Megakaryocyte Differenzierung und Thrombozyten-Formation von Human Cord Blood abgeleitet CD34 Zellen⁺

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, menschliche Nabelschnurblutproben zu verwenden, um reine CD34-positive Zellen zu isolieren und die Auswirkungen bestimmter Arzneimittel von Interesse auf die Differenzierung von Megakaryozyten, die Thrombozytenbildung und die Thrombozytenproduktion zu untersuchen. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen zum Megakaryozyten- und Thrombozytenfeld zu beantworten, z. B. welche Auswirkungen eine bestimmte Behandlung auf die Differenzierung von Megakaryozyten sowie die Thrombozytenproduktion und -funktion hat. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine Methode zur konsistenten Isolierung lebensfähiger CD34-positiver Zellen aus frischem Nabelschnurblut bietet.

Durch diese Methode können Einblicke in die Megakaryopoese gegeben werden, können auch andere Zelltypen wie Lymphozyten, Erythrozyten und Makrophagen untersucht werden. Beginnen Sie mit der Zugabe von 10 Millilitern Trennpuffer in ein konisches 150-Milliliter-Röhrchen pro 10 Milliliter Nabelschnurblut. Mit einer stumpfen 18-Gauge-Nadel, die auf einer 10-Milliliter-Spritze montiert ist, werden 10 Milliliter Blut in jedes Röhrchen überführt, gefolgt von der Zugabe von 15 Millilitern Lymphozytentrennmedium zum Boden jedes Röhrchens.

Trennen Sie die Zellen durch Dichtegradientenzentrifugation und sammeln Sie am Ende der Drehung vorsichtig fünf bis 10 Milliliter der mononukleären Zelle, die die Buffy-Coat-Schicht enthält, in ein neues Röhrchen pro Probe. Bringen Sie das Gesamtvolumen in jedem Röhrchen mit einem frischen Trennpuffer auf bis zu 50 Milliliter und zentrifugieren Sie die Zellen erneut. Suspendieren Sie die Pellets erneut in fünf bis 10 Millilitern frischem Trennpuffer und poolen Sie die Zellproben.

Stellen Sie das Volumen auf 50 Milliliter mit frischem Trennpuffer für die Zählung ein und legen Sie 100 Mikroliter Zellen beiseite, um den Prozentsatz der CD34-positiven Zellen durch Durchflusszytometrie zu bestimmen. Zentrifugieren Sie die Zellen erneut und suspendieren Sie das Pellet in 300 Mikrolitern Trennpuffer, 100 Mikrolitern FC-Rezeptor-Reagenz für den menschlichen IgG-Blocker und 100 Mikrolitern CD34-Magnetkügelchen pro einmal 10 bis zur achten Zelle. Mischen Sie die Zellen vorsichtig, bevor Sie sie für eine 30- bis 40-minütige Inkubation bei vier Grad Celsius platzieren.

Während der Inkubation wird eine Magnetbead-Trennsäule in geeigneter Größe in den entsprechenden Magnethalter eingesetzt und die Säule mit drei Millilitern Trennpuffer gewaschen. Am Ende der Inkubation werden die ungebundenen Kügelchen durch Zentrifugation in fünf bis 10 Millilitern Trennpuffer entfernt und die magnetische Kugel und das Zellpellet in 1,5 Millilitern frischem Trennpuffer wieder suspendiert. Laden Sie die markierten Zellen auf die Säule und sammeln Sie den unmarkierten Durchfluss in einem 15-Milliliter-Auffangröhrchen.

Laden Sie das Abwasser zurück in die Säule und sammeln Sie die zweite Runde des Durchflusses in demselben Sammelrohr. Waschen Sie dann die Säule dreimal mit drei Millilitern Trennpuffer und nehmen Sie die Säule vom Magneten. Spülen Sie mit dem Säulenkolben nach und nach zwei Milliliter Trennpuffer durch die Säule in ein neues 15-Milliliter-Röhrchen und führen Sie die Säule wieder in den Magneten ein.

Legen Sie die geleerten Zellen wieder in die Spalte ein. Sammeln Sie den Durchfluss und waschen Sie die Säule mit zwei Millilitern Trennpuffer, wie gerade gezeigt. Nachdem Sie die Säule aus dem Magneten genommen haben, spülen Sie die Säule mit zwei Millilitern frischem Trennpuffer, um die CD34-positive Zellfraktion wie gerade gezeigt zu sammeln, und sammeln Sie die CD34-positiven Zellen durch Zentrifugation.

