Name: Ausdruck der exogene Antigene im Mycobacterium Bovis BCG Impfstoff über nicht-genetische Oberfläche Dekoration mit dem Avidin-Biotin-System (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 11 s
Description: Erfahren Sie die Oberflächendekoration von Mycobacterium bovis BCG mit rekombinanten Proteinen als Alternative zu genetischen Methoden. Diese Technik ermöglicht die schnelle Darstellung von Antigenen für die Impfstoffentwicklung.

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Wir danken Dr. R Stokes für die BCG Pasteur Belastung und A. Talal für den technischen Support. Wir danken auch GenScript für Hilfe bei der Gensynthese.

Alle Tiere wurden entsprechend Protokolle vom Animal Care und Nutzung Ausschüsse an der University of British Columbia genehmigt gewartet. Experimente wurden von Animal Care und Nutzung Ausschüsse genehmigt und nach dem Canadian Council auf Animal Care Richtlinien durchgeführt. Die tierischen Qualitätssicherung Wohlfahrt ist A11-0247.
1. Generation von Monomeren Avidin Fusionsproteinen Plasmide zum Ausdruck zu bringen
<ol><li>Sub-Klonen Monomeren Avidin Sequenz12 in pDEST17 Plasmid zwischen den Standorten "CTC" und "GAA", das entspricht 133-134bp. (d. h.zwischen 6-Histag und pDEST17 Attr1 Rekombination), p17-Avi zu erhalten. Hinweis: Die Monomere Avidin DNA-Sequenz ist unten dargestellt. Die drei Mutationen in Wildtyp Avidin erhalten monomerer Avidin eingeführt werden in fett gedruckten Zeichen angezeigt. Gccagaaagtgctcg Ctgactggga Aatggaccaa Cgatctgggc TccATCAtga Ccatcggggc tgtgaacagc Agaggtgaat Tcacaggcac Ctacatcaca Gccgtaacag Ccacatcaaa Tgagatcaaa Gagtcaccac tgcatgggac ACAAGCTAcc Atcaacaaga Ggacccagcc Cacctttggc Ttcaccgtca Attggaagtt Ttcagagtcc accactgtct Tcacgggcca Gtgcttcata Gacaggaatg Ggaaggaggt Cctgaagacc Atgtggctgc Tgcggtcaag tgttaatgac Attggtgatg AcAAAAaagc Taccagggtc Ggcatcaaca Tcttcactcg Cctgcgcaca Cagaaggagt ga</li>
	<li>Design-Primer flankiert mit AttB1 und B2 AttWebsites entsprechend OVA Polypeptid757-1035 (-A-b- und H-2_Kb-Epitope eingeschränkt) DNA-Sequenz. Primer-Sequenzen sind: Attb1-OVA GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCCTTGAGCAGCTTGAGAGTAT und Attb2-OVA GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGTTACCCTACCACCTCTCTGC. (Attb1 und b2-Sequenzen Attsind fett formatiert).<ol>
<li>PCR-verstärken OVA Polypeptid757-1035 DNA-Sequenz mit Primer über das pUC57-OVA-Plasmid als Vorlage verwenden.</li>
		<li>Klonen Sie die PCR-Produkte in pDONR-221 durch eine ortsspezifische in-vitro- Rekombination Reaktion (z. B.BP Clonase), pDONR-OVA zu erhalten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Übertragen Sie das gen des Interesses in p17-Avi mit LR Clonase Reaktion, um p17-Avi-OVA zu erhalten. Hinweis: Für Details von BP und LR Rekombination Klonen, siehe Handbuch des Herstellers.</li>
</ol>(2) Monomeren Avidin-Fusion-Protein-Expression, Reinigung und Umfaltung
<ol><li>Verwandeln Sie p17-Avi-OVA Plasmid in E. Coli BL21 und induzieren Sie 250 mL von E. Coli BL21 Kultur mit IPTG (0,1 M) für 3 h bei 37 ° C.</li>
	<li>
Lyse von Bakterien und Einschlusskörperchen Solubilization
	<ol>
<li>Pellet-250 mL der induzierten BL21 Kultur von 30 min Zentrifugation bei 4.000 x g und bei 4 ° C.</li>
		<li>Pellets in 10 mL Lyse-Puffer zu sammeln (50 mM Tris-HCL, 150 mM NaCl, 6 M Guanidin-HCL, pH 1,5-2,5) und 15 min bei 95 ° c inkubieren Inkubation über Nacht bei Raumtemperatur auf ein Rotator.</li>
		<li>Zentrifuge 30 min bei 15.000 x g und 4 ° C und sammeln überstand.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Reinigen Sie Avi-OVA von überstand (solubilisiert Einschlusskörperchen Bruch) Ni-NTA Spalten verwenden.
	<ol>
<li>Verdünnen Sie Einschlusskörperchen 1:2 mit Lyse Puffer.</li>
		<li>Verwenden Sie 4 mL Ni-NTA Harz pro 250 mL Einschlusskörperchen Kultur abgeleitet.</li>
		<li>3 X mit 10 mL Lyse-Puffer (pH 7,0) zu waschen.</li>
		<li>Eluieren Sie mit 10 mL der Elution Buffer (Lyse Puffer pH 7,0 mit 250 mM Imidazol).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Umfalten eluierten Proteins durch schrittweise Verdünnung (01:10) und schnelle Vortexen in Tris-Puffer (pH 7,5) mit 1 mM DTT, 200 mM NDSB256 (3-(Benzyldimethylammonio)propanesulfonate), 0,5 mM Tween 80, Arginin 500 mM und 200 mM NaCl für 30 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>De-Salz und Buffer Tausch refolded Protein von Tris-Puffer in PBS mit Protein-Konzentratoren laut des Herstellers Protokolle.</li>
	<li>Entfernen Sie Aggregate durch Zentrifugation für 30 min bei 3.500 X g und bei 4 ° C, und lagern Sie Aliquote des löslichen Proteins bei-20 ° C.</li>
</ol>3. Biotinylierungen BCG Zelloberfläche
<ol><li>Wachsen BCG in Middlebrook 7H 9 Brühe mit 10 % OADC (Ölsäure, Albumin und Traubenzucker-Lösung) und 0,05 % Tween 80 bei 37 ° C auf einem Shaker-Plattform bei 50 u/min bis OD = 0,5-1. Hinweis: BCG ist ein Biosafety Level 2 Erreger und alle Experimente rund um BCG sollte in einen Schrank mit geeignete persönliche Schutzausrüstung Biosafety erfolgen.</li>
	<li>Waschen Sie 109 BCG 3 Mal mit 500 µL des eiskalten Endotoxin kostenlose PBS plus 0,1 % Tween80 (PBST) (pH 8,0). BCG Pellet in sterilen Endotoxin kostenlose PBS auszusetzen.</li>
