Name: Megakaryocyte Differenzierung und Thrombozyten-Formation von Human Cord Blood abgeleitet CD34 Zellen+ (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: Lernen Sie die Isolierung von CD34+ Zellen aus Nabelschnurblut zur Untersuchung der Megakaryozyten-Differenzierung und Thrombozytenbildung. Diese Methode ermöglicht zuverlässige Ergebnisse in der Hämatologie.

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Die Autoren erkennen die Unterstützung des australischen Gesundheits- und Medical Research Council (Projekt Grant 1012409 verbunden mit BHC).

Dieses Protokoll wurde von der South Eastern Sydney menschliche Forschungsethikkommission genehmigt und von der University of New South.Wales menschliche Forschungsethikkommission ratifiziert. Nabelschnurblut aus gesunden Spendern gewonnen wurde durch die Sydney Nabelschnurblutbank (Sydney, New South Wales, Australien) zur Verfügung gestellt. Volumen von ca. 100 mL wurden für dieses Verfahren verwendet.
Hinweis: In einer Klasse II Biosicherheit Schrank mit aseptischen Technik arbeiten. Das äußere des Kabel-Blutbeutel mit 70 % Ethanol zu dekontaminieren. Sterile Instrumente (Schere, Pinzette) für dieses Verfahren zu verwenden.
1. Schnur Blutkörperchen Vorbereitung und Isolierung von CD34 Zellen+
<ol>
	<li>Bereiten Sie sterile Trennung Puffer (SB) mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS), bei pH 7,2 und mit 0,5 % bovine Serum Albumin und 2 mM EDTA.</li>
	<li>10 mL SB in ein 50 mL konische Röhrchen (eine Röhre pro 10 mL Blut ist erforderlich) zu verzichten. Mit Hilfe einer G18 stumpfen Nadel montiert auf einer 10 mL Spritze, 10 mL Blut aus der Tasche ziehen und in der 50 mL Röhrchen mit 10 mL SB zu verzichten.</li>
	<li>Hinzugeben Sie 15 mL Lymphozyten Trennung Medien (siehe Tabelle der Materialien) an der Unterseite des Rohres, enthält das verdünnte Blut, zwei Schichten. Hinweis: Verzichten Sie Medien langsam an der Unterseite des Rohres zu vermeiden, mischen die verschiedenen Schichten.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie Rohre bei 1.200 × g für 30 min bei Raumtemperatur (RT) mit keinen Bruch und keine Beschleunigung.</li>
	<li>Übertragen Sie die Schicht nahe der Mitte des Rohres mit mononukleären Zellen (ca. 5-10 mL aus jeder Tube) in eine neue 50 mL-Tube mit einer Pasteurpipette. Jedes Rohr auf ein Gesamtvolumen von 50 mL SB hinzufügen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie bei 400 × g für 10 min bei RT. verwerfen des Überstands.</li>
	<li>Aufschwemmen Sie Zelle Pellets sorgfältig mit einer Pasteurpipette in 5-10 mL GBL kombinieren die suspendierten Zellen und bringen Sie Volumen 50 mL mit SB.</li>
	<li>Anzahl Zellen verwenden Trypan blau Färbung und eine Hemocytometer oder automatisierte Zelle entgegen (siehe Tabelle der Materialien). Den Anteil der CD34 bestimmen Zellen+ in der Probe, Aufschwemmen 2,5 × 105 Zellen in 100 µL der SB und Fleck durch Zugabe von 10 µL Anti-CD34-PE Antikörper für 15-30 min bei 4 ° C. Analysieren von Durchflusszytometrie (Abbildung 1A).</li>
	<li>Zentrifuge Rohre bei 400 × g für 10 min bei 4 ° C. Verwerfen Sie überstand. Hinweis: Wenn Sie nicht sofort benötigt, können Mononukleäre Zellen zu diesem Zeitpunkt eingefroren werden.</li>
