von eukaryotischen Zellen ist durch unterschiedliche chemische und physikalische Hinweise in der Umgebung, einschließlich Steigungen von löslichen oder Substrat gebunden Chemoattractants, variabler Steifigkeit der Substrate, elektrische Felder oder Schubfluss vorgespannt. Zwar gab es viele Fortschritte in unserem Verständnis der molekularen Mechanismen fahren Chemotaxis, weniger ist bekannt über andere Arten von gerichtete Migration und wie diese vielfältigen Signale auf zellulärer Ebene zu einer einheitlichen produzieren integriert sind wandernde Antwort.
Migration in Richtung einer zunehmenden Konzentration von einem Lockstoffgradient umfasst drei Verhaltens Komponenten gerichtet: Motilität, direktionale sensing und Polarität1. Motilität bezieht sich auf zufällige Bewegung der Zellen durch Pseudopod Vorsprung erreicht. Gerichtete Sensorik ist die Fähigkeit einer Zelle, die Ursache für eine Lockstoffgradient zu ermitteln, die auftreten können, auch in Zellen immobilisiert. Polarität bezieht sich auf die stabiler asymmetrische Verteilung der intrazellulären Komponenten zwischen den führenden und rückständigen Rand einer Zelle, führt zu erhöhten Persistenz in Bewegung.
Zelluläre Reaktion auf eine Lockstoffgradient hängt von der Aktivität von vier konzeptionell definierte Regulationsnetzwerke: Rezeptor / G Protein, Signaltransduktion, Aktin-Zytoskelett und Polarität1. Lockstoffgradient Bindung an den G-Protein-gekoppelten Rezeptor überträgt das Signal über Heterotrimeric G Proteine α und βγ auf die nachgeschalteten Signaltransduktion Netzwerk, das die Richtungs-Signal verstärkt. Mehrere Wege innerhalb des Netzwerks Signal Transduction parallel agieren und fließen in das Aktin Zytoskelett Netzwerk Bias Aktin-Polymerisation und konsequente Pseudopod Vorsprung, in die Richtung des Farbverlaufs. Unter wichtige Regulatoren der Chemotaxis sind Ras GTPase, TorC2, Phosphoinositide 3-Kinase (PI3K), Phosphatase und tensin Homolog (PTEN) und Guanylyl Cyclase. Feedback-Mechanismen innerhalb des Signal-Transduktion-Netzwerks und zwischen der Signaltransduktion und Aktin-Zytoskelett-Netzwerke weiter verstärken die Reaktion. Schließlich, das schlecht definierte Polarität Netzwerk erhält Eingaben aus dem Aktin-Zytoskelett und weitere Vorurteile Signal Transduction Netzwerk zur Förderung der anhaltenden Migration in die Richtung des Farbverlaufs.
Ein Großteil unserer mechanistisches Verständnis der Chemotaxis wurde aufgrund der Entwicklung von Eindringmittel getaggt Biosensoren für verschiedene Komponenten des regulatorischen Netzwerken ermöglicht. Viele Chemotaxis Regulatoren haben eine asymmetrische Verteilung der regulatorischen Molekül selbst oder seine Tätigkeit. Z. B. Biosensoren, die erkennen aktiviert Versionen von kleinen GTPases Ras und Rap1-Ras-bindende Domänen von Raf1 (bezeichnet als RBD hier) und RalGDS, bzw. – zu lokalisieren, an der Vorderkante der Chemotaxing Zelle2,3. In ähnlicher Weise PI3K und seine Produkt Phosphatidylinositol (3,4,5)-Trisphosphate (PIP3), anerkannt durch eine Pleckstrin Homologie (PH) Domäne zeigen auch Lokalisierung an der Vorderseite der Zelle4,5. Im Gegensatz dazu eine 3-Phosphatase PTEN, wandelt die PIP3 zurück zu Phosphatidylinositol (4,5)-Bisphosphate, lokalisiert an den rückständigen Rand der Zelle6. Wichtig ist, ändern Sie diese Biosensoren ihrer Lokalisation in Reaktion auf die globale Stimulation mit einem Lockstoffgradient. Vorderkante Marker, die cytosolische oder relocalize an den Spitzen der Vorsprünge in eine ruhende Zelle zum Kortex, während Rand Marker, hinkt die kortikalen Lokalisierung und Fehlen von den Spitzen der Vorsprünge in eine ruhende Zellen werden nach der cytosolischen die Stimulation. Analyse der Biosensor Verteilung in Reaktion auf die globale Stimulation mit einem Lockstoffgradient minimiert den Beitrag der Motilität und Polarität, die oft die Beobachtungen zu verwirren. Global oder gleichmäßige Stimulation eine Zellsuspension mit einem Lockstoffgradient ist auch als Werkzeug zur bevölkerungsweite Veränderungen in Protein-Aktivierung, oft röntgenologisch Protein Phosphorylierung7,8,9 . Diese biochemischen Assay dient vor allem zeitliche Informationen zu während Mikroskopie verwendet wird, um zeitliche und räumliche Informationen über das Verhalten der verschiedenen Komponenten des regulatorischen Netzwerken zu sammeln.