	<li>
Unmittelbar vor der Anwendung bereiten Sie 1 mL 10 mM Sulfo-NHS SS Biotin in sterilen gefiltertes Wasser.
	<ol>
<li>Inkubieren Sie Bakterien mit 1 mL 0,5 mM von Sulfo-NHS SS Biotin bei Raumtemperatur für 30 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Waschen mit der Bezeichnung Bakterien 3 Mal mit 500 µL Eistee kalt PBST nicht reagiert Biotinylierungen Reagenz zu entfernen.
	<ol>
<li>Wieder aussetzen Sie Pellet in 1 mL der PBST.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Um Biotinylierungen Effizienz zu bewerten, Fleck 108 biotinylierte BCG mit Streptavidin-FITC (1: 100, 25 µL) bei Raumtemperatur für 20 min.
	<ol>
<li>Inkubieren gefärbte Bakterien in 1 mL 2 % PFA für 20 min bei Raumtemperatur und dann untersuchen Stufen des Biotinylierungen durch Flow-Zytometrie-Analyse.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(4) Phänotyp der biotinylierte Mykobakterien: Wachstum und überleben
<ol><li>
Wachsen der BCG-Stämmen in Middlebrook 7H 9 Brühe mit 10 % OADC (Ölsäure, Albumin und Traubenzucker-Lösung) und 0,05 % Tween 80 bei 37 ° C auf einen Shaker-Plattform bei 50 Umdrehungen pro Minute.
	<ol>
<li>Die optische Dichte (OD600) der bakteriellen Kultur über eine 8-Tage-Frist aufnehmen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Verwenden Sie BCG-Luc (zuvor beschriebenen9), um Überleben der Bakterien zu erkennen, in Makrophagen.
	<ol>
<li>RAW264.7 Zellen mit biotinylierte BCG-Luc (MOI 10:1) infizieren oder unbehandelt BCG-Luc (Kontrolle) und Zeitraum bei 37 ° C über 48 h inkubiert.</li>
		<li>Zelle Monolagen waschen und dann mit 0,025 % SDS freizugebende aufgenommene Bakterien lysiert.</li>
		<li>Messen Sie Biolumineszenz-Produktion mit Luciferase Assay System und Luminometer. Hinweis: Lumineszenz-Signal ist bezeichnend für bakterielle Lebensfähigkeit. Siehe Handbuch des Herstellers für Details der Luciferase Assay.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Bindung von Monomeren Avidin-Fusionsprotein biotinylierte BCG Oberfläche
<ol><li>Mischen Sie 5 x 108 biotinylierte BCG mit Avi-Protein (10 μg/mL Finale in PBS-T) für 1 h bei Raumtemperatur auf Shaker Plattform.</li>
	<li>Waschen Bakterien 3 Mal mit 500 µL Eistee kalt PBST und Fleck mit Kaninchen Anti-Avidin Antikörper (Ab) (1: 100 Verdünnung, zuvor beschriebenen10) für 20 min bei Raumtemperatur und dann mit FITC konjugiert Ziege Anti-Kaninchen IgG Ab unter den gleichen Bedingungen.</li>
	<li>Bakterien 3 Mal mit 500 µL PBST waschen und analysieren von Durchflusszytometrie zu bewerten, inwieweit der Oberflächendekoration.</li>
</ol>6. die Gefriertrocknung von Mykobakterien
<ol><li>Biotinylate Bakterien nach Schritt 3.1-3.4 und Mantel biotinylierte Bakterien mit Avi-OVA gemäß Schritt 5.1.</li>
	<li>Aliquoten biotinylierte und beschichteten Bakterien (108), mit PBS waschen und in 0,5 mL Lyophilisierung Medien erneut aussetzen (25 % Sauton Medium, 75 % H2O und 1,5 % Na-Glutamat).</li>
	<li>Übertragen Sie Bakterien, Glasfläschchen und über Nacht in einem-80 ° C Gefrierschrank einfrieren.</li>
	<li>Lyophilize gefüllt und gefrorenen Glasfläschchen für 24 h mit einer Gefriertrocknungsanlage.</li>
	<li>Getrocknete Proben bei Raumtemperatur lagern und mit PBS-Puffer bei Bedarf wiederherzustellen.</li>
	<li>Wiederholen Sie Schritt 3.5, Biotinylierungen und Oberflächenbeschichtung Stabilität zu bewerten.</li>
</ol>7. die Phagozytose Assay
<ol><li>Wachsen Sie RAW 264,7 Makrophagen Zellen in 10 cm Durchmesser Kultur Gerichte in DMEM Medium mit 5 % FCS, 1 % L-Glutamin, HEPES, nicht-essentiellen Aminosäuren und Penicillin und Streptomycin bis 70-80 % Konfluenz.</li>
	<li>Samen Sie 2 x 106 RAW 264,7 Makrophagen Zellen in einem 6-Well-Platte. Können Sie Zellen über Nacht bei 37 ° C und 5 % CO2einzuhalten.</li>
	<li>DsRed BCG zu generieren (zuvor beschriebenen9) dekoriert mit Avi-OVA (DsRed BCG-Avi-OVA) Schritte 3.1-3.4 und 5.1.</li>
	<li>Infizieren Sie RAW Zellen mit DsRed BCG-Avi-OVA oder unbehandelten DsRed BCG bei MOI 20:1 für 24 h bei 37 ° C.</li>
	<li>Zellen dreimal waschen und trypsinize mit 1 mL Trypsin 0,25 % bei 37 ° C für 10 min um teilweise freistehende Bakterien zu entfernen.</li>
	<li>Korrigieren Sie in 2,5 % PFA in PBS für 20 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>3 X mit PBS waschen und analysieren von Durchflusszytometrie.</li>
</ol>8. die intrazelluläre Handel mit Eizellen dekoriert biotinylierte BCG in Makrophagen
<ol><li>
Fluoreszenz-Mikroskopie
	<ol>
<li>Samen Sie 3 x 105 RAW 264,7 Makrophagen Zellen auf Deckgläsern in einer 24-Well-Platte. Können Sie Zellen über Nacht bei 37 ° C und 5 % CO2einzuhalten.</li>
		<li>Infizieren Sie Makrophagen Zellen mit Mykobakterien (MOI 10:1) in Wartung Medien ohne Antibiotika bei 37 ° C und 5 % CO2 für 4 bis 24 h.</li>
		<li>Waschen Sie Zellen und trypsinize Oberfläche angebracht, nicht aufgenommenen Bakterien wie in Schritt 7,5 zu entfernen.</li>
		<li>Fix infizierte Zellen in 2,5 % gefolgt von 3 Wäschen mit PBS PFA in PBS für 20 min bei Raumtemperatur.</li>