	<li>Aufschwemmen Sie Zellen in 300 µL der SB pro 108 Zellen. Hinzufügen von 100 µL der FcR menschliche IgG (blocking Reagenz, siehe Tabelle of Materials) und 100 µL CD34 magnetische Beads pro 108 Zellen. Vorsichtig mischen und bei 4 ° C für 30-40 min inkubieren. Hinweis: Eine einzelne Zelle Suspension ist erforderlich (wenn notwendig, übergeben den Zellen aber 30 µm Filter vor der Zugabe von Reagenzien). Verwenden Sie die Reagenz Bände hier beschrieben für 108 Zellen oder weniger. Für mehr als 108 Zellen, die Reagenzien (SB, blockiert Lösung und CD34 magnetische Beads) werden entsprechend skaliert.</li>
	<li>Bereiten Sie LS-Trennsäule während der Inkubationszeit, indem man die LS-Spalte in einem Magnethalter und waschen mit 3 mL GBL verwerfen das Abwasser. Hinweis: LS Trennsäulen können mit bis zu 2 × 108 total Zellen geladen werden. Kleinere und größere Spalten stehen zur Verfügung.</li>
	<li>Die Zelle Mischung 5-10 mL SB hinzu und Zentrifuge bei 400 × g für 10 min. Überstands verwerfen.</li>
	<li>Aufschwemmen Sie Zellen in 1,5 mL SB und laden Sie die Zellsuspension (1,5 mL) auf die LS-Säule. Sammeln Sie die Strömung durch die unbeschriftete Zellen in einem 15 mL Sammelrohr (negative Bruch #1). Lassen Sie die Flüssigkeit abtropfen und waschen Sie die Spalte mit 1,5 mL SB.</li>
	<li>Die gesammelten Lastfluss durch (3 mL) wieder in die Spalte und die Durchströmung in dem gleichen 15 mL Sammelrohr (negative Bruch #1) sammeln. Waschen Sie die LS-Spalte 3 Mal mit 3 mL SB. Hinweis: Bei Bedarf Zellen in den negativen Anteil (12 mL) können auch gebeizt mit Anti-CD34-Antikörper zu prüfen, Erfassung von CD34+ Zellen, die Spalte "LS".</li>
	<li>Entfernen Sie Spalte aus der Magnetabscheider und leeren Sie Zellen mit einem Spritzenkolben langsam in ein neues 15 mL Röhrchen mit 2 mL SB.</li>
	<li>Setzen Sie Spalte wieder auf Magnetabscheider und laden die 2 mL der Zellen in der Spalte. Die Durchströmung zu sammeln und mit 2 mL SB waschen. Dies ist der negative Teil #2 (4 mL).</li>
	<li>Magnetabscheider LS Spalte entfernen und 2 mL SB Flush Zellen stetig und fest mit einem Spritzenkolben die CD34 sammeln+ Zelle Bruchteil. Zählen Sie die Zellen mit Trypan blau Färbung und einem Hemocytometer oder automatisierte Zelle Zähler.</li>
	<li>Zentrifugenröhrchen mit dem positiven Bruch bei 400 × g für 15 min bei 4 ° C. Verwerfen Sie den überstand. Zellen in serumfreien Medien für CD34 Aufschwemmen+ Zellen (SFM, siehe Tabelle der Materialien). Hinweis: Wenn Sie nicht sofort benötigt, können Zellen in flüssigem Stickstoff zu diesem Zeitpunkt eingefroren werden.</li>
</ol>
(2) Reinheit Check von isolierten CD34 Zellen+
<ol>
	<li>2 x 104 Zellen aus der positiven Fraktion mit 10 µL Anti-CD34-PE Antikörper und 20 µL Anti-CD45-PerCP Antikörper für 15 min bei 4 ° C (Verwendung eine separaten tube für Isotype Steuerelemente) färben (Abbildung 1 b).</li>
	<li>Fügen Sie 1 mL SB zu waschen. Zentrifugieren Sie bei 400 × g für 10 min. Aufschwemmen Pellet in 200 µL des SB.</li>
	<li>Durchflusszytometrischen Analyse durchführen und Tor live Zellpopulation Schutt (Abbildung 1 b) auszuschließen. Das Tor für PE und PerCP positive Populationen mit Steuerelementen für PE und PerCP Isotype (Abbildung 1 b) und bestimmen den Prozentsatz der CD34+/CD45+ Zellen.</li>
</ol>
(3) Megakaryocyte Differenzierung
<ol>
	<li>Samen 5 × 105 Zellen/mL CD34+ Zellen in 2 mL SFM pro Bohrloch in einer 12-Well-Platte mit 50 ng/mL rekombinanten menschlichen Thrombopoetin (RhTPO) ergänzt. Inkubieren Sie Zellen bei 37 ° C, 5 % CO2 in eine feuchte Atmosphäre. Wenn Zellen konfluierende sind, bevor sie für die Analyse erforderlich sind, die Zellen zu ernten und in mehrere Brunnen mit frischem Medien- und RhTPO aufgeteilt. Hinweis: Zwei oder drei Brunnen sollte bereit sein, speziell, Differenzierung zu verschiedenen Zeitpunkten (z.B. Tage 7, 9 und 10) zu überwachen.</li>
