Bestimmung genomweite Transkript Verfall Tarife im wuchernden und ruhenden menschlichen Fibroblasten

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Zerfallsraten des Transkripts in proliferierenden und ruhenden Fibroblasten zu überwachen. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Molekularbiologie zu beantworten, z. B. ob Veränderungen in der Genexpression aus Änderungen der Transkriptzerfallsrate resultieren. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie Informationen über die Transkriptionsrate und nicht nur über die Transkripthäufigkeit liefert.

Um das Protokoll zu beginnen, etablieren Sie proliferierende und ruhende Kulturen von Fibroblasten. Proliferierende Fibroblasten sollten regelmäßig trypsinisiert werden. Ruhekulturen können etabliert werden, indem die Platten mit regelmäßigen Mediumwechseln zusammenfließen.

Geben Sie ActD 150 Mikroliter in das vorgewärmte Medium 10 Milliliter für alle biologisch replizierten Zellkulturplatten. Geben Sie ActD in einer Konzentration von 15 Mikrogramm pro Milliliter Medium zu. Mischen Sie die Lösung gut.

Aspirieren Sie das alte Medium und fügen Sie den Zellen ActD-haltiges Medium hinzu. Um die Nullpunktprobe zu entnehmen, saugen Sie das ActD-Medium vorsichtig ab und pipettieren Sie zwischen fünf und 10 Milliliter vorgewärmtes PBS auf eine 100-Millimeter-Platte, fünf Milliliter Lösung für eine 100-Millimeter-Platte, zwei Milliliter für eine Vertiefung einer Sechs-Well-Platte und einen Milliliter für eine Vertiefung einer 12-Well-Platte. Saugen Sie das PBS vorsichtig an.

Geben Sie dann die Phenol-Guanidin-Isothiocyanat-Lösung direkt auf die Gewebekulturplatte. Pipettieren Sie das Zellgemisch aus Phenol-Guanidin-Isothiocyanat-Lösung mehrmals auf und ab, um eine homogene Mischung zu erhalten. Erfassen Sie jeden Zeitpunkt, nachdem die entsprechende Zeitspanne abgelaufen ist, indem Sie die zuvor beschriebene Methode verwenden.

Inkubieren Sie die Proben fünf Minuten lang bei Raumtemperatur, um die vollständige Auflösung der RNA-Proteinkomplexe sicherzustellen. Führen Sie als Nächstes kontrollierte Spike-in-Transkripte ein, die mit der verwendeten Methodik nachgewiesen werden können. Führen Sie diese Kontrollen in jeder Probe in einer bekannten Menge und Konzentration ein.

Übertragen Sie das Phenylguanidin-Isothiocyanat-Lösungsgemisch mit einer Pipette in ein 2,0-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Fügen Sie dann 0,2 Milliliter Chloroform zur Phenylguanidin-Isothiocyanat-Lösungsmischung für jeden Milliliter verwendeter Phenylguanidin-Isothiocyanat-Lösung hinzu. Schütteln Sie das Mikrozentrifugenröhrchen 15 Sekunden lang kräftig und inkubieren Sie dann das Chloroform-Phenylguanidin-Isothiocyanat.

Nach der Inkubation werden die Proben 20 Minuten lang bei vier Grad Celsius bei 12.000 g geschleudert. Die Probe sollte sich in drei Schichten aufteilen. Übertragen Sie die wässrige Schicht mit einer Mikropipette in ein neues 2,0-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und achten Sie darauf, die Zwischenphase während dieses Prozesses nicht zu stören.

Die Interphasen- und organischen Fraktionen sind zu verwerfen. Geben Sie dann ein gleiches Volumen 2-Propanol zur wässrigen Fraktion und drehen Sie das Röhrchen 10 Mal um. Fügen Sie bis zu einem Mikroliter 20 Milligramm pro Milliliter wässrigem Glykogen pro 20 Mikroliter Probe hinzu, insbesondere wenn eine geringe Ausbeute erwartet wird.

Inkubieren Sie die Proben 10 Minuten lang bei Raumtemperatur. Nach der Inkubation drehen Sie die Proben. Stellen Sie sicher, dass die RNA am Ende des Spins ausgefällt wurde, um ein While-Pellet am Boden des Röhrchens zu bilden.

Entfernen und entsorgen Sie den Überstand mit einer Pipette, wobei Sie besonders darauf achten müssen, das weiße RNA-Kügelchen nicht zu stören. Fügen Sie einen Milliliter 75%iges Ethanol pro Milliliter Phenylguanidin-Isothiocyanat-Lösungsreagenz hinzu, um das Pellet zu waschen. Die Proben 10 Minuten lang bei 12.000 g schleudern.

Nachdem Sie den größten Teil des Überstands entfernt haben, verwenden Sie eine Pipette, um so viel Ethanol wie möglich zu entfernen, aber stören Sie das Pellet nicht. Schleudert die Proben, um das überschüssige Ethanol zu pelletieren. Das RNA-Kügelchen ist in diesem Schritt weniger kompakt und neigt dazu, sich zu bewegen.

Entfernen Sie nach dem Schleudern alles überschüssige Ethanol aus der Tube, ohne das Pellet zu stören. Lassen Sie das RNA-Pellet fünf Minuten lang an der Luft trocknen. Geben Sie 50 Mikroliter nukleasefreies Wasser in das RNA-Pellet und resuspendieren Sie das Pellet in nukleasefreiem Wasser.

Behandeln Sie die Proben von einem Mikroliter Deanase, um DNA zu entfernen, und inaktivieren Sie dann die Deanase und die Kationen. Lagern Sie die RNA-Proben in 2,0-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen bei minus 80 Grad Celsius. Quantifizieren Sie die RNA und überprüfen Sie die RNA mit einem Spektralphotometer auf Reinheit.

Nach der Überprüfung der Reinheit wird die RNA mit einem 1%Agarose-Gel analysiert, um das Ausmaß des Abbaus sichtbar zu machen. Zwei klare Banden, die 18S- und 28S-rRNA darstellen, sollten deutlich sichtbar sein. Wenn diese Banden nicht sichtbar sind, kann die RNA abgebaut werden.

Überwachen Sie als Nächstes die Transkripthäufigkeit in den gesammelten RNA-Aliquoten im Vergleich zum internen Spike-in-Standard mithilfe von Real-Time qPCR. Microarrays, RNA-Sequenzierung oder Northern Blots können ebenfalls verwendet werden. Die Fluoreszenzintensitäten über die Zeit entsprechen der Genexpression.

Während Fibroblasten kontakthemmt werden, wird das transkriptkodierende Kollagen 3A1, ein sehr wichtiges Gen für die Bildung der extrazellulären Matrix, das während der Wundheilung abgelagert wird, stabiler und zerfällt nicht so schnell. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Phenol äußerst gefährlich sein kann und es wichtig ist, dass es nicht mit Ihrer Haut in Berührung kommt. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Transkriptzerfallsraten in proliferierenden und ruhenden Fibroblasten überwachen können.

Veränderungen der Transkriptzerfallsrate können ein wichtiger Mechanismus der Gentriangulation sein.