		<li>Permeabilize Zellen blockieren/Permeabilisierung Puffer (0,1 % Triton x-100, 3 % BSA mit PBS-Puffer) für 20 min bei Raumtemperatur.<ol>
<li>Nutzung spezifischer Antikörper von Interesse (z.B.Kaninchen Anti-Avidin Ab) bei 10 μg/mL in Permeabilisierung Buffer für 20 min bei Raumtemperatur gefolgt von Sekundärantikörper (z.B.FITC-Ziege-Anti-Kaninchen-IgG) für 20 Minuten.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Wash Zellen 3 X mit PBS, einmal mit Wasser und Berg auf Folien in 10 μL wässrige Eindeckmedium Immunofluoreszenz Fluoreszenz zu minimieren.</li>
		<li>Untersuchen Sie Dias digital konfokalen Mikroskopie mit einem Epifluoreszenz Mikroskop ausgestattet mit 63 X / 1.4 Plan-Apochromat Ziel. Aufnahme von Bildern mit einer digitalen Kamera gekoppelt an die Mikroskop-Software.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Immunogold Färbung und Elektronenmikroskopie
	<ol>
<li>Samen Sie 2 x 106 RAW 264,7 Makrophagen Zellen in 6-Well Platten.</li>
		<li>Beheben von BCG infizierten Makrophagen mit 4 % PFA für 4 h bei Raumtemperatur.</li>
		<li>Waschen Sie Proben zweimal mit PBS.</li>
		<li>Proben in 4 % niedriger Schmelzpunkt Agarose einbetten und in 70 % igem Ethanol zu entwässern.</li>
		<li>Übertragen Sie Proben auf Acrylharz und polymerisieren bei 50 ° C.</li>
		<li>60 nm Abschnitte mit einem Mikrotom schneiden Sie aus und sammeln Sie Abschnitte auf Nickel Gittern.</li>
		<li>Proben mit 10 μg/mL Avidin Antikörper für 1 h bei Raumtemperatur oder 4 ° C über Nacht in Inkubation Lösung (PBS und 0,1 % BSA) beschriften und dann waschen mit Inkubation Lösung Gold konjugiert F(ab')2 ultra-kleine Ziege-Anti-Kaninchen IgG (1/20) für 1 h bei Zimmer Temperatur in Inkubation Lösung.</li>
		<li>Waschen Sie Abschnitte in destilliertem Wasser zu, in 2 % Glutaraldehyd färben Sie, waschen Sie, lufttrocknen und mit Elektronen-Mikroskop zu untersuchen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>9. tierische Immunisierung und Orgel Bearbeitung
Hinweis: Alle Schritte sollten in eine biologische Kabinett erfolgen.
<ol><li>Pass biotinylierte Protein beschichtet und Bakterien durch 271/2G Nadel 10 mal einzelne Zellsuspension zu machen.</li>
	<li>
1 x 106 Bakterien in 100 μl PBS Endotoxin-frei zu nehmen und einen weiblichen C57BL/6 Mäusen (-A,b, H - 2 Kb, 5-6 Wochen alt) subkutan in das Genick zu immunisieren.
	<ol>
<li>Kontroll-Mäusen mit 100 μl PBS allein zu injizieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Einschläfern Sie immunisierten Mäusen 20 Tage nach Immunisierung durch CO2 einatmen, gefolgt von zervikale Dislokation.
	<ol>
<li>Die Milz zu isolieren und in RPMI Medien zu übertragen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Zerdrücken Sie Milz durch ein Sieb 70 µm Zelle mit einer 5 mL Spritze Stößel.
	<ol>
<li>Mit 5 mL RPMI waschen. Zentrifuge (800 X g, 3 min), um eine einzelne Zelle Aussetzung zu isolieren.</li>
		<li>Zum Abbau RBC mit Maus Biotin Positivauswahl Kit mit Biotin-Ter119/erythroiden Zellen Ab.</li>
		<li>Zentrifuge und wieder auszusetzen Zellen in 10 mL komplette RPMI (10 % FCS, 1 % L-Glutamin, 1 % Penicillin, Streptomycin 1 % und 50 μM 2-ME).</li>
	</ol>
</li>
</ol>10. ich-Ab Tetramer Färbung bestimmen die Frequenzen der Antigen-spezifische CD4+ T-Zellen und intrazellulären Zytokin Färbung zu bestimmen, Frequenzen von antigenspezifischen T Zellen Freigabe Zytokine bei immunisierten Tieren
<ol><li>
Tetramer Färbung
	<ol>
<li>Fleck Splenocyten von Kontrolle und immunisierten Mäusen (~ 20 x 106 Zellen) mit PE-konjugiert-Ab-OVA323-339 Tetramers (1/12,5 Verdünnung) für 1 h bei 37 ° C in Bindung Puffer (PBS mit 2 % FCS und 0,1 % NaN3).</li>
		<li>Splenocyten für 20 min bei Raumtemperatur fügen Sie AF647 CD4 Ab (01:25) und 7-AAD (um abgestorbene Zellen erkennen hinzu).</li>
		<li>Analysieren Sie Proben von Durchflusszytometrie.</li>
		<li>Erwerben Sie 500.000 Ereignisse in der CD4-positiven-Region das Tetramer positiver Ereignisse fest. Hinweis: Total Splenocyten von der SSC/FSC-Dot-Blot, lebenden Zellen durch Ausschluss der 7-AAD positive Ereignisse und CD4 Teilmengen zeichnen sich durch gating AF647 positive Ereignisse.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Häufigkeit der Antigen spezifischen intrazellulären Cytokine Freigabe von T-Zellen
	<ol>
<li>Transfer ca. 1 × 107 Splenocyten in 4 mL des kompletten RPMI Medium in sechs-Well-Platten mit oder ohne rekombinante OVA (10 µg/mL) und 16 h inkubieren.</li>
		<li>Behandlung von Zellen mit Brefeldin A (1:1, 000) für weitere 5 h.</li>
		<li>Waschen Sie mit PBS und intrazellulären Zytokin Färbung wie folgt:<ol>
<li>Färben Sie Zellproben mit PE-CD8 oder PE-Cy7-CD4 Ab (01:50 in Bindung Puffer) in 30 min bei Raumtemperatur.</li>
			<li>Korrigieren Sie in 4 % PFA bei Raumtemperatur für 20 min.</li>
			<li>Permeabilize mit Permeabilisierung Lösung entsprechend den Anweisungen des Herstellers.</li>
			<li>Waschen Sie Zellen und Label mit AF647 konjugiert IFN-γ Ab (01:50) für 20 min bei Raumtemperatur.</li>
			<li>Waschen Sie Zellen zu und zu Flow-Zytometrie-Analyse zu unterziehen Sie, wie oben beschrieben.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