Das Signal Transduction Netzwerk enthält Merkmale eines erregbar System10,11. Reaktionen auf supra-Schwelle chemotaktische Reize sind "verdeutlichen" und feuerfeste Perioden anzeigen. Antworten sind auch stochastisch ausgelöst und oszillierenden Verhalten zeigen können. Signal-Transduktion Ereignisse sind in Regionen des Cortex lokalisiert, die wie Wellen12,13,14,15zu propagieren. Vorne, zurück, Marker zu rekrutieren oder distanziert, die aktiven Zonen der propagierende Wellen. Aufgrund der feuerfesten Region hinter der aktiven Zone vernichten die entgegengesetzt gerichteten Wellen treffen. Die verbreitende Signal Transduction Wellen unterliegen die zelluläre Vorsprünge, die Zelle Migration10vermitteln.
Viele der genannten Informationen über Chemotaxis kam aus den Studien auf die soziale Amöbe Dictyostelium Discoideum, obwohl ähnliche Regulationsmechanismen auch auf Neutrophilen und andere Säugetier-Zelle Arten16 anwendbar sind . Dictyostelium ist ein gut etabliertes Modellorganismus, der hat eine robuste chemotaktische Reaktion während der Hungersnot, wenn Tausende von einzelnen Zellen in einer Aggregation Mitte, schließlich bildet eine vielzellige Fruchtkörper mit Sporen migrieren. Chemotaxis ist auch während der einzelligen Wachstumsphase dieses Organismus zur Ortung von bakteriellen Nahrungsmittelquellen wichtig. Wichtig ist, ist die Migration von Einzelzellen Dictyostelium bemerkenswert ähnlich wie die Migration von Säugetieren Neutrophile oder metastatischen Krebszellen, die sehr schnelle amöboiden Typ Migration zu unterziehen. In der Tat sind sowohl die allgemeine Topologie der regulatorischen Netzwerke, sowie viele der einzelnen Transduktion Signalwege beteiligt Chemotaxis zwischen Dictyostelium und Säugetieren Leukozyten17konserviert. Darüber hinaus nutzen andere Zellen, wie Fibroblasten, Rezeptor-Tyrosin-Kinasen (RTK) anstelle von GPCRs; jedoch kann RTKs in ähnliche Netze einspeisen.
Im Gegensatz zur Chemotaxis fehlt gründliches Verständnis der Signalisierung Mechanismen, die verschiedenen Verkehrsträger gerichtete Migration zu fahren. In ähnlicher Weise auf Zellen in einem Lockstoffgradient Verlauf migrieren mehrere Studien haben berichtet Aktivierung und/oder Lokalisierung von typischen Vorderkante Markierungen, einschließlich Aktin-Polymerisation, PIP3 und/oder extrazelluläre Signal-regulierte Kinase (ERK) 1/2, bei der Vorderseite der Zellen gerichtet Migration als Reaktion auf Flow oder Änderungen in elektrischen Feldern18,19,20,21zu scheren. Führte jedoch in diesen Studien Dauerbelastung auf den Stimulus auch Zellwanderung, lassen offen die Frage, ob beispielsweise die Vorderkante Marker speziell in Reaktion auf einen Reiz zu lokalisieren, oder wenn sie einfach an der Vorderkante zu lokalisieren aufgrund erhöhten Anzahl von Scheinfüßchen an der Vorderseite des eine wandernde Zelle.
Wir entwickelten Assays, die uns erlauben, die Reaktion der Zellen auf akute mechanische Störung geliefert als Schubfluss sowohl auf Bevölkerungsebene sowie Einzelzellen22zu beobachten. Ähnlich wie bei globalen Stimulation mit einem Lockstoffgradient, akute stimulaTion mit Schubfluss ermöglicht die Studie eine zelluläre Reaktion auf einen mechanischen Reiz ohne verwirrende Beitrag von Motilität oder Polarität. Kombinieren diese mikroskopische und biochemische Tests mit genetischen oder pharmakologische Störungen ermöglicht es uns, erfahren über wie mechanische Reize wahrgenommen werden und übermittelt werden. Darüber hinaus bietet dieser Ansatz auch eine neuartige Methode zur Erschließung des Systems unterhalb des Lockstoffgradient-Rezeptors in Ermangelung eines Lockstoffgradient, damit das Signal Transduktion und Aktin Zytoskelett Netzwerke aus dem Rezeptor/G zu isolieren Protein-Netzwerk.