	<li>Ernten Sie Zellen aus den Brunnen beiseite stellen und Differenzierung zu überwachen, ohne die Zellen in den anderen Brunnen zu stören.</li>
	<li>Fleck-Zellen mit 20 µL Anti-GPIIb/CD41-FITC Antikörper und 10 µL Anti-GPIX/CD42a-Alexa Fluor 647 Antikörper in einem Endvolumen von 100 µL. richten Sie ein Steuerelement Rohr mit den jeweiligen Isotype Kontrolle Antikörper. 15-30 min bei 4 ° c inkubieren</li>
	<li>Fügen Sie 1 mL SB zu waschen.</li></ol>Zentrifugieren bei 400 × g für 10 min. überstand verwerfen und das Pellet in 200-300 µL SB Analyze durch Durchflusszytometrie aufzuwirbeln.
	<li>Analysieren Sie für jede Fluorophor die Isotype-Steuerelemente legen die Anspritzung FITC und Alexa Mehl 647 positiven Bevölkerung. Analysieren Sie die gefärbten Zellproben um den Prozentsatz der CD41 bestimmen+/CD42a+ doppelt positiven Zellen, die Reife MK (Abbildung 1) darstellen.</li>
	<li>Für mikroskopische Darstellung der Zelle färben Oberflächenmarker Zellen wie in 3.3 beschrieben.<ol>
		<li>Fügen Sie 1 mL SB zu waschen. Zentrifuge bei 400 × g für 10 min. Aufschwemmen das Pellet in 100 µL der SB und Spin auf einem Objektträger bei 1.000 x g für 5 min. Fix Zellen auf der Folie durch Eintauchen in Methanol für 30 S. lufttrocknen hinzufügen 20 µL Medium mit DAPI zu montieren (siehe Tabelle der Materialien) , mit einem Deckglas abdecken und visualisieren mit einem fluoreszierenden Mikroskop (Abb. 2A).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zur Visualisierung der intrazellulären Antigene Aufschwemmen Zellen mit PBS-Puffer und fixieren mit Paraformaldehyd (1 % Endkonzentration) für 15 min bei Raumtemperatur. Um die Zellen permeabilize, fügen Sie Triton-X 100 (0,1 %) und inkubieren Sie für 15 min. Waschen Zellen mit 2 mL PBS/0.1% Triton-X 100. Aufschwemmen in 100 µL der PBS/0.1% Triton-X 100, anti-vWf und Anti CD62p Antikörper (Verdünnung 1: 200) hinzufügen und 30 min bei Raumtemperatur inkubieren.<ol>
		<li>Waschen mit 2 mL PBS/0.1% Triton-X 100 und 400 × g für 10 min Zentrifugieren, in 100 µL des gleichen Puffers Aufschwemmen und Anti-Maus IgG-Alexa 594 und Anti-Kaninchen IgG-Alexa 488 (1: 100) hinzufügen. 30 min bei Raumtemperatur inkubieren, waschen mit 2 mL PBS/0.1% Triton-X 100 in 100 µL des gleichen Puffers Aufschwemmen und fügen Sie 20 µL anti-CD42b-APC. Dann drehen Sie die Zellen auf Glas-Objektträger zu, wie in Schritt 3.6.1 beschrieben und bereiten Sie Proben für mikroskopische Visualisierung vor, wie in Schritt 3.6.1 beschrieben.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zur Bestimmung der Diploidie ernten Sie Zellen am Tage 12 oder 13 der Differenzierung. Fügen Sie 1 mL SB zu waschen. Zentrifuge bei 400 × g für 10 min und Fleck mit 20 µL Anti-GPIIb/CD41-FITC Antikörper in einem Endvolumen von 100 µL. bei 4 ° C für 30 min inkubieren.<ol>
		<li>Einmal mit 1 mL SB waschen und Aufschwemmen Pellet in 300 µL hypotone Citrat-Puffer (1,25 mM Natriumcitrat, Natriumchlorid 2,5 mM, 3,5 mM Traubenzucker) mit 20 µg/ml Propidium Jodid und 0,05 % Triton X-100. Inkubieren Sie für 15 min bei 4 ° C, vor Licht geschützt werden.</li>
		<li>Hinzu kommt eine Endkonzentration von 20 µg/mL RNase und inkubieren Sie für 30 min bei 4 ° C, vor Licht geschützt. Bestimmen Sie die Intensität der Propidium Jodid durch Durchflusszytometrie, durch das Sammeln von 30.000 bis 50.000 Veranstaltungen der Bevölkerung CD41-FITC+ (Abbildung 2).</li>
	</ol>
	</li>