In dieser Studie berichten wir einen nicht-genetische Ansatz für schnelle und effektive Darstellung der exogene Proteine auf BCG Oberfläche hinzufügen entweder spezifische Antigene oder bestimmte funktionale Eigenschaften erwartet, dass das Bakterium Immunogenität effizient zu verbessern. Wir bewiesen, dass die BCG-Zelloberfläche biotinylierte für sofortige Oberflächendekoration mit Avidin Fusionsproteine leicht sein könnte. Das gesamte Verfahren kann innerhalb von 2 h, während genetische Veränderung und Selektion der po...

Verschiedene Strategien sind vorgeschlagen worden, um die aktuelle TB-Impfstoff BCG, einschließlich Protein adjuvante Systeme, virale vektorieller Technologien, abgeschwächte live M.tb Stämme und genetisch veränderten BCG-Stämmen entweder Gene einzuführen zu ersetzen über Ausdruck BCG-Antigene, die während der Infektion1 oder Mtbnicht hinreichend zum Ausdruck-spezifische Antigene bei BCG2nicht vorhanden. Gentechnik, steht jedoch viele Hindernisse einschließlich der unsicheren Ebene der Sicherheit, die zeitraubende und die geringe Effizienz der Ausdruck Vektoren4,5. Im Hinblick auf die Verbesserung der BCG, ist ein alternativer Ansatz zur Immunogenität ohne die Notwendigkeit einer unsicheren genetische Alternationen Verbesserung notwendig.
In dieser Studie stellen wir eine neue Strategie für die Anzeige der rekombinante Proteine auf der Zelloberfläche von BCG, die auf die bekannte hohe Affinität Avidin Interaktion mit Biotin basiert. Dieser Ansatz ermöglicht schnelle und reproduzierbare Befestigung des rekombinanten Avidin Schmelzverfahren Proteine auf der Oberfläche der biotinylierte BCG, die breitere Manipulationen von BCG, maximale Verbesserung ihrer Wirksamkeit unter Beibehaltung seiner ausgezeichneten Sicherheit zu erreichen erleichtert Zeichnen Sie auf, über Jahrzehnte beobachtet.
Avidin Affinität für Biotin ist extrem hoch (Kd = 10−15 M) und sobald gebildet, die Avidin-Biotin-Komplex ist sehr stabil und kann nur unter denaturierenden Bedingungen6gestört werden. Für diese Art der Interaktion, als gen-Transfer-Methode Alternative zu dienen, ist jedoch langfristig aber reversibel Anzeige von rekombinanten Proteinen erforderlich. Damit wir hier eine geringe Affinität Monomeren Avidin eingeführt (Kd = 10−7 M) führt zur reversiblen Freisetzung des Proteins von der Oberfläche BCG einmal eingenommen innen antigenpräsentierende Zellen versehen. Um ein Proof of Concept zu bieten, haben wir diese Methode mit einem Monomeren Avidin Chimären Protein entspricht ein Surrogat-Antigen abgeleitet von Ovalbumin (OVA)7,8getestet. Die Ergebnisse zeigten, dass die BCG-Zelle-Oberfläche einfach und schnell mit Monomeren Avidin Fusionsproteine dekoriert werden kann und dass diese Bindung an die BCG-Oberfläche stabil und ohne erkennbare Veränderungen in bakterielles Wachstum und überleben reproduzierbar ist. Auch wir fanden, dass BCG dekoriert mit Monomeren Avidin fusioniert mit Eizellen (AviOVA) eine ähnlich dem von BCG induzierte Immunantwort induzieren kann genetisch dasselbe Antigen ausdrücken in Vitro und in Vivo. Diese Technologie umschaltbare Anzeige der Proteine des Interesses auf der bakteriellen Oberfläche ist daher eine effektive Ersatz von traditionellen gen Übertragung Ansätze und kann bieten eine Plattform für breiten Manipulationen der BCG und weitere Anwendungen im Impfstoff Entwicklung.