Mit den Techniken, die wir kürzlich beschriebenen demonstrierte, dass akute Scherbeanspruchung führt zu Aktivierung mehrerer Komponenten der chemotaktische Signal Transduction und Aktin Zytoskelett Netzwerke22. Durch die Anwendung des akute mechanischen Reizes in unterschiedlichen Abständen, haben wir bewiesen, dass in ähnlicher Weise zu Chemoattractants, Reaktion auf mechanische Reize auch bietet eine erregbare Systems, einschließlich das verdeutlichen Verhalten die Reaktion unter Ausstellungen Bedingungen und das Vorhandensein von einer Refraktärzeit zu sättigen. Durch die Kombination von mechanischen und chemischen Stimulation haben wir schließlich gezeigt, dass die beiden Reize teilen Signal Transduction und Aktin Zytoskelett Netzwerke, die wahrscheinlich für die Integration von mehreren reizen, Bias Zellwanderung ermöglichen.

<table><tbody><tr><td>Reagenzien</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Fisher</td><td>D16-1</td><td>Zur Herstellung von HL-5-Medien und SM-Platten (Schritte 1.1, 1.2)</td></tr><tr><td>Proteose-Pepton</td><td>Fisher</td><td>DF0120-17-6</td><td>Zur Herstellung von HL-5-Medien (Schritt 1.1)</td></tr><tr><td>Hefeextrakt</td><td>Fisher</td><td>50-550-445</td><td>Zur Herstellung von HL-5-Medien und SM-Platten (Schritte 1.1, 1.2)</td></tr><tr><td>Na2HPO4&middot; 7H2O</td><td>Fisher</td><td>S373-500</td><td>Zur Vorbereitung von HL-5-Medien und 10X Phosphatpuffer (Schritte 1.1, 1.3)</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fisher</td><td>P386-500</td><td>Zur Vorbereitung von HL-5-Medien, SM-Platten und 10X Phosphatpuffer (Schritte 1.1-1.3)</td></tr><tr><td>Streptomycin (Dihydrostreptomycinsulfat)</td><td>Fisher</td><td>ICN10040525</td><td>Zur Herstellung von HL-5-Medien (Schritt 1.1)</td></tr><tr><td>Peptone (Bacto)</td><td>Fisher</td><td>DF0118-17-0</td><td>Zur Vorbereitung von SM-Platten (Schritt 1.2)</td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Fisher</td><td>P288-100</td><td>Zur Vorbereitung von SM-Platten (Schritt 1.2)</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher</td><td>BP1423-500</td><td>Zur Vorbereitung von SM-Platten (Schritt 1.2)</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Fisher</td><td>M65-500</td><td>Zur Vorbereitung von DB Buffer (Schritt 1.4)</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher</td><td>C79-500</td><td>Zur Herstellung von DB-Puffer (Schritt 1.4)</td></tr><tr><td>Koffein</td><td>Fisher</td><td>O1728-500</td><td>Zur Zubereitung von Koffein (Schritt 1.5)</td></tr><tr><td>cAMP (EMD Millipore Calbiochem Adenosin 3 ft.,5 ft.-cyclisches Monophosphat, Natriumsalz)</td><td>Fisher</td><td>11-680-1100MG</td><td>Zur Herstellung von cAMP (Schritt 1.6)</td></tr><tr><td>Folsäure</td><td>Sigma</td><td>F7876</td><td>Zur Herstellung von Folsäure Saure (Schritt 1.7)</td></tr><tr><td>Trisbase</td><td>Fisher</td><td>BP152-500</td><td>Zur Herstellung von 3X Probenpuffer (Schritt 1.8)</td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfat (SDS)</td><td>Fisher</td><td>BP166-500</td><td>Zur Herstellung von 3X Probenpuffer (Schritt 1.8)</td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Fisher</td><td>G33-500</td><td>Zur Herstellung von 3X Probenpuffer (Schritt 1.8)</td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Bio-Rad</td><td>1610610</td><td>Zur Herstellung von 3X Probenpuffer (Schritt 1.8)</td></tr><tr><td>Bromphenolblau</td><td>Bio-Rad</td><td>1610404</td><td>Zur Herstellung von 3X Probenpuffer (Schritt 1.8)</td></tr><tr><td>NaF</td><td>Fisher</td><td>S299-100</td><td>Zur Herstellung von Probenpuffer mit Protease- und Phosphatase-Inhibitoren (Schritt 1.8)</td></tr><tr><td>Na3VO4</td><td>Fisher</td><td>50-994-911</td><td>Zur Herstellung von Probenpuffer mit Protease- und Phosphatase-Inhibitoren (Schritt 1.8)</td></tr><tr><td>Natriumpyrophosphat-Decahydrat</td><td>Fisher</td><td>S390-500</td><td>Zur Herstellung von Probenpuffer mit Protease- und Phosphatase-Inhibitoren (Schritt 1.8)</td></tr><tr><td>Vollständiger EDTA-freier Protease-Inhibitor-Cocktail (Roche)</td><td>Sigma</td><td>11873580001</td><td>Zur Herstellung von Probenpuffer mit Protease- und Phosphatase-Inhibitoren (Schritt 1.8)</td></tr><tr><td>Latrunculin A</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>BML-T119-0100</td><td>Zur Herstellung von Latrunculin A (Schritt 1.9)</td></tr><tr><td>4-15 % Tris-HCl Polyacrylamid-Gel</td><td>Bio-Rad</td><td>3450029</td><td>Zur Verwendung beim Immunblotting (Schritt 3.3)</td></tr><tr><td>Polyvinylidenfluorid-Membran</td><td>Bio-Rad</td><td>1620177</td><td>Zur Verwendung beim Immunblotting (Schritt 3.3)</td></tr><tr><td>Phospho-PKC (pan) (zeta Thr410) (190D10) Kaninchen-Antikörper</td><td>Cell Signaling</td><td>2060</td><td>Primärer Antikörper zur Verwendung beim Immunblotting (Schritt 3.3)</td></tr><tr><td>Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) ( D13.14.4E) XP-Antikörper</td><td>Cell Signaling</td><td>4370</td><td>Primärer Antikörper zur Verwendung beim Immunblotting (Schritt 3.3)</td></tr><tr><td>Kaninchen-IgG HRP Linked Whole Ab (von Esel)</td><td>GE Healthcare</td><td>NA934-100UL</td><td>Sekundärer Antikörper zur Verwendung beim Immunblotting (Schritt 3.3)</td></tr><tr><td>Verstärktes Chemilumineszenzsubstrat (Clarity Western ECL-Substrat)</td><td>Bio-Rad</td><td>1705060</td><td>Verwendung beim Immunblotting (Schritt 3.3)</td></tr><tr><td>Stripping-Puffer (Restore Plus Western-Blot-Stripping-Puffer)</td><td>Pierce</td><td>PI46430</td><td>Verwendung für Immunblotting (Schritt 3.3)</td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue</td><td>Fisher</td><td>PI20278</td><td>Verwendung für Immunblotting (Schritt 3.3)</td></tr><tr><td>K. aerogenes Stamm (nicht pathogen)</td><td>Dicty Stock Center (dictybase.org)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</strong<></td><td>strong>Company</td><td>Katalognummer</td><td>Kommentare</td></tr><tr><td>Materialien und Ausrüstung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Orbitalschüttler (Modell G-33 oder eine vergleichbare Alternative)</td><td>New Brunswick Scientific</td><td></td><td>Zur Züchtung von K. aerogenes (Schritt 2.1.1) und zur Stimulation von D. discoideum-Zellen (Schritt 3). Der Drehradius für diesen Shaker beträgt 9,5 mm.</td></tr><tr><td>10 cm Petrischale</td><td>Fisher</td><td>FB0875712</td><td>Zur Vorbereitung von SM-Platten (Schritt 1.2)</td></tr><tr><td>Hämozytometer</td><td>Fisher</td><td>02-671-51B</td><td>Zur Zählung von D. discoideum Zellen (Schritt 2.1.2)</td></tr><tr><td>35-mm-Schale (Corning Falcon Easy-Grip Gewebekulturschale)</td><td>Fisher</td><td>08-772A</td><td>Zur Platte von D. discoideumZellen für die mechanische Stimulation und anschließende Zelllyse (Schritt 3.1.1)</td></tr><tr><td>Becher aus Polystyrol (5 mL)</td><td>VWR</td><td>13915-985</td><td>Zur Stimulation von D. discoideum Zellsuspension mit einem Chemoattraktivstoff (Schritt 3.2.2)</td></tr><tr><td>Fluidische Einheit mit Pumpe (ibidi Pump System)</td><td>Ibidi</td><td>10902</td><td>Zur mechanischen Stimulation von d. discoideum Zellen in einem Kanal (Schritte 4.1, 4.2 und 5)</td></tr><tr><td>Objektträger mit Kanal (&mu;-Objektträger III 3in1 ibiTreat: #1.5 Polymer-Deckglas, Gewebekultur behandelt, sterilisiert)</td><td>Ibidi</td><td>80316</td><td>Zur Platte von D. discoideum-Zellen für die mechanische Stimulation, die von einem fluidischen Gerät abgegeben wird (Schritte 4.1, 4.2 und 5)</td></tr><tr><td>50-ml-Reservoire (Ibidi Reservoirhalter für Fluidik-Einheit)</td><td>Ibidi</td><td>10978</td><td>Verwenden Sie diese Option, um die fluidische Vorrichtung für die Verabreichung mechanischer Stimulation an d. discoideum Zellen in einem Kanal einzurichten (Schritte 4.1, 4.2 und 5)</td></tr><tr><td>Leitungen für die fluidische Einheit (Perfusionsset GELB-und-GRÜN)</td><td>Ibidi</td><td>10964</td><td>Verwenden Sie diese Option, um die fluidische Vorrichtung für die Verabreichung mechanischer Stimulation an D. discoideum Zellen in einem Kanal einzurichten (Schritte 4.1, 4.2 und 5). Hinweis: Die beiden Leitungen können auch aus dem 1,6 mm Schlauch (Katalognummer 10842) geschnitten werden.