Anschließend resuspendieren Sie das Pellet in einem serumfreien Medium für CD34-positive Zellen. Für die Differenzierung von Megakaryozyten säen Sie fünf x 10 bis fünfte CD34-positive Zellen pro Milliliter in 2 Millilitern serumfreiem Medium, ergänzt mit rekombinantem humanem Thrombopoietin pro Vertiefung in einer 12-Well-Platte für ihre Inkubation bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid in einer befeuchteten Atmosphäre. Zu den geeigneten Zeitpunkten zur Differenzierungsüberwachung werden die Zellen aus zwei bis drei Vertiefungen pro Zeitpunkt entnommen, ohne die Zellen in den anderen Vertiefungen zu stören, und die gesammelten Zellen mit Anti-CD41- und Anti-CD42a-Antikörpern gefärbt, um den Prozentsatz reifer Megakaryozyten in den Kulturen zu bestimmen.

Für eine mikroskopische Visualisierung an den Zelloberflächenmarkern waschen Sie die geernteten Zellen in 1 Milliliter Trennpuffer und resuspendieren das Pellet in 100 Mikrolitern frischem Puffer. Verwenden Sie einen Cytospin, um die Zellen auf einen Objektträger zu säen, und fixieren Sie die Zellen mit einem 30-sekündigen Eintauchen in Methanol auf dem Objektträger. Nach dem Trocknen an der Luft markieren Sie die Zellen mit 20 Mikrolitern DAPI-supplementiertem Eindeckmedium und decken Sie die Zellen mit einem Deckglas zur Visualisierung durch Fluoreszenzmikroskopie ab.

Um die Prothrombozyten zu zählen, ernten Sie die Zellen am achten oder neunten Tag der Differenzierung und säen Sie die gesammelten Zellen mit einer x 10 bis vier Zellen pro 200 Mikroliter frischem serumfreiem Medium, ergänzt mit rekombinantem humanem Thrombopoietin pro Vertiefung in einer 48-Well-Platte. Nach fünf Tagen bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid zählen Sie die Anzahl der proplättchentragenden Megakaryozyten pro Vertiefung an einem inversen Lichtmikroskop mit dem 10- oder 20-fachen Objektiv. Um die Thrombozytenaktivierung zu analysieren, mischen Sie die Zellen am 14. oder 15. Tag der Kultur vorsichtig mit einer Pasteur-Pipette und sammeln Sie 100 Mikroliter Zellen.

Geben Sie 1 Milliliter Tyrode-Puffer zu den Zellen und pelletieren Sie sie durch Zentrifugation. Sammeln Sie den Überstand für die Zentrifugation, um die plättchengroßen Partikel zu pelletieren, und resuspendieren Sie die Partikel in 100 Mikrolitern frischem Tyrode-Puffer, markieren Sie die Partikel dann mit Anti-PAK1-Antikörpern, aktivieren Sie sie 20 Minuten lang bei Raumtemperatur mit dem Adenosindiphosphat und analysieren Sie den Prozentsatz der PAK1-positiven Ereignisse durch Durchflusszytometrie. Der typische Prozentsatz an CD34-positiven Zellen im Nabelschnurblut beträgt etwa 1,3 % und die Reinheit der CD34-positiven CD45-positiven Zellen nach der Isolierung liegt zwischen 90 und 99 %CD41-positiven Megakaryozyten werden früh in serumfreien CD34-positiven Zellkulturen beobachtet, wobei der Prozentsatz reifer CD41-positiver CD42a-positiver Megakaryozyten bis zum 7. Tag 30 bis 40 % erreicht und die höchsten Konzentrationen an doppelt positiven Zellen zwischen dem 10. und 12. Tag der Differenzierung beobachtet werden.

Kultivierte Megakaryozyten erscheinen als große, in der Regel mehrkernige Zellen, die CD42b, den Von-Willebrand-Faktor und P-Selektin in ihrem Zytoplasma exprimieren. Mindestens drei Klassen von Ploidie werden in diesen Zellkulturen ebenfalls häufig beobachtet. Der Prozentsatz der Megakaryozyten, die Prothrombozyten tragen, lange kügelchenförmige Fasern, die sich aus dem Megakaryozytenkörper erstrecken, liegt typischerweise bei etwa 1,3 %Die meisten Blutplättchen im Zellkulturüberstand fallen in das analytische Tor der peripheren Blutplättchen, sind positiv für den CD41-Thrombozytenmarker und können durch Thrombozytenagonisten wie Adenosindiphosphat aktiviert werden, was durch eine erhöhte Bindung des aktivierungsspezifischen monoklonalen PAK1-Antikörpers gezeigt wird.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, werden Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie CD34-positive Zellen aus Nabelschnurblut isoliert werden können. Sie sollen auch in der Lage sein, Megakaryozyten-Differenzierungskulturen einzurichten, Thrombozyten zu zählen und in vitro produzierte Thrombozyten und Megakaryozyten zu analysieren. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit menschlichen Proben gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten, wie z. B. die Arbeit in einer biologischen Sicherheitswerkbank der Klasse II.