<table><tbody><tr><td>Endotoxinfreies RPMI 1640</td><td>StemCell Technologies</td><td>36750</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-NHS SS Biotin</td><td>Thermo Fisher&nbsp;</td><td>21328</td><td></td></tr><tr><td>FITC-konjugiertes Streptavidin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3762</td><td></td></tr><tr><td>Phycoerythrin (PE)-konjugiertes I-Ab-OVA323-339 Tetramer&nbsp;</td><td>MBL International&nbsp;</td><td>TS-M710-1</td><td></td></tr><tr><td>7-AAD</td><td>BD Pharmingen</td><td>559925</td><td></td></tr><tr><td>TALON Polyhistidin-Tag-Reinigungsharz&nbsp;</td><td>Clontech</td><td>635501</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor (AF) 647 konjugiertes Ratten-Anti-Maus-CD4</td><td>BD Bioscience&nbsp;</td><td></td><td></td>557681</tr><tr><td>AF647 Anti-Maus für Ratten IFN-g</td><td>BD Bioscience&nbsp;</td><td></td><td></td>557735</tr><tr><td>AF647 Anti-Maus für Ratten I-A/I-E</td><td>BD Bioscience&nbsp;</td><td></td><td></td>562367</tr><tr><td>PeCy7 Anti-Maus-Anti-Maus CD4</td><td>BD Bioscience&nbsp;</td><td></td><td></td>552775</tr><tr><td>PE Anti-Maus für Ratten CD8 Ab</td><td>BD Bioscience&nbsp;</td><td></td><td></td>561095</tr><tr><td>AF 647 Anti-Maus für Ratten H-2kb</td><td>BD Bioscience</td><td>562832</td><td></td></tr><tr><td>FITC-konjugierter Anti-Kaninchen-Antikörper</td><td>Thermo Fisher</td><td>31635</td><td></td></tr><tr><td>AF 647 Anti-Maus für Ratte CD4</td><td>BD Bioscience&nbsp;</td><td></td><td></td>557681</tr><tr><td>Ultrakleine goldkonjugierte Ziege Anti-Kaninchen IgG</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>25100</td><td></td></tr><tr><td>Middlebrook 7H9 Bouillon</td><td>BD Diagnostic Systems</td><td>271310</td><td></td></tr><tr><td>OADC</td><td>BD Diagnostic Systems</td><td>B11886</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>RAW 264.7 murine Makrophagen-Zelllinien</td><td>Amerikanischer Typ Kultursammlung</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pDEST17 Plasmid&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11803012</td><td></td></tr><tr><td>pUC57-OVA-Plasmid&nbsp;</td><td>GenScript</td><td>SD1176</td><td></td></tr><tr><td>BP Klonase&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11789020</td><td></td></tr><tr><td>LR-Klonase&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11791043</td><td></td></tr><tr><td>pDONR221 Plasmid</td><td>Invitrogen</td><td>12536017</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA-Säulen&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>31014</td><td></td></tr><tr><td>Pierce-Proteinkonzentratoren&nbsp;</td><td>Thermo Fisher&nbsp;</td><td>88527</td><td></td></tr><tr><td>Flurosave</td><td>Calbiochem-Novabiochem</td><td>345789</td><td></td></tr><tr><td>Axioplan II Epifluoreszenzmikroskop</td><td>Carl Zeiss Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CCD Digitalkamera&nbsp;</td><td>Retiga EX, QImaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tecnai G2 200kV Elektronenmikroskop&nbsp;</td><td>FEI Company</td><td>G2 200Kv&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>70 Mio. Jahre m Falcon Zellensieb&nbsp;</td><td>Thermo Fisher&nbsp;</td><td>87712</td><td></td></tr><tr><td>EasyStep Maus Biotin Positiv-Auswahlkit&nbsp;</td><td>StemCell</td><td>18556</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-Ter119/Ertyroidzellen Antikörper</td><td>BioLegend</td><td>116203</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A</td><td>BD Pharmingen</td><td>555029</td><td></td></tr><tr><td>Cytofix/Cytoperm Kit&nbsp;</td><td>BD Pharmingen</td><td>554714</td><td></td></tr><tr><td>Bright-Glo Luciferase Assay System</td><td>Promega</td><td>e2620</td><td></td></tr><tr><td>Turner Biosystem Luminometer&nbsp;</td><td>Promega</td><td>TD-20/20</td><td></td></tr><tr><td>Leica EM UC6 Mikrotom</td><td>&nbsp; Leica Microsystems</td><td>UC6</td><td></td></tr><tr><td>Novalyphe NL 500 Gefriertrockner</td><td>Savant Instruments</td><td>&nbsp;NL 50</td><td></td></tr><tr><td>Wheaton Fläschchen aus Boroscilicate-Glas</td><td>Wheaton</td><td>&nbsp; VWR 66011-675</td><td></td></tr></tbody></table>

ausdruck der exogene antigene im mycobacterium bovis bcg impfstoff über nicht-genetische oberfläche dekoration mit dem avidin-biotin-system

Expression of Exogenous Antigens in the Mycobacterium bovis BCG Vaccine via Non-genetic Surface Decoration with the Avidin-biotin System