4. proplatelet zählen, Thrombozyten-Enumeration und Thrombozyten Aktivierung
<ol>
	<li>Ernten Sie Zellen (aus Schritt 3.1) Tage 8 oder 9 von Differenzierung und Saatgut an 1 × 104 Zellen/Brunnen in 48-Well-Platten in 200 µL des frischen SFM mit 50 ng/mL RhTPO ergänzt. Kultur für 5 Tage bei 37 ° C, 5 % CO2. Hinweis: Quantifizierung Zwecken Samen Sie Brunnen in dreifacher Ausfertigung. Diese geringe Dichte ist erforderlich für die Visualisierung und Zählung des proplatelet-Lagers MK Proplatelets in der Regel starten, erscheinen nach 2 Tagen der Kultur. Der Höhepunkt ist zwischen 4 und 5 Tage.</li>
	<li>Die Anzahl der proplatelet tragenden MK in der ganze Brunnen auf einem inversen Licht Mikroskop mit 10 X oder 20 X Ziele. Hinweis: Ein beheiztes (37 ° C) Mikroskoptisch ist vorzuziehen, da halten die Zellen bei Raumtemperatur über einen längeren Zeitraum bewirkt, Schrumpfung der proplatelet Erweiterungen dass. Proplatelets sind als lange Erweiterungen aus dem MK-Körper beobachtet. Jeder MK möglicherweise mehrere proplatelet Vorsprünge. Als Proplatelets zu entwickeln, sinkt der Körper des MK in der Größe.</li>
	<li>Zellen zu ernten und Zentrifugieren bei 400 X g für 10 min bei Raumtemperatur. Färben Sie Zellen mit 20 µL Anti-Human CD41-FITC Antikörper, wie in 3.3 und 3.4 beschrieben. Berechnung des Prozentsatzes der proplatelet tragenden MK (PbMK): PbMK (%) = [(Proplatelet-Lager MKs/gut) / (Total CD41+ Zellen / gut)] X 100</li>
	<li>Plättchen in das Kulturmedium abgegeben zu zählen, sanft mischen Sie die Zellen mit einer Pasteurpipette und sammeln Sie 100 µL Tage 14 oder 15 Kultur.<ol>
		<li>Färben Sie mit 20 µL Anti-Human CD41-FITC Antikörper für 20-30 min bei 4 ° C. Richten Sie ein Steuerrohr mit der jeweiligen Isotype Kontrolle Antikörper.</li>
		<li>Fügen Sie SB 150 µL und 50 µL Perlen zu zählen.</li>
		<li>Stellen Sie für durchflusszytometrischen Analyse FSC und SSC Skala anmelden. Einsatz normaler menschlicher Blutplättchen von Platelet-Rich Plasma mit CD41-FITC befleckt, wie beschrieben in Abschnitt 4.4.1 festzulegende gating für Thrombozyten (Abb. 3A).</li>
		<li>Analysieren Sie die gefärbten Plättchen mit Perlen von Durchflusszytometrie zählen. Sammeln Sie 1.000 Veranstaltungen zählen Perlen mit der FSC gegen SSC Streudiagramm (Abb. 3A). Berechnen Sie die Anzahl der Thrombozyten basierend auf CD41-FITC positive Ereignisse (Abb. 3 b) mit der Formel: Thrombozyten pro Mikroliter = [(Anzahl positiver Ereignisse CD41-FITC)/1,000 beads)] x [(number of beads in 50 µL)/sample Volume)]</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Um Thrombozyten Aktivierung zu analysieren, vorsichtig mischen Sie die Zellen mit einer Pasteurpipette und sammeln Sie 100 µL Tage 14 oder 15 Kultur. Fügen Sie 1 mL Tyrode Puffer (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1,8 mM CaCl2, 0,2 mM Na2HPO4, 12 mM Nahco33, 5,5 mM D-Glucose, pH 6,5) und Zentrifuge bei 200 X g für 5 min zum pellet-Zellen.<ol>
		<li>Sammeln Sie die überstand und Zentrifuge bei 800 X g für 10 min bis zum pellet-Thrombozyten-Partikel.</li>
		<li>Überstand verwerfen und in 100 µL Tyrode Puffer aufzuwirbeln. Hinzufügen einer Endkonzentration von 20 µM. 20 µL PAC1-FITC Antikörper und Adenosin-diphosphat (ADP) Inkubation bei Raumtemperatur für 20 min. Analyze durch Durchflusszytometrie den Anteil positiver Ereignisse FITC bestimmen. Verwenden Sie frische menschlichen Thrombozyten auf die gleiche Weise als Positivkontrolle (Abbildung 3) behandelt.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Das hier beschriebene Protokoll eignet sich für konsequente Produktion von MK und Thrombozyten in Kultur aus Nabelschnurblut. Diese Zellen können verwendet werden, um verschiedene Prozesse wie die Wirkung von Drogen oder biologischen Aktivitäten auf MK-Proliferation, Differenzierung, proplatelet Bildung und Produktion der Thrombozyten zu studieren.
Eine Vielzahl von Kultur, Medien und Zytokin-Kombinationen sind in der Literatur vorgestellt worden. Addition von Zytokinen wie Stammzellen Faktor,...

