Verarbeitung von menschlichen Herzgewebe in Richtung extrazelluläre Matrix selbst Montage Hydrogel für In Vitro und In Vivo -Anwendungen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die kardiale extrazelluläre Matrix zu einem Hydrogel zu verarbeiten, das es ermöglicht, die Wirkung der Matrix in verschiedenen zellbasierten Assays zu untersuchen. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im kardiologischen Bereich zu beantworten, z. B. wie die extrazelluläre Matrix das Zellverhalten beeinflusst. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Verwendung der extrazellulären Matrix für groß angelegte Experimente in vitro oder in vivo erleichtert.

Die Anwendungen dieser Technik können auf eine Therapie des Myokardinfarkts ausgeweitet werden, da die Matrix wesentliche Überlebenshinweise liefern kann. Um das Experiment zu beginnen, verwenden Sie ein steriles Skalpell mit einer Klinge mit der Nummer zehn, um Fettgewebe aus einem zuvor gewonnenen linksventrikulären Myokard zu entfernen. Schneide das Myokard mit einem Skalpell in Würfel von etwa 1 x 1 x 1 cm.

Geben Sie dann die Würfel in ein steriles 50-ml-Röhrchen. Lagern Sie die Röhrchen mit den Würfeln bei 80 Grad Celsius. Nehmen Sie das Röhrchen mit den vorbereiteten Würfeln aus dem Gefrierschrank und transportieren Sie es auf Eis zum Kryostaten.

Stellen Sie die Objekt- und Kammertemperatur des Kryostaten auf 15 Grad Celsius ein. Leeren Sie 50-ml-Röhrchen und -Stempel in der Kammer. Geben Sie eine Schicht Kryosektionsmedium auf den Kaltstempel und lassen Sie ihn einfrieren, bis er weiß und fest ist.

Fügen Sie eine zweite Schicht Kryosektionsmedium hinzu und setzen Sie ein Myokardröhrchen in die zweite Schicht ein. Stellen Sie sicher, dass das Kryosektionsmedium und das Myokard vollständig gefroren sind. Setzen Sie dann den Stempel mit gefrorenem Myokard in die Halterung ein und ziehen Sie alle Schrauben fest.

Schneiden Sie die Oberfläche des Gewebes ab, bis eine gleichmäßige Schnittfläche entsteht. Schneiden Sie das gefrorene Myokard mit automatischer Schnitte, um gleichmäßige Schnitte zu gewährleisten. Aus einem Würfel können ca. 30 bis 40 Abschnitte geschnitten werden.

Legen Sie jede Scheibe nach dem Schneiden locker in ein vorgekühltes 50-ml-Röhrchen. Verschließen Sie die gefüllten Röhrchen und legen Sie sie auf Eis. Die gefrorenen Abschnitte aller 50-ml-Röhrchen werden in ein steriles Becherglas überführt.

Geben Sie 50 ml Lyselösung pro 50 ml-Röhrchen mit Myokardscheiben hinzu. Schütteln Sie anschließend die Myokardscheiben in einem sterilen Becherglas. Die Flüssigkeit mit den Gewebescheiben durch ein grobes Sieb abseihen.

Übertragen Sie dann die Gewebescheiben mit einer stumpfen Pinzette in ein neues steriles Becherglas. Fügen Sie 50 ml 0,5 % SDS in PBS pro anfänglichem 50-ml-Röhrchen Myokardscheiben hinzu. Schütteln Sie den Becher sechs Stunden lang kontinuierlich bei 100-150 U/min bei Raumtemperatur.

Nach dem Schütteln die Flüssigkeit mit den Gewebescheiben durch ein grobes Sieb abseihen. Übertragen Sie die Gewebescheiben mit einer stumpfen Pinzette in ein neues steriles Becherglas und waschen Sie die Scheiben dreimal mit 50 ml PBS. Als nächstes waschen Sie die Scheiben über Nacht in PBS mit 1 % Penicillin, Streptomycin und 1 % Nystatin.

Entfernen Sie am nächsten Tag die Waschlösung und fügen Sie 25 ml FBS, das bei 37 Grad Celsius mit 1 % Penicillin-Streptomycin und 1 % Nystatin vorgewärmt wurde, zu den dezellularisierten Scheiben pro anfänglichem 50-ml-Röhrchen Myokardscheiben hinzu. Inkubieren Sie die Scheiben drei Stunden lang bei 37 Grad Celsius, um die verbleibende DNA aus der Matrix zu entfernen. Übertragen Sie dann die Scheiben in ein neues steriles Becherglas und waschen Sie sie dreimal mit 50 mL PBS.