Tuberkulose (TB) ist eine schwere Infektionskrankheit und die einzige verfügbare Impfstoff M. Bovis Bacillus Calmette-Guérin (BCG) ist sicher und wirksam für Schutz gegen Kinder schwere TB Meningitis und einige Formen von disseminierter TB, aber schützt nicht gegen Lungentuberkulose die häufigste Form der Erkrankung ist. Vielversprechende Strategien zur Verbesserung der BCG derzeit verlassen entweder auf ihre Transformation mit Genen Codierung immundominante M. Tuberculosis (Mtb)-spezifische Antigene und/oder Ergänzung mit Genen Codierung Co-Faktoren, die Antigen stimulieren würde Zellen zu präsentieren. Wesentliche Einschränkungen zu diesen Ansätzen zählen geringe Effizienz, geringe Stabilität und das ungewisse Sicherheitsniveau der Expressionsvektoren. In dieser Studie stellen wir einen alternativen Ansatz zur Impfstoff-Verbesserung, bestehend aus BCG Ergänzung mit exogene Proteine auf der Oberfläche der Bakterien, sondern als Transformation mit entsprechenden Gene Kodierung Plasmide. Erstens interessierender Proteine in Verschmelzung mit Monomeren Avidin im standard E. Coli ausgedrückt werden Expressionssysteme und dann verwendet, um die Oberfläche der biotinylierte BCG zu schmücken. Tierversuche mit BCG Oberfläche verziert mit Surrogat Ovalbumin Antigen nachweisen, dass das geänderte Bakterium vollständig immunogen und in der Lage, spezifische T-Zell-Reaktionen induzieren. Insgesamt unterstützen nachdrücklich die hier vorgestellten Daten eine neuartige und effiziente Methode für die Neugestaltung der aktuellen BCG-Impfstoff, die den mühsamen konventionellen Ansatz der Ergänzung durch exogene Nukleinsäuren ersetzt.

Mit den oben beschriebenen allgemeinen Verfahren wurde die Machbarkeit von BCG Oberfläche Biotinylierungen und Dekoration mit Surrogat Antigen Eizellen untersucht. Die Immunogenität der modifizierten BCG war dann in Vivogetestet. Die bakterielle Oberfläche war leicht mit Biotin für schnelle Anzeige der Avidin Chimären Antigene ohne nachweisbaren Veränderungen in bakteriellen Phänotypen gekennzeichnet. Die daraus resultierenden veränderte BCG wird effizient von Antigen-Präsentatio...

Eine neuartige Technik für schnelle Antigen-Anzeige auf eine bakterielle Oberfläche präsentiert, die Oberfläche Biotinylierungen, gefolgt von Exposition gegenüber Proteine des Interesses an Fusion mit Monomeren Avidin beinhaltet. Laden von BCG mit ausgewählten Antigene erfolgreich verbessert seine Immunogenität, was darauf hindeutet, dass Oberflächendekoration traditionelle gentechnische Ansätze ersetzen kann.

Ausdruck der exogene Antigene im Mycobacterium Bovis BCG Impfstoff über nicht-genetische Oberfläche Dekoration mit dem Avidin-Biotin-System