</td></tr><tr><td>Leitung für den Abfluss (Schlauch mit einem Innendurchmesser von 1,6 mm)</td><td>Ibidi</td><td>10842</td><td>Zum Einrichten des fluidischen Geräts zur Verabreichung mechanischer Stimulation von d. discoideum Zellen in einem Kanal (Schritte 4.1, 4.2 und 5).</td></tr><tr><td>Zeiss Observer.Z1 inverses Mikroskop mit einem 40X/1,3 Ölobjektiv und einem 20X/0,3 Luftobjektiv (oder einer vergleichbaren Alternative)</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Zur Abbildung von D. discoideum Küvetten mit Phasenkontrast- oder Fluoreszenzbeleuchtung (Schritte 4 und 5)</td></tr><tr><td>UltraView Konfokalmikroskop mit Spinning-Disk, ausgestattet mit einem 40-fachen;/1,25&ndash; 0,75 Ölobjektiv (oder eine vergleichbare Alternative)</td><td>Perkin-Elmer</td><td>DM 16000</td><td>Alternative zur Abbildung von D. discoideum Zellen (Schritt 4.1.4)</td></tr><tr><td>FemtoJet Microinjector (Eppendorf; Modell 5247 oder eine vergleichbare Alternative) mit Eppendorf InjectMan</td><td>Eppendorf</td><td>5252000021D und 5192000027</td><td>Zur mechanischen Stimulation von D. discoideumZellen durch eine Mikropipette (Schritt 4.3). Hinweis: Die Katalognummern beziehen sich auf die neueste Version des Gerätes (4i).</td></tr><tr><td>Mikropipette (Femtotip; 1 &mu; m Außendurchmesser, 0,5 &mu; m Innendurchmesser )</td><td>Eppendorf</td><td>930000035</td><td>Zur mechanischen Stimulation von D. discoideum Zellen mit einer Mikropipette (Schritt 4.3)</td></tr><tr><td>Microloader-Spitzen (Eppendorf Femtotips Microloader-Spitzen für Femtojet Microinjector)</td><td>Eppendorf</td><td>5242956.003</td><td>Zum Befüllen der Mikropipette (Femtospitze) mit Puffer (Schritt 4.3.1)</td></tr><tr><td>1-Well-Kammer (Thermo Scientific Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass)</td><td>Fisher</td><td>12-565-472</td><td>Zur Platte von D. discoideum Zellen für die mechanische Stimulation durch eine Mikropipette (Schritt 4.3.2)</td></tr><tr><td>8-Well-Kammer (Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II Kammer-Deckglas)</td><td>Fisher</td><td>12-565-338</td><td>Zur Platte von D. discoideum Zellen für die mechanische Stimulation durch Bulk-Pufferzugabe (Schritt 4.4.1)</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalognummer</td><td>Comments<</td></tr><tr><td>strong>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image Analysis Software (Fiji)</td><td>NIH</td><td>https://fiji.sc/</td> <td>Zur Quantifizierung der Reaktion auf mechanische Stimulation (Schritt 4.5)</td></tr><tr><td>Migrationsanalysesoftware (Tracking Tool PRO)</td><td>Gradientech</td><td>http://gradientech.se/tracking-tool-pro/</td> <td>Zur Quantifizierung der Zellgeschwindigkeit und -persistenz (Schritt 5.4)</td></tr></tbody></table>

bewertung von dictyostelium discoideum reaktion auf akute mechanische stimulation

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Chemotaxis oder Migration eine Steigung von einem Lockstoffgradient ist die am besten verstanden gerichtete Migration. Studien über soziale Amöbe Dictyostelium Discoideum ergab, dass ein komplexes Signal Transduction Netzwerk von parallelen Bahnen die Reaktion auf Chemoattractants verstärkt und zu voreingenommen Aktin-Polymerisation und Vorwölbung des Pseudopod in führt der Richtung eines Verlaufs. Im Gegensatz dazu sind die molekulare Mechanismen fahren andere Arten von gerichtete Migration, z. B. durch Einwirkung von Strom oder elektrische Felder, Scheren nicht bekannt. Viele Regulatoren der Chemotaxis Lokalisierung am führenden oder rückständigen Rand einer wandernden Zelle aufweisen, sowie vorübergehende Änderungen in Lokalisierung oder Aktivierung nach globalen Stimulation mit einer Lockstoffgradient zu zeigen. Um zu verstehen, die molekularen Mechanismen der anderen Arten von gerichtete Migration entwickelten wir eine Methode, die Untersuchung der zellulären Reaktion auf akute mechanische Stimulation basierend auf kurze (2 bis 5 s) Exposition, Flow zu scheren ermöglichen. Diese Stimulation