Isolierung von ausreichender Anzahl der primären menschlichen Megakaryozyten (MK) für regelmäßige Laboreinsatz ist nicht möglich aufgrund ihrer niedrigen Frequenz im Knochenmark, wo sie ~0.01% von kernhaltigen Zellen1entfallen. Eine bequeme Alternative ist die ex-Vivo -Erweiterung und Differenzierung von hämatopoetischen Stammzellen und Vorläuferzellen in Anwesenheit von bestimmten Wachstumsfaktoren. Eine Reihe von Zytokinen einschließlich Stammzell-Faktor (SCF; c-Kit-Ligand) und Interleukin (IL)-3 und IL-11 wurden ist in Kultur-Systeme eingesetzt, um MKs Thrombopoietin (TPO) produzieren der effektivste Wachstum und Differenzierung Faktor für Megakaryopoese Kulturen und ist effektiv, allein oder mit anderen Zytokinen, z. B. SCF und IL-3-2. TPO wirken auf Stammzell-Populationen, die Verbreitung und die Reifung der MKs2führen.
MK produzieren Thrombozyten aus zytoplasmatischen Vorsprünge genannt Proplatelets und in-vivo, ca. 1 x 1011 Thrombozyten sind entsteht täglich um Thrombozytenwerte von 150-400 x 109/L. Thrombozyten Produktion in Vitro aufrecht zu erhalten bis zu 1000 -Falten Sie niedriger als die in Vivo 3 schätzt, und dies hat Anlass zu zahlreichen Kulturbedingungen CD34 mit+ hämatopoetischen Vorläuferzellen, MK und Thrombozyten Produktion in Vitrozu verbessern. Die ursprüngliche Quelle der CD34+ für MK Differenzierung verwendete Zellen war menschlichen peripheren Blut4. Andere Zelle Quellen schließen Knochenmark5,6, embryonale Stammzellen/induzierte pluripotente Stammzellen (ESC/iPSC)7und Nabelschnur Blut (UCB)8,9,10 . Menschlichen Knochenmark CD34+ 11 und Maus Linie negative Knochenmark Zellen5 produzieren MK und Blutplättchen in Vitro; Dennoch, die mangelnde Verfügbarkeit von menschlichen Knochenmark schränkt seine Verwendung als eine Quelle von CD34+ Zellen. Im Gegensatz dazu stehen für ESC und iPSC eine unbegrenzte Quelle von Zellen für in-vitro- Thrombozyten-Produktion. Thrombozyten-Produktion aus diesen Zellen erfordert Feeder-Zellen wie murinen OP9 Zellen und längere Kultur. Thrombozyten im Feeder-freien Bedingungen abgeleitet scheinen weniger funktional12sein. iPSC-abgeleitete Plättchen werden voraussichtlich von Einsatz in klinischen Einrichtungen sein, da sie auf einer großen Skala erweitert werden können. Dieser Prozess erfordert Lentivirale vermittelte Transduktion von Transkriptionsfaktoren und langfristige Zelle Kultur13.
UCB ist eine zugängliche Quelle von CD34+ Zellen, die leicht einsetzbare Forschung Einstellungen. TPO allein kann Förderung der Differenzierung der Schnur Blut stammenden CD34+ Zellen, und dies gibt Anlass zu hochreinen, Reife MKs ohne die Notwendigkeit für Serum-Supplementierung oder Kokultur mit Feeder-Zellen. Andere Zytokine wie z. B. SCF Differenzierung von UCB CD34 verringern kann+ Zellen, während Flt-3 Ligand und IL-11 die Produktion von unreifen Megakaryozyten14 fördern. Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung von hochreinen MK Kulturen aus Nabelschnurblut CD34+ Zellen in serumfreien Bedingungen.