Tuberculosis (TB) is a serious infectious disease and the only available vaccine M. bovis bacillus Calmette-Gu&#233;rin (BCG) is safe and effective for ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Oberflächenproteine auf Mykobakterien unter Verwendung von Oberflächendekoration mit rekombinanten Proteinen als Alternative zu traditionellen, genetisch basierten Ansätzen zu exprimieren. Diese Methoden können helfen, wichtige Forschungsfragen im Bereich der Mykobakteriologie zu beantworten, insbesondere im Bereich der Wechselwirkungen im Krankenhaus und der Impfstoffentwicklungen. Diese Technik kann verwendet werden, um nach potenziellen Störfaktoren oder Antigenkandidaten zu suchen.Es kann schnell mit anspruchsvollen und zeitaufwändigen traditionellen genetisch basierten Ansätzen verglichen werden. Amina Talal, eine wissenschaftliche Mitarbeiterin in meinem Labor, wird dieses Verfahren demonstrieren. Dieser Teil des Protokolls beginnt mit der Umwandlung des P17 Aviden OVA-Plasmids in E.Coli BL21.Dazu werden 250 Milliliter E.Coli BL21-Kultur drei Stunden lang bei 37 Grad Celsius mit IPTG induziert. Nach drei Stunden lysieren Sie die Bakterien, um die Einschlusskörper zu lösen, indem Sie zuerst die induzierte BL21-Kultur pelletieren und den Überstand verwerfen. Dann suspendieren Sie das Pellet wieder in 10 Milliliter Lysepuffer und lassen Sie die Zellen 15 Minuten lang lysieren.Setzen Sie dann die Inkubation bei Raumtemperatur mit einem Rotator zum Rühren fort und lassen Sie sie über Nacht laufen. Zentrifugieren Sie die Mischung morgens eine halbe Stunde lang. Sammeln Sie dann den Überstand mit den löslichen Einschlusskörpern.Als nächstes reinigen Sie die Aviden OVA-Proteine mit einer Nickel-NTA-Säule. Verdünnen Sie zunächst den Überstand ein bis zwei in Lysepuffer und schätzen Sie das Volumen. Bereiten Sie dann eine Säule vor, die vier Milliliter Nickel-NTA-Harz pro 250 Milliliter verdünnten Überstands enthält, und laden Sie die Verdünnung auf die Säule.Waschen Sie die Säule anschließend dreimal mit 10 Millilitern Lysepuffer bei einem pH-Wert von sieben pro Waschgang. Um das rekombinante Protein zu sammeln, waschen Sie die Säule mit Lysepuffer, der Imidazol enthält, und sammeln Sie das Eluat. Wenn Ihr rekombinantes Protein frei von Einschlusskörpern ist, ist das folgende Verfahren für viele Proteine in unserem Labor geeignet.Stellen Sie zunächst den pH-Wert der Rückfaltungslösung so ein, dass er eine Einheit über oder unter dem isoelektrischen Punkt des Proteins liegt. Drehen Sie dann das Protein allmählich vor und verdünnen Sie es auf eine Verdünnung von 1 bis 10 in der Wiederfaltungslösung. Dann inkubieren Sie das Protein auf einem Magnetrührer 30 Minuten lang bei Raumtemperatur, um den Rückfaltungsprozess abzuschließen.Als nächstes werden die gefalteten Proteine mit einem Proteinkonzentrator entsalzt und gepuffert, um sie in PBS umzuwandeln. Anschließend zentrifugieren Sie die Säule und lagern Sie Faulpel mit löslichem Protein bei 20 Grad Celsius. Arbeiten Sie in einer Biosicherheitswerkbank mit persönlicher Schutzausrüstung, da BCG ein Krankheitserreger der Stufe 2 ist.Um die Oberfläche von BCG-Zellen zu biotinylieren, züchten Sie die Zellen zunächst auf einer Shaker-Plattform auf die richtige Dichte. Sammeln Sie etwa eine Milliarde Zellen und waschen Sie sie dreimal mit 500 Mikrolitern eiskaltem, endotoxinfreiem PBST. Schleudern Sie dann die Zellen herunter und suspendieren Sie sie in sterilem, endotoxinfreiem PBS.Bereiten Sie anschließend frisches 10 Millimolar Sulfo-NHSSS-Biotin in sterilem gefiltertem Wasser zu. Dann inkubieren Sie die Bakterien in einem Milliliter Brühe, die 0,5 Millimolar Sulfo-NHSSS-Biotin enthält. Führen Sie die Inkubation 30 Minuten lang bei Raumtemperatur durch.Waschen Sie anschließend die nun markierten Bakterien dreimal mit 500 Mikrolitern eiskaltem PBST, wie zuvor, um das nicht umgesetzte Reagenz zu entfernen. Suspendieren Sie dann das Pellet wieder in einem Milliliter PBST. Um die Biotinylierungseffizienz zu bewerten, wird ein Aloquat von 100 Millionen biotinylierten BCG mit 25 Mikrolitern Strepravidin-FITC gefärbt.Dann inkubieren Sie die gefärbten Bakterien kurz in para-Formaldehyd und messen Sie dann den Grad der Biotinylierung mit Hilfe der Durchflusszytometrie. Nachdem Sie das Wachstum und Überleben der biotinylierten Mykobakterien beurteilt haben, fahren Sie mit der Bindung des Aviden-Fusionsproteins an sie fort. Mischen Sie zunächst 500 Millionen biotinylierte BCGs mit dem Aviden-Fusionsprotein, um eine Endkonzentration von 10 Mikrogramm Protein pro Milliliter zu erreichen.Lassen Sie diese Reaktion eine Stunde lang bei Raumtemperatur auf einem Shaker ablaufen. Anschließend waschen Sie die Bakterien dreimal mit 500 Mikrolitern eiskaltem PBST. Anschließend färben Sie die Bakterien 20 Minuten lang bei Raumtemperatur mit Kaninchen-Anti-Aviden-Antikörpern.Führen Sie nach 20 Minuten einen Waschgang mit 500 Mikrolitern eiskaltem PBST durch. Färben Sie dann die Bakterien mit FITC-konjugiertem Ziegen-Anti-Kaninchen-IGG-Antikörper. Waschen Sie anschließend die Bakterien mit 500 Mikrolitern eiskaltem PBST und analysieren Sie die Bakterien mittels Durchflusszytometrie, um die Oberflächendekoration zu bewerten.Nach Befolgung des beschriebenen Protokolls zeigt die Zytologie, dass es ein minimales Maß an OVA-Bindung an nicht-biotinylierte Bakterien und ein signifikantes Maß an OVA-Bindung an biotinylierte Bakterien gab. Wichtig ist, dass die Aviden OVA-Konzentrationen auf der Bakterienoberfläche einen Monat nach der Lyophilisierung und Lagerung bei Raumtemperatur stabil und nachweisbar blieben. Als nächstes wurden RAW-Zellen und dsRed-Bakterien verwendet, um einen Phagozytose-Assay durchzuführen.Erfreulicherweise gab es keine Abschreckung im Makrophagen-Phänotyp. Um das Schicksal von Aviden OVA-dekorierten BCGs in Makrophagen zu untersuchen, wurden adhärente RAW-Zellen infiziert und mittels Fluoreszenzmikroskopie untersucht. Aviden OVA war nicht nur auf der Bakterienoberfläche vorhanden, sondern auch abgelöst und in das Zytoplasma weit entfernt von den Bakterien translokalisiert.Ein Immuno-Gold-Färbeexperiment zeigte, dass sich Aviden OVA-Antigene von der BCG-Oberfläche lösen, die phagosomale Membran passieren und in Richtung des Zytosols wandern können. Makrophagen, die mit Aviden OVA BCG infiziert waren, zeigten eine Co-Lokalisierung von Avi OVA mit IA-Molekülen. Dies deutet darauf hin, dass sich Aviden-Fusionsproteine ablösen und in Antigenpräsentationskompartimente translozieren, um auf MHC2-Moleküle geladen zu werden.Aviden OVA-Peptide colokalisierten auch mit Klasse-I-Molekülen in BCG-Phagosomen, wie die H2K-Färbung zeigte. Somit besteht die Möglichkeit, dass der Makrophage CD8-positiven T-Zellen das Avi-OVA-Antigen präsentiert. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Proteine in Mykobakterien exprimiert werden, und dieser Organismus ist mit den aktuellen genetischen Methoden schwer zu manipulieren.Nachdem wir die Technik erfolgreich eingesetzt haben, um den Impfstoff mit dem Mykobakterien-Antigen zu beladen, ist bei sechs. Dann zeigten wir, dass die modifizierten Impfstoffe die Möglichkeit boten, sie als spezifische Immunantwort im Mausmodell zu verwenden. Wir arbeiten derzeit mit zusammen, um diesen Ansatz bei Teratin zu erforschen. Wir schlugen vor, BCG zu verwenden, das mit ausgewählten Antigenen oder Immunbulatoren aufgerüstet wurde.

expression-exogenous-antigens-mycobacterium-bovis-bcg-vaccine-via-non

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Wir beschreiben einen alternativen Ansatz, um die Auszählung von...