Legen Sie die ECM-Scheiben lose in eine neue sterile Sechs-Well-Platte. Frieren Sie die EZM bei 80 Grad Celsius ein und lyophilisieren Sie sie zwei Tage lang in einem Lyophilisationsgerät. Für die Pulverisierung der ECM-Scheibe werden Fräsrohre mit 1,4 mm Keramikkügelchen verwendet.

Füllen Sie die Röhrchen mit einer sterilen, stumpfen Pinzette locker mit lyophilisierter ECM. Frieren Sie die Röhrchen in flüssigem Stickstoff ein. Legen Sie die gefrorenen Rohre in die Fräsmaschine ein und pulverisieren Sie das ECM.

Stellen Sie die Dauer auf 30 Sekunden ein, passen Sie die maximale Geschwindigkeit an und starten Sie das Gerät. Nehmen Sie nach der Pulverisierung die Röhrchen heraus und frieren Sie sie erneut in flüssigem Stickstoff ein. Waschen Sie die Mikropartikel aus den Röhrchen, indem Sie 1 ml ddH20 pro Röhrchen hinzufügen, und schütteln Sie sie, um eine vollständige Solubilisierung zu erreichen.

Filtrieren Sie dann die heterogene Lösung durch ein 200-Mikrometer-Netz in ein 50-ml-Röhrchen. Frieren Sie das Rohr in flüssigem Stickstoff ein. Ersetzen Sie den Standarddeckel der Tube durch einen 0,22-Mikrometer-Filter, um zu verhindern, dass das Pulver aus der Tube fließt.

Führen Sie das Röhrchen in den Gefriertrockner ein und lyophilisieren Sie erneut, um das Wasser aus dem Waschschritt zu entfernen. Das zuvor hergestellte lyophilisierte humane ECM-Pulver wird in Pepsinlösung auf eine Endkonzentration von 10 mg pro ml aufgelöst. Übertragen Sie die Lösung in 2 ml-Röhrchen mit einem Volumen von 1 ml pro Röhrchen.

Pipettieren Sie die Lösung, um sie gründlich zu mischen. Legen Sie dann die Röhrchen in den Shaker und schütteln Sie sie 48 Stunden lang bei 1200 U/min bei 27 Grad Celsius. Nehmen Sie die Röhrchen aus dem Shaker und legen Sie sie auf Eis oder einen vorgekühlten Röhrchenhalter.

Mischen Sie 1/9 des Volumens der EZM-Lösung von kaltem 10X PBS mit 1/10 des Volumens einer EZM-Lösung von kaltem 0,1 molaren Natriumhydroxid in einem vorgekühlten Röhrchen und legen Sie es auf Eis, um die aufgeschlossene EZM-Lösung zu neutralisieren und das Pepsin zu inaktivieren. Zum Schluss die ECM-Lösung zur Neutralisationsmischung geben und durch Pipettieren oder Vortexen gründlich mischen. Quantitative Assays für einzelne EZM-Komponenten zeigten eine vollständigere DNA-Entfernung und eine bessere Konservierung von Gesamtkollagen, Elastin und Glykosominoglykanen im Vergleich zur Dezellularisierung durch SDS allein.

Die RT-PCR wurde verwendet, um die Expression von strukturellen Kardiomyozit-Proteinen, frühen und späten kardiomyogenen Transkriptionsfaktoren und Oberflächenmarkergenen von Endothelzellen in der Maus-ESC zu quantifizieren, die eine spontane Differenzierung durchliefen. Der Kontakt mit cECM treibt pluripotente Stammzellen an, vorzugsweise in Richtung eines Kardiomyozit-ähnlichen Phänotyps. Die Phasenkontrastlichtmikroskopie zeigt, dass der enzymatische Verdau der cECM über 48 Stunden zu einer homogeneren ECM-Lösung führt.

Die Lebend/Tot-Färbung von humanen kardialen Fibroblasten auf cECM-Hydrogel zeigt eine erhöhte Lebensfähigkeit. Sowohl cECM-Mikropartikel als auch cECM-Hydrogel verbessern die metabolische Aktivität von kontraktilen HL-1-Zellen unter ischämischen Bedingungen im Vergleich zu Zellen in Standardkulturen. Sobald diese Technik gemeistert ist, kann sie innerhalb einer Woche vom Gewebe bis zum Hydrogel durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der kardialen Regeneration, um die Auswirkungen der kardialen extrazellulären Matrix in In-vitro- und In-vivo-Modellsystemen zu erforschen.