kann in einem Kanal geliefert werden, während der Bildgebung Zellen Eindringmittel beschriftet Biosensoren untersuchen einzelne Zelle Verhalten zum Ausdruck zu bringen. Darüber hinaus kann Zellpopulation angeregt werden, in einen Teller, lysiert, und Immunoblotted mit Antikörpern, die aktive Versionen der interessierenden Proteine erkennen. Durch die Kombination beider Assays, kann man eine Vielzahl von Molekülen, die durch Veränderungen der subzellulären Lokalisierung und/oder Phosphorylierung aktiviert untersuchen. Mit dieser Methode haben wir festgestellt, dass akute mechanische Stimulation Aktivierung der chemotaktische Signal Transduction und Aktin Zytoskelett Netze auslöst. Die Möglichkeit zu prüfen, zelluläre Reaktionen auf akute mechanische Stimulation ist wichtig für das Verständnis der auslösenden Ereignisse notwendig für Scherung strömungsinduzierte Motilität. Dieser Ansatz bietet auch eine Tool für das Studium der chemotaktische Signal Transduction Netzwerk ohne verwirrende Einfluss des Lockstoffgradient-Rezeptors.

Zeitliche Reaktion der Chemotaxis Regulierungsbehörden auf akute mechanische stimulation
Um die Reaktion von D. Discoideum Zellen auf mechanische Stimulation zu beurteilen, wurden anhaftende Aggregation-kompetente Zellen einen kurzen Impuls von Schubfluss ausgesetzt. Zusammenfassung-kompetente D. Discoideum Zellen absondern, Lager, das von benachbarten Zellen zu spüren. Um den Beitrag der Zell-Zell-Signalisierung ...

Hier beschreiben wir Methoden zur Bewertung der zelluläre Reaktion auf akute mechanische Stimulation. In der Mikroskopie-basierten Test untersuchen wir Lokalisierung von Eindringmittel beschriftet Biosensoren nach kurzer Stimulation mit Schubfluss. Wir testen auch biochemisch Aktivierung verschiedener Proteine des Interesses in Reaktion auf akute mechanische Stimulation.

Bewertung von Dictyostelium Discoideum Reaktion auf akute mechanische Stimulation

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Aktivität verschiedener Komponenten des intrazellulären Signaltransduktionsnetzwerks nach kurzer mechanischer Störung zu untersuchen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Zellmigration zu beantworten, z. B. wie Zellen verschiedene Umweltreize, einschließlich mechanischer Reize, wahrnehmen und in diese Richtung wandern. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Untersuchung der anfänglichen Reaktion auf mechanische Reize ermöglicht, ohne den verwirrenden Beitrag von Motilität oder Polarität zur Reaktion.Wir hatten die Idee zu dieser Methode, als wir die Reaktion der adhärenten Zellen auf das Chemolockstoff testeten, das mit einer leichten Bewegung verabreicht wurde, und wir eine robuste Reaktion der Zellen bemerkten, die mit Vehikelkontrolle stimuliert wurden. Bereiten Sie zunächst Klebsiella aerogenes vor, indem Sie eine kleine Anzahl von Zellen aus gefrorenem Stamm ohne Antibiotika in HL5-Medium inokulieren und die Kultur über Nacht inkubieren. Das Wachstum von Dictyostelium in Gegenwart von Klebsiella aerogenes-Bakterien reduziert die Anzahl der Makropinosomen, was die Reaktionsfähigkeit der Zellen auf äußere Reize verbessert.Planen Sie das Experiment so, dass, wenn die Bakterien bereit sind, Dictyostelium exponentiell wächst. Sammeln Sie diese Dictyostelium-Zellen und zählen Sie sie mit einem Hämozytometer. Verteilen Sie dann 260 Mikroliter der Bakteriensuspension mit 100.000 Dictyostelium-Zellen auf eine SM-Platte.Bereiten Sie auch für die Versicherung Platten mit doppelt so vielen und halb so vielen Dictyostelium-Zellen vor. Nach einem Tag Wachstum bei Raumtemperatur drehen Sie die Platte um und kultivieren Sie die Platte weiter, bis die Dictyostelium-Zellen beginnen, den Bakterienrasen zu reinigen, aber noch nicht mit der Aggregation begonnen haben. Geben Sie dann fünf Milliliter DB-Puffer auf die Platte und kratzen Sie das Dictyostelium mit einem Glasstreuer ab.