A Functional Whole Blood Assay zur Rentabilität von Mykobakterien Measure, mit Reporter-Gene BCG oder M. Tb (BCG Tagged Lux / M. Tb Lux)

Dieses Video zeigt die Induktion einer systemischen Entzündung bei einer anästhesierten Maus. Die Injektion von mykobakteriellen Antigen-Adjuvans-Depots löst die Freisetzung von Zytokinen und eine lokalisierte Entzündung aus. Die Lymphgefäße öffnen sich, was den Eintritt von Immunzellen in die Lymphknoten und die Aktivierung von T-Zellen ermöglicht, die entzündungsfördernde Zytokine freisetzen, was zu einer weit verbreiteten Entzündung führt.

Subkutane Injektion von bakteriellem Antigen zur Induktion einer systemischen Entzündung in einem Mausmodell

Dieses Video zeigt die Vorbereitung und Quantifizierung des Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin lux-Inokulums mittels Biolumineszenz-Assay und die Aufzählung von koloniebildenden Einheiten.  Das vorbereitete Inokulum kann für Infektionsstudien verwendet werden.

Vorbereitung und Quantifizierung von Mycobacterium bovis BCG lux Inokulum zur Infektion

Dieses Video demonstriert eine Methode zur Erzeugung von multivalent anzeigenden Impfstoffen mit äußerem Membranvesikel (OMV). Säugetierzellen werden transfiziert, um virale Antigene zu exprimieren und zu sezernieren, die mit einem SpyTag und einem Polyhistidin-Tag fusioniert sind. Diese Antigene werden dann mit einer Nickel-Nitriotriessigsäure (Ni-NTA)-Affinitätssäule aufgereinigt. Das gereinigte Antigen wird mit äußeren Membranvesikeln gemischt, die das oberflächengebundene SpyCatcher...

Erzeugung eines multivalent anzeigenden Impfstoffs gegen äußere Membranvesikel

Das Video zeigt eine Technik zum Laden von Antigenen auf Mycobacterium bovis BCG, um seine immunogenen Eigenschaften zu verbessern. Das Verfahren nutzt das Avidin-Biotin-System, um die Bakterienoberfläche mit exogenen Antigenen zu beschichten.

Eine Avidin-Biotin-Konjugationstechnik zur Präsentation von Zielantigenen auf Mycobacterium bovis BCG

Langzeit-kultivierten Interferon-γ enzymgebundenen immunospot Assay wird als Maß der zentralen Speicher-Antworten verwendet, und korreliert mit Schutz antimykobakteriellen Impfstoff Antworten. Mit diesem Test werden die peripheren mononukleären Blutzellen mit mycobakteriellen Antigene und IL-2 für 14 Tage, so dass die Differenzierung und Expansion des zentralen Gedächtnis-T-Zellen stimuliert.

Anwendung von Langzeit kultiviert Interferon-γ Enzyme-linked Immunospot Assay zur Beurteilung Effektor und Gedächtnis-T-Zell-Antworten in Cattle

Wir beschreiben hier die Methodik, die zum Vergleich der schützenden Wirksamkeit und der Immunantwort der Lunge, die durch intranasale und subkutane Immunisierung mit BCG im Mausmodell induziert wird. Unsere Ergebnisse zeigen die Vorteile der Lungenimpfung und deuten auf eine Rolle der IL17-vermittelten Reaktion beim impfinduzierten Schutz hin.

Die protektive Wirksamkeit und pulmonale Immunantwort nach subkutaner und intranasale BCG Verabreichung an Mäuse

Das vorliegende Protokoll beschreibt das Bioengineering von äußeren Membranvesikeln als "Plug-and-Display"-Impfstoffplattform, einschließlich Produktion, Reinigung, Biokonjugation und Charakterisierung.

Eine "Plug-and-Display"-Nanopartikel-Impfstoffplattform basierend auf äußeren Membranvesikeln mit SARS-CoV-2-Rezeptorbindungsdomäne

Dieses Protokoll beschreibt die Anreicherung nativer mykobakterieller extrazellulärer Vesikel (mEVs) aus axenischen Kulturen von Mycobacterium smegmatis (Msm) und wie mCherry (ein rot fluoreszierender Reporter) enthaltende rekombinante MsmEVs entworfen und angereichert werden können. Schließlich wird der neuartige Ansatz mit der Anreicherung von MsmEVs verifiziert, die das EsxA-Protein von Mycobacterium tuberculosis enthalten.

Anreicherung nativer und rekombinanter extrazellulärer Vesikel von Mykobakterien

In dieser Arbeit stellen wir ein alternatives Protokoll vor, um eine experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis in C57BL/6-Mäusen aktiv zu induzieren, indem wir das immunogene Epitop Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein (MOG)35-55 verwenden, das in einem unvollständigen Freund-Adjuvans suspendiert ist, das die hitzeabgetötete Mycobacterium avium-Subspezies paratuberculosis enthält.

Adjuvante Aktivität von Mycobacterium paratuberculosis bei der Verbesserung der Immunogenität von Autoantigenen während der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis

Die Bestimmung koloniebildender Einheiten (KBE) ist die Goldstandard-Technik zur Quantifizierung von Bakterien, einschließlich Mycobacterium tuberculosis , die Wochen brauchen kann, um sichtbare Kolonien zu bilden. Hier beschreiben wir eine Mikrokbe für die KBE-Bestimmung mit erhöhter Zeiteffizienz, reduziertem Laborplatz und Reagenzienkosten sowie Skalierbarkeit auf Experimente mit mittlerem und hohem Durchsatz.

Mikrokoloniebildender Unit-Assay zur Wirksamkeitsbewertung von Impfstoffen gegen Tuberkulose

Erfahren Sie die Oberflächendekoration von Mycobacterium bovis BCG mit rekombinanten Proteinen als Alternative zu genetischen Methoden. Diese Technik ermöglicht die schnelle Darstellung von Antigenen für die Impfstoffentwicklung.

Ausdruck der exogene Antigene im Mycobacterium Bovis BCG Impfstoff über nicht-genetische Oberfläche Dekoration mit dem Avidin-Biotin-System (Video) | JoVE Journal

Ausdruck der exogene Antigene im Mycobacterium Bovis BCG Impfstoff über nicht-genetische Oberfläche Dekoration mit dem Avidin-Biotin-System

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