<table><tbody><tr><td>Cell Culture Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rekombinantes humanes TPO</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-013</td><td></td></tr><tr><td>StemSpan SFEM II</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>9605</td><td>Serumfreie Medien für CD34</td></tr><tr><td>+ ZellenName</strong</td><td>>><Company</td><td>Katalognummer</td><td>Comments</td></tr><tr><td>CD34 Isolation Reagenzien</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD34 MicroBead Kit ultrapure</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-100-453</td><td>Dieses Kit enthält das FcR humane IgG-blockierende Reagenz und CD34 Mikrobeads. Diese Kügelchen enthalten den Anti-CD34-Antikörperklon QBEND/10. Verwenden Sie für die Reinheitsprüfung einen anderen Anti-CD34-Klon (z. B. Klon 8G12).</td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>Alere Technologies</td><td>1114545</td><td>Lymphozyten-Trennmedium (Dichte 1,077 g/ml)</td></tr><tr><td>Steriler Trennpuffer (SB)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-221</td><td>Dieser Puffer enthält phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit einem pH-Wert von 7,2 und 0,5 % Rinderserumalbumin und 2 mM EDTA. Es kann mit sterilen Komponenten in Zellkulturqualität hergestellt werden. Entgasen Sie vor dem Gebrauch, da Luftblasen die Säule verstopfen können.</td></tr><tr><td>Name</td><td>Unternehmen</td><td>Katalognummer<</td><td>strong>Kommentare</td></tr><tr><td>Durchflusszytometrie und Zellfärbereagenzien</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PE Maus Anti-Human CD34</td><td>BD Biosciences</td><td>340669</td><td>Klon 8G12. Dies kann für die CD34-Reinheitsprüfung verwendet werden. Endgültige Antikörperkonzentration 1:10 Verdünnung.</td></tr><tr><td>PerCP Maus Anti-Human-CD45</td><td>BD Biosciences</td><td>347464</td><td>1:10 Verdünnung</td></tr><tr><td>PerCP Isotypkontrolle</td><td>BD Biosciences</td><td>349044</td><td>1:10 Verdünnung</td></tr><tr><td>FITC Maus Anti-Human-CD41a</td><td>BD Biosciences</td><td>340929</td><td>Endgültige Antikörperkonzentration 1:5 Verdünnung.</td></tr><tr><td>APC Maus Anti-Human-CD42b</td><td>BD Biosciences</td><td>551061</td><td>Dieser Antikörper kann auch zum Nachweis von reifem MK verwendet werden (der Prozentsatz positiver Zellen ist in der Regel geringer als bei Anti-CD42a). Endgültige Antikörperkonzentration 1:10 Verdünnung.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Maus anti-human CD42a</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA1227A647T</td><td>Derzeit vertrieben von Bio-Rad. Endgültige Antikörperkonzentration 1:10 Verdünnung.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Maus Negative Kontrolle</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA928A647</td><td>Derzeit vertrieben von Bio-Rad. Isotyp-Kontroll-Antikörper</td></tr><tr><td>Anti-von-Willebrand-Faktor Kaninchen polyklonal</td><td>Abcam</td><td>AB6994</td><td>1:200 Verdünnung</td></tr><tr><td>V450 Maus Anti-Humna CD41a</td><td>BD Biosciences</td><td>58425</td><td>1:20 Verdünnung</td></tr><tr><td>V450 Isotypkontrolle</td><td>BD Biosciences</td><td>580373</td><td>1:20 Verdünnung</td></tr><tr><td>PAC1-FITC Antikörper</td><td>BD Biosciences</td><td>340507</td><td>1:10 Verdünnung</td></tr><tr><td>Anti-CD62p Maus monoklonales</td><td>Abcam</td><td>AB6632</td><td>1:200 Verdünnung</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Ziege Anti Kaninchen IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td>1:100 Verdünnung</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Ziege Anti Maus IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A11020</td><td>1:100 Verdünnung</td></tr><tr><td>Ig Isotyp Kontrolle Cocktail-C</td><td>BD Biosciences</td><td>558659</td><td>Isotyp Kontrolle</td></tr><tr><td>Antikörper Propidium iodid Sigma</td><td>Aldrich</td><td>P4864</td><td></td></tr><tr><td>CountBright Absolute Counting Beads</td><td>Molecular Sonden, Invitrogen</td><td>C36950</td><td>Zählperlen</td></tr><tr><td>Name<</td><td>strong>Company</td><td>Katalognummer</td><td><>Kommentare</td></tr><tr><td>Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LS Säulen</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>Kleinere und größere Säulen sind auch im Handel erhältlich</td></tr><tr><td>MidiMACS Separatormagnet</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 5 ml FACS-Röhrchen aus Polypropylen mit rundem Boden, mit Schnappverschluss, sterile</td><td>In-vitro-Technologien</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Glasobjektträger</td><td>Menzel-Glaser</td><td>J3800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Eindeckmittel mit DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td>Eindeckmittel mit DAPI</td></tr><<tr><td>strong>Name</td><td>Company</td><td>Katalognummer</td><td><>Kommentare</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inverses Mikroskop</td><td>Leica</td><td>DMIRB Inverses Mikroskop</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenzmikroskop</td><td>Zeiss</td><td>Vert.A1</td><td></td></tr><tr><td>Zellanalysator</td><td>BD Biosciences</td><td>FACS Canto II</td><td></td></tr><tr><td>Cytospin Zentrifuge</td><td>ThermoScientific</td><td>Cytospin 4</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalog Anzahl</td><td>Kommentare</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zellanalysesoftware</td><td>BD Biosciences</td><td>FACS Diva Software</td><td></td></tr><tr><td>Einzelzellanalyse-Software</td><td>Tree Star</td><td>FlowJo</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenzmikroskop-Software</td><td>Zeiss</td><td>Zen 2 blue edition</td><td></td></tr></tbody></table>