Übertragen Sie die Zellen und die Lösung in ein 50-Milliliter-Röhrchen aus Polypropylen, spülen Sie die Platte mit fünf weiteren Millilitern DB aus und geben Sie diese ebenfalls in das 50-Milliliter-Röhrchen. Wiederholen Sie den Vorgang bei Bedarf. Um das Dictyostelium zu waschen, füllen Sie das Röhrchen auf bis zu 50 Milliliter mit DB, pelletieren Sie die Zellen und saugen Sie dann den Überstand ab und entsorgen Sie ihn.Waschen Sie die Zellen wiederholt, bis der Überstand klar ist. Zum Schluss resuspendieren Sie das Dictyostelium in DB-Puffer auf etwa fünf Millionen Zellen pro Milliliter. Zu Beginn werden zwei Millionen aggregationskompetente Dictyostelium mit zwei Millilitern DB auf 35-Millimeter-Schalen aufgetischt. Bereiten Sie eine Platte für jeden Zeitpunkt und eine nicht stimulierte Kontrolle vor.Lassen Sie die Zellen bei Raumtemperatur 10 Minuten lang an der Platte haften. Waschen Sie dann die nicht angeschlossenen Zellen mit zwei Spülgängen mit einem Milliliter DB von der Platte. Sobald die Platten von ungebundenem Dictyostelium befreit sind, inkubieren Sie die angehängten Zellen 30 Minuten lang in Basolationspuffer, ohne die Platten zu stören. Es ist sehr wichtig, während der halbstündigen Inkubation jegliche Bewegung der Platten zu vermeiden, um eine vorzeitige Stimulation der Zellen zu verhindern.Um nun eine kontrollierte Menge an mechanischer Stimulation anzuwenden, übertragen Sie eine Platte einzeln auf einen Orbitalschüttler und lassen Sie den Shaker fünf Sekunden lang mit 150 U/min laufen. Dann, nach der gewünschten Zeit, den Puffer ansaugen und die Platte umgehend auf Eis legen. Sofort 100 Mikroliter Probenpuffer mit Protease- und Phosphatase-Inhibitoren zugeben und die Zellen abkratzen.Sammeln Sie das Lysat in 1,5-Milliliter-Röhrchen und erhitzen Sie diese umgehend 10 Minuten lang auf 95 Grad Celsius. Fahren Sie mit der Analyse des Lysats fort oder übertragen Sie es zur Lagerung auf minus 20 Grad Celsius. Nach der Herstellung von Suspensionen vegetativer oder aggregationskompetenter Zellen werden etwa 600 Mikroliter in den mikrofluidischen Kammerobjektträger geladen.Die Einlässe müssen vollständig gefüllt sein, also füllen Sie sie bei Bedarf mit Puffer auf. Lassen Sie die Zellen 10 Minuten lang anheften. Schließen Sie eine Eingangsleitung für das Gerät an eine elektronische Pumpe mit einem 15-Milliliter-Behälter an.Schließen Sie mit der Softwaresteuerung für die Pumpe das Ventil und füllen Sie dann den Behälter mit DB. Stellen Sie nun den Druck auf 50 Millibar ein und schalten Sie die Pumpe ein. Füllen und spülen Sie die Leitung mit DB, indem Sie auf das Ventil klicken, um es zu öffnen. Drehen Sie nach ca. 30 Sekunden Spülen den Druck wieder auf Null und schließen Sie dann das Ventil.Verbinden Sie als Nächstes die Leitung mit einem der drei Einlässe auf einer Seite der Folie. Schließen Sie keine Luftblasen ein und decken Sie nach dem Herstellen der Verbindung die beiden anderen Einlässe auf dieser Seite der Rutsche ab. Schließen Sie nun die Einrichtung ab, indem Sie die Leitung vom Abfluss mit dem einzigen Auslass auf der gegenüberliegenden Seite der Rutsche verbinden.Betrachten Sie dann unter einer Hellfeld- oder Phasenbeleuchtung an einem Fluoreszenzmikroskop den Kanal mit einem 20-fachen Luftobjektiv und spülen Sie den Kanal. Stellen Sie anschließend den Druck auf ca. 50 Millibar ein und öffnen Sie das Ventil. Sobald die Flüssigkeit aus dem Abfluss kommt, reduzieren Sie den Außendruck auf Null, warten Sie etwa 30 Sekunden und schließen Sie das Ventil.Wechseln Sie als Nächstes zum 40X-Ölobjektiv, fokussieren Sie sich auf den breitesten Teil des Kanals und bereiten Sie die Software so vor, dass alle drei Sekunden Bilder mit RFP- oder GFP-Beleuchtung aufgenommen werden. Stellen Sie bei geschlossenem Ventil den Druck auf den gewünschten Wert ein. Nehmen Sie dann fünf Bilder vor der Stimulation im Abstand von drei Sekunden auf.