Ausdruck der exogene Antigene im Mycobacterium Bovis BCG Impfstoff über nicht-genetische Oberfläche Dekoration mit dem Avidin-Biotin-System

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Oberflächenproteine auf Mykobakterien unter Verwendung von Oberflächendekoration mit rekombinanten Proteinen als Alternative zu traditionellen, genetisch basierten Ansätzen zu exprimieren. Diese Methoden können helfen, wichtige Forschungsfragen im Bereich der Mykobakteriologie zu beantworten, insbesondere im Bereich der Wechselwirkungen im Krankenhaus und der Impfstoffentwicklungen. Diese Technik kann verwendet werden, um nach potenziellen Störfaktoren oder Antigenkandidaten zu suchen.

Es kann schnell mit anspruchsvollen und zeitaufwändigen traditionellen genetisch basierten Ansätzen verglichen werden. Amina Talal, eine wissenschaftliche Mitarbeiterin in meinem Labor, wird dieses Verfahren demonstrieren. Dieser Teil des Protokolls beginnt mit der Umwandlung des P17 Aviden OVA-Plasmids in E.Coli BL21.

Dazu werden 250 Milliliter E.Coli BL21-Kultur drei Stunden lang bei 37 Grad Celsius mit IPTG induziert. Nach drei Stunden lysieren Sie die Bakterien, um die Einschlusskörper zu lösen, indem Sie zuerst die induzierte BL21-Kultur pelletieren und den Überstand verwerfen. Dann suspendieren Sie das Pellet wieder in 10 Milliliter Lysepuffer und lassen Sie die Zellen 15 Minuten lang lysieren.

Setzen Sie dann die Inkubation bei Raumtemperatur mit einem Rotator zum Rühren fort und lassen Sie sie über Nacht laufen. Zentrifugieren Sie die Mischung morgens eine halbe Stunde lang. Sammeln Sie dann den Überstand mit den löslichen Einschlusskörpern.

Als nächstes reinigen Sie die Aviden OVA-Proteine mit einer Nickel-NTA-Säule. Verdünnen Sie zunächst den Überstand ein bis zwei in Lysepuffer und schätzen Sie das Volumen. Bereiten Sie dann eine Säule vor, die vier Milliliter Nickel-NTA-Harz pro 250 Milliliter verdünnten Überstands enthält, und laden Sie die Verdünnung auf die Säule.

Waschen Sie die Säule anschließend dreimal mit 10 Millilitern Lysepuffer bei einem pH-Wert von sieben pro Waschgang. Um das rekombinante Protein zu sammeln, waschen Sie die Säule mit Lysepuffer, der Imidazol enthält, und sammeln Sie das Eluat. Wenn Ihr rekombinantes Protein frei von Einschlusskörpern ist, ist das folgende Verfahren für viele Proteine in unserem Labor geeignet.

Stellen Sie zunächst den pH-Wert der Rückfaltungslösung so ein, dass er eine Einheit über oder unter dem isoelektrischen Punkt des Proteins liegt. Drehen Sie dann das Protein allmählich vor und verdünnen Sie es auf eine Verdünnung von 1 bis 10 in der Wiederfaltungslösung. Dann inkubieren Sie das Protein auf einem Magnetrührer 30 Minuten lang bei Raumtemperatur, um den Rückfaltungsprozess abzuschließen.

Als nächstes werden die gefalteten Proteine mit einem Proteinkonzentrator entsalzt und gepuffert, um sie in PBS umzuwandeln. Anschließend zentrifugieren Sie die Säule und lagern Sie Faulpel mit löslichem Protein bei 20 Grad Celsius. Arbeiten Sie in einer Biosicherheitswerkbank mit persönlicher Schutzausrüstung, da BCG ein Krankheitserreger der Stufe 2 ist.

Um die Oberfläche von BCG-Zellen zu biotinylieren, züchten Sie die Zellen zunächst auf einer Shaker-Plattform auf die richtige Dichte. Sammeln Sie etwa eine Milliarde Zellen und waschen Sie sie dreimal mit 500 Mikrolitern eiskaltem, endotoxinfreiem PBST. Schleudern Sie dann die Zellen herunter und suspendieren Sie sie in sterilem, endotoxinfreiem PBS.

Bereiten Sie anschließend frisches 10 Millimolar Sulfo-NHSSS-Biotin in sterilem gefiltertem Wasser zu. Dann inkubieren Sie die Bakterien in einem Milliliter Brühe, die 0,5 Millimolar Sulfo-NHSSS-Biotin enthält. Führen Sie die Inkubation 30 Minuten lang bei Raumtemperatur durch.