megakaryocyte differenzierung und thrombozyten-formation von human cord blood abgeleitet cd34 zellen+

Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells

Thrombozyten-Produktion erfolgt hauptsächlich im Knochenmark in einem Prozeß bekannt als Thrombopoiesis. Während Thrombopoiesis differenzieren hämatopoetischen Vorläuferzellen zu Form Thrombozyten Vorläufern genannt Megakaryozyten, die unheilbar unterscheiden, Thrombozyten aus langen zytoplasmatischen Prozesse bezeichnet Proplatelets freizugeben. Megakaryozyten sind seltene Zellen beschränkt sich auf das Knochenmark und sind daher schwer zu ernten, in ausreichender Zahl für den Laboreinsatz. Effiziente Produktion von menschlichen Megakaryozyten kann erreicht in Vitro durch Kultivierung CD34+ Zellen unter geeigneten Bedingungen. Das Protokoll hier detailliert beschreibt Isolierung von CD34+ Zellen durch magnetische Zellen aus Nabelschnurblut Blutproben sortieren. Die notwendigen Schritte um hochreines, Reifen Megakaryozyten serumfreien Bedingungen zu produzieren sind beschrieben. Details der phänotypische Analyse der Megakaryocyte Differenzierung und Bestimmung der proplatelet Bildung und Thrombozyten sind ebenfalls vorhanden. Effektoren, die Megakaryocyte Differenzierung und/oder proplatelet Bildung, wie z. B. Anti-Thrombozyten-Antikörper oder Thrombopoietin Mimetika beeinflussen können hinzugefügt werden kultivierten Zellen, biologische Funktion zu prüfen.

Dieses Protokoll ermöglicht die Zubereitung von MK hoch Reinkulturen von Schnur Blut stammenden CD34+ Zellen. Der Anteil der CD34+ Zellen in Schnur Blut ist etwa 1,3 %15 (Abbildung 1A) und die Gesamtzahl der mononukleären Zellen (Schritt 1,8) reicht von 90-300 x 106 Stück UCB. Die Reinheit von CD34 + / CD45 + Zellen nach Isolierung reicht von 90 bis 99 % (Abbildung 1 b). MK...

Eine hochreine Bevölkerung von Megakaryozyten erhalten Sie bei Kabel Blut stammenden CD34+ Zellen. Eine Methode für die CD34+ Isolation und Megakaryocyte Zelldifferenzierung wird hier beschrieben.

Megakaryocyte Differenzierung und Thrombozyten-Formation von Human Cord Blood abgeleitet CD34 Zellen+

Platelet production occurs principally in the bone marrow in a process known as thrombopoiesis. During thrombopoiesis, hematopoietic progenitor cells ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, menschliche Nabelschnurblutproben zu verwenden, um reine CD34-positive Zellen zu isolieren und die Auswirkungen bestimmter Arzneimittel von Interesse auf die Differenzierung von Megakaryozyten, die Thrombozytenbildung und die Thrombozytenproduktion zu untersuchen. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen zum Megakaryozyten- und Thrombozytenfeld zu beantworten, z. B. welche Auswirkungen eine bestimmte Behandlung auf die Differenzierung von Megakaryozyten sowie die Thrombozytenproduktion und -funktion hat. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine Methode zur konsistenten Isolierung lebensfähiger CD34-positiver Zellen aus frischem Nabelschnurblut bietet.Durch diese Methode können Einblicke in die Megakaryopoese gegeben werden, können auch andere Zelltypen wie Lymphozyten, Erythrozyten und Makrophagen untersucht werden. Beginnen Sie mit der Zugabe von 10 Millilitern Trennpuffer in ein konisches 150-Milliliter-Röhrchen pro 10 Milliliter Nabelschnurblut. Mit einer stumpfen 18-Gauge-Nadel, die auf einer 10-Milliliter-Spritze montiert ist, werden 10 Milliliter Blut in jedes Röhrchen überführt, gefolgt von der Zugabe von

megakaryocyte-differentiation-platelet-formation-from-human-cord

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Dieses Video zeigt eine Technik zur Differenzierung von Megakaryozyten und zur Bildung von Blutplättchen. Hämatopoetische Stammvorläuferzellen – isoliert aus menschlichem Nabelschnurblut – differenzieren sich in Gegenwart von Thrombopoietin zu reifen Megakaryozyten. Die reifen Megakaryozyten produzieren zytoplasmatische Fortsätze, die als Proplättchen bezeichnet werden und aus denen einzelne Blutplättchen hervorgehen.

Eine in vitro Methode zur Differenzierung von Megakaryozyten und zur Thrombozytenbildung

Hier präsentieren wir menschlicher pluripotenter Stammzellen (hPSC) Kultur Protokolle verwendet, um hPSCs in CD34 unterscheiden+ hämatopoetischen Vorläuferzellen. Diese Methode nutzt Bühne-spezifische Manipulation von kanonischer WNT signalisieren Zellen ausschließlich entweder die definitive oder primitive hämatopoetischen Programm angeben.