Öffnen Sie anschließend kurz das Ventil, um den Reiz abzugeben. Erfassen Sie nun mindestens 15 weitere Datenframes im Verlauf von 45 Sekunden. Quantifizieren Sie die Antwort, wie im Textprotokoll beschrieben.Laden Sie zunächst einen mikrofluidischen Objektträger mit Dictyostelium, wie im vorherigen Abschnitt beschrieben. Bereiten Sie für dieses Experiment zwei Eingabezeilen vor. Um die Leitungen zu schließen, verwenden Sie eine physische Klemme an der Leitung, die die Aufbereitungslösung führt, und das softwaregesteuerte Ventil, um die Leitung mit der DB-Lösung mit dem Fahrzeug zu schließen.Füllen Sie nun die beiden Linien mit der entsprechenden Lösung, Puffer plus Vehikel allein oder Puffer mit der Behandlung, z. B. einem Inhibitor. Nachdem die Leitungen gespült wurden, verbinden Sie sie mit zwei Einlässen an der Seite des Schiebers mit der Schiene und verschließen Sie den unbenutzten Einlauf. Verbinden Sie dann die Abflussleitung mit dem Auslass auf der gegenüberliegenden Seite.Waschen Sie nun den Objektträger mit dem Puffer plus Fahrzeug wie zuvor beschrieben. Füllen Sie dann den Kanal mit der Behandlung. Reduzieren Sie zunächst den Durchfluss auf null Millibar.Schalten Sie dann die Ventile um, lassen Sie die Behandlung etwa 15 Sekunden lang laufen und beginnen Sie mit der Timierung der Inkubation. Lassen Sie etwa alle 10 Minuten etwa 15 Sekunden lang frische Behandlungslösung über die Zellen fließen, um den Sauerstoffgehalt in der Kammer wieder aufzufüllen. Adhärente aggregationskompetente Zellen wurden mit einem Orbitalschüttler fünf Sekunden lang einer Scherströmung ausgesetzt.Die Dictyostelium wurden mit Koffein vorbehandelt, um ihre basale Aktivität zu reduzieren. Infolgedessen gab es eine sehr geringe basale Aktivität von PKBR1 und ERK2 und einen robusten Anstieg der Phosphorylierung der Schlüsselreste dieser Kinasen mit der Stimulation. In aggregationskompetenten Zellen, die verschiedene fluoreszenzmarkierte Biosensoren exprimieren, zeigten zwei Marker an der Vorderkante, PHcrac und LimE, die von PIP3 oder neu polymerisiertem Aktin rekrutiert werden, beide eine hauptsächlich zytosolische Lokalisation in ruhenden Zellen.Nach fünf Sekunden Scherströmung lokalisierten sich diese Biosensoren schnell wieder in der Hirnrinde und kehrten zum Zytosol zurück. Die Wirkungen des Aktin-depolymerisierenden Medikaments Latrunculin A wurden mit einem ähnlichen Scherkraftexperiment getestet. In diesem Fall wurden vegetative Zellen zunächst Kontrollbedingungen ausgesetzt und dann auf den Puffer umgestellt, der das gewünschte Testmittel enthielt.Die Behandlung mit Latrunculin A blockierte die Relokalisation der Marker der Vorderkante in den Kortex. Interessanterweise wurde immer noch eine vorübergehende globale Reaktion beobachtet, wenn die Strömung nicht nach zwei Sekunden abgeschaltet wurde, sondern für die Dauer des Experiments eingeschaltet blieb. Nach der globalen Reaktion wanderten vegetative Zellen gegen den Strom.Die richtige Vorbereitung der Zellen ist für den Erfolg dieser Assays äußerst wichtig. Vegetative Zellen müssen in Verbindung mit Bakterien gezüchtet werden, um sicherzustellen, dass sie auf mechanische Stimulation reagieren. Bei aggregationskompetenten Zellen neigen Zellen, die entweder unter- oder überentwickelt sind, dazu, schlecht zu reagieren.Biochemische und mikroskopische Ansätze ergänzen sich gegenseitig, was es uns ermöglicht hat, eine große Anzahl von Signaltransduktions-Zwischenprodukten auf ihre Reaktion auf mechanische Stimulation zu untersuchen. Durch die Zugabe von pharmakologischen sowie genetischen Störungen können wir lernen, wie mechanische Reize wahrgenommen und weitergeleitet werden. Dies ist wichtig für das Verständnis der gerichteten Zellmigration, die durch physikalische Reize wie die Scherströmung gesteuert wird.Da die mechanische Stimulation die Aktivierung des gleichen Signaltransduktionsnetzwerks auslöst wie Chemolockstoffe, können wir nun die Integration verschiedener Reize auf Zellen untersuchen. Letztendlich werden uns diese Studien helfen zu verstehen, wie wandernde Zellen wie unsere eigenen Immunzellen und metastasierende Krebszellen durch den Körper navigieren.

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Research

Forschung

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