Waschen Sie anschließend die nun markierten Bakterien dreimal mit 500 Mikrolitern eiskaltem PBST, wie zuvor, um das nicht umgesetzte Reagenz zu entfernen. Suspendieren Sie dann das Pellet wieder in einem Milliliter PBST. Um die Biotinylierungseffizienz zu bewerten, wird ein Aloquat von 100 Millionen biotinylierten BCG mit 25 Mikrolitern Strepravidin-FITC gefärbt

Dann inkubieren Sie die gefärbten Bakterien kurz in para-Formaldehyd und messen Sie dann den Grad der Biotinylierung mit Hilfe der Durchflusszytometrie. Nachdem Sie das Wachstum und Überleben der biotinylierten Mykobakterien beurteilt haben, fahren Sie mit der Bindung des Aviden-Fusionsproteins an sie fort. Mischen Sie zunächst 500 Millionen biotinylierte BCGs mit dem Aviden-Fusionsprotein, um eine Endkonzentration von 10 Mikrogramm Protein pro Milliliter zu erreichen.

Lassen Sie diese Reaktion eine Stunde lang bei Raumtemperatur auf einem Shaker ablaufen. Anschließend waschen Sie die Bakterien dreimal mit 500 Mikrolitern eiskaltem PBST. Anschließend färben Sie die Bakterien 20 Minuten lang bei Raumtemperatur mit Kaninchen-Anti-Aviden-Antikörpern.

Führen Sie nach 20 Minuten einen Waschgang mit 500 Mikrolitern eiskaltem PBST durch. Färben Sie dann die Bakterien mit FITC-konjugiertem Ziegen-Anti-Kaninchen-IGG-Antikörper. Waschen Sie anschließend die Bakterien mit 500 Mikrolitern eiskaltem PBST und analysieren Sie die Bakterien mittels Durchflusszytometrie, um die Oberflächendekoration zu bewerten.

Nach Befolgung des beschriebenen Protokolls zeigt die Zytologie, dass es ein minimales Maß an OVA-Bindung an nicht-biotinylierte Bakterien und ein signifikantes Maß an OVA-Bindung an biotinylierte Bakterien gab. Wichtig ist, dass die Aviden OVA-Konzentrationen auf der Bakterienoberfläche einen Monat nach der Lyophilisierung und Lagerung bei Raumtemperatur stabil und nachweisbar blieben. Als nächstes wurden RAW-Zellen und dsRed-Bakterien verwendet, um einen Phagozytose-Assay durchzuführen.

Erfreulicherweise gab es keine Abschreckung im Makrophagen-Phänotyp. Um das Schicksal von Aviden OVA-dekorierten BCGs in Makrophagen zu untersuchen, wurden adhärente RAW-Zellen infiziert und mittels Fluoreszenzmikroskopie untersucht. Aviden OVA war nicht nur auf der Bakterienoberfläche vorhanden, sondern auch abgelöst und in das Zytoplasma weit entfernt von den Bakterien translokalisiert.

Ein Immuno-Gold-Färbeexperiment zeigte, dass sich Aviden OVA-Antigene von der BCG-Oberfläche lösen, die phagosomale Membran passieren und in Richtung des Zytosols wandern können. Makrophagen, die mit Aviden OVA BCG infiziert waren, zeigten eine Co-Lokalisierung von Avi OVA mit IA-Molekülen. Dies deutet darauf hin, dass sich Aviden-Fusionsproteine ablösen und in Antigenpräsentationskompartimente translozieren, um auf MHC2-Moleküle geladen zu werden.

Aviden OVA-Peptide colokalisierten auch mit Klasse-I-Molekülen in BCG-Phagosomen, wie die H2K-Färbung zeigte. Somit besteht die Möglichkeit, dass der Makrophage CD8-positiven T-Zellen das Avi-OVA-Antigen präsentiert. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Proteine in Mykobakterien exprimiert werden, und dieser Organismus ist mit den aktuellen genetischen Methoden schwer zu manipulieren.

Nachdem wir die Technik erfolgreich eingesetzt haben, um den Impfstoff mit dem Mykobakterien-Antigen zu beladen, ist bei sechs. Dann zeigten wir, dass die modifizierten Impfstoffe die Möglichkeit boten, sie als spezifische Immunantwort im Mausmodell zu verwenden. Wir arbeiten derzeit mit zusammen, um diesen Ansatz bei Teratin zu erforschen. Wir schlugen vor, BCG zu verwenden, das mit ausgewählten Antigenen oder Immunbulatoren aufgerüstet wurde.