Differenzierung der Primitive und Definitive hämatopoetischen Vorläuferzellen aus menschlichen pluripotente Stammzellen gerichtet

Hier stellen wir ein Protokoll zur immunphenotypischen Charakterisierung und Zytokin-induzierten Differenzierung von Nabelschnurblut abgeleitet CD34+ hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen zu den vier myeloischen Linien vor. Die Anwendungen dieses Protokolls umfassen Untersuchungen über die Wirkung von myeloischen Krankheitsmutationen oder kleinen Molekülen auf die myeloische Differenzierung der CD34+ Zellen.

Panmyeloische Differenzierung von humanem Cordblood abgeleitet CD34+ hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen

Diese Methode beschreibt die durch Durchflusszytometrie gereinigte Reinigung von MEP und MKp von Mäuse femuren, Tibias und Beckenknochen.

Isolierung von Maus-Megakaryozyten-Vorläufern

Dieses Protokoll beschreibt detailliert alle Schritte zur Gewinnung von Leukofilter-abgeleiteten CD34+ hämatopoetischen Vorläufern und deren In-vitro-Differenzierung und Reifung zu proplatlettragenden Megakaryozyten, die in der Lage sind, Blutplättchen im Kulturmedium freizusetzen. Dieses Verfahren ist nützlich für die eingehende Analyse zellulärer und molekularer Mechanismen, die die Megakaryopoese kontrollieren.

Leukodepletion Filter-abgeleitete CD34+ Zellen als Zellquelle zur Untersuchung der Megakaryozytendifferenzierung und Thrombozytenbildung

Hier stellen wir eine Immunphänotypisierungsstrategie zur Charakterisierung der Megakaryozytendifferenzierung vor und zeigen, wie diese Strategie die Sortierung von Megakaryozyten in verschiedenen Stadien mit einem fluoreszenzaktivierten Zellsortierer ermöglicht. Die Methodik kann auf menschliche Primärgewebe, aber auch auf Megakaryozyten angewendet werden, die in Kultur in vitroerzeugt werden.

Immunphänotypisierung und Zellsortierung von humanen MKs aus menschlichen Primärquellen oder differenziert in vitro von hämatopoetischen Vorläufern

Die Modellierung der Erythropoese bietet eine wertvolle Möglichkeit, die biologische Bedeutung der Akteure in diesem Prozess zu verstehen und neue therapeutische Ansätze zu evaluieren, die Differenzierungsdefekte lindern können. Hier beschreiben wir eine einfache und zuverlässige Methode, um CD34+ hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen ex vivo effizient zu differenzieren.

Eine umfassende Pipeline zur Bewertung der Effizienz der menschlichen Erythropoese in vitro und ex vivo

Wir beschreiben ein Verfahren zum Erzeugen regulatorische, Speicher und naive T-Zellen aus einem einzelnen menschlichen Blutspender. Polarisierten Tregs können dann auf andere Teilmengen in einer Vielzahl von genetischen und funktionelle Anwendungen mit genetische Homogenität, einschließlich einer Unterdrückung Assay auch hier detailliert verglichen werden.

Generation der induzierte regulatorische T-Zellen aus primären humanen naiven und Gedächtnis-T-Zellen

T-Zellen, die einen CD19-spezifischen, chimären Antigen-Rezeptor (CAR) als Entwicklung für die Behandlung von B-Zell-Malignomen im First-in-human Gentherapieprüfungen infundiert. Wir beschreiben genetische Modifikation von T-Zellen mit Hilfe...

Klinische Anwendung der<em&gt; Dornröschen</em&gt; Und künstliche Antigen präsentierenden Zellen genetisch zu verändern T Zellen aus dem peripheren und Nabelschnurblut

Hier berichten wir über eine experimentelle Technik der Fluoreszenz-Intravitalmikroskopie um heterotypische Thrombozyten-Neutrophilen-Interaktionen auf dem aktivierten Endothel während der vaskulären Entzündungen und Thrombusbildung in lebenden Mäusen sichtbar zu machen. Diese mikroskopische Technik wird wertvoll sein, um die molekularen Mechanismen der vaskulären Erkrankungen zu studieren und pharmakologische Mittel unter pathophysiologischen Bedingungen zu testen.

Real-time Imaging der heterotypische Platelet-Neutrophilen-Interaktionen auf aktiviertem Endothel Während Vascular Entzündung und Thrombusbildung in lebenden Mäusen

Lernen Sie die Isolierung von CD34+ Zellen aus Nabelschnurblut zur Untersuchung der Megakaryozyten-Differenzierung und Thrombozytenbildung. Diese Methode ermöglicht zuverlässige Ergebnisse in der Hämatologie.

Megakaryocyte Differenzierung und Thrombozyten-Formation von Human Cord Blood abgeleitet CD34 Zellen⁺

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