Name: Bestimmung genomweite Transkript Verfall Tarife im wuchernden und ruhenden menschlichen Fibroblasten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie Transkript-Abbauraten in proliferierenden und ruhenden menschlichen Fibroblasten bestimmen. Diese Methode ermöglicht die Unterscheidung zwischen Transkriptabundanz und -stabilität.

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HAC war der Milton E. Cassel Gelehrte von der Rita Allen Foundation (http://www.ritaallenfoundation.org). Diese Arbeit wurde finanziert durch Zuschüsse zu HAC vom National Institute of General Medical Sciences Center Excellence Grant P50 GM071508 (p.i. David Botstein), PhRMA Foundation Grant 2007RSGl9572, National Science Foundation Grant OCI-1047879, David August, National Institute of General Medical Sciences R01 GM081686, Nationales Institut der allgemeinen medizinischen Wissenschaften R01 GM0866465, die Eli &#38; Edythe breit Zentrum für Regenerative Medizin &#38; Forschung an Stammzellen, die Iris Cantor Frauen Gesundheitszentrum/UCLA CTSI NIH Grant UL1TR000124, und die Leukämie-Lymphom-Gesellschaft. Forschung berichtet in dieser Publikation wurde von der National Cancer Institute der National Institutes of Health unter Preis Anzahl P50CA092131 unterstützt. Die Geldgeber hatten keine Rolle beim Studiendesign, Datenerhebung und Analyse, Entscheidung, zu veröffentlichen oder der Manuskripterstellung. HAC ist Mitglied der Eli &#38; Edythe breite Zentrum für Regenerationsmedizin &#38; Stem Cell Research, dem UCLA-Molekularbiologie-Institut und der UCLA Bioinformatik ressortübergreifenden Programm.

Alle beschriebenen Experimente stimmten institutionelle Review Boards an der Princeton University und der University of California, Los Angeles.
1. bereiten Sie wuchernde und Kontakt gehemmt Fibroblasten für ActD zeitlicher Verlauf
Hinweis: Dieses Protokoll verwendet eine Timecourse mit vier Zeitpunkte. Drei biologisch unabhängige Stichproben können pro Timepoint gesammelt werden, durch das Sammeln von verschiedenen Gewebekultur Platten in einem Experiment, oder das Experiment kann mehrere Male mit unterschiedlichen Kulturen der Zellen wiederholt werden. Nach unserer Erfahrung bietet eine 10 cm (Durchmesser) Gewebekultur Teller (ein Teller) ausreichend RNA für die Analyse. Bei Bedarf können mehrere Gewebekultur Gerichte für jede Probe, die Zahl der Zellen in jedem Timepoint gebündelt. Darüber hinaus kann das gleiche Experiment durchgeführt werden, mit Fibroblasten aus verschiedenen Individuen isoliert, da wirklich unabhängige biologische repliziert.
<ol>
	<li>Proliferierende und ruhende Kulturen der Zellen für die Mitschrift Verfall Analyse zu etablieren. Teilen Sie für wuchernden Zellen die Zellen alle drei Tage während der Kontakt gehemmt Zellen Kontakt gehemmt werden.
	<ol>
		<li>Verändern Sie das Medium für die Kontakt-gehemmt Zellen alle 2 Tage für 7 Tage. Aufteilen der proliferierenden Zellen 2 Tage, bevor die Kontakt gehemmt Fibroblasten zur Abholung bereit ist. Ein Beispiel für eine Zelle-Kultur-Schema ist in Abbildung 1dargestellt. Die verbleibenden Schritte in diesem Abschnitt bieten ein detailliertes Protokoll für die Einrichtung und Aufteilung der Zellen.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Primäre dermale Fibroblasten von Neugeborenen Haut nach etablierte Protokolle13zu isolieren. Durchgang Fibroblasten um eine homogene Bevölkerung zu gewährleisten. Hinweis: Fibroblasten können eingefroren und wieder aufgetaut, wenn nötig.</li>
	<li>Auftauen oder Fibroblasten, replate, wenn nötig. Wachsen Sie Fibroblasten in DMEM mit 10 % Serum unter sterilen Bedingungen in einer Gewebekultur Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO2. Verwenden Sie die Fibroblasten, die für weniger als 10 Passagen angebaut wurden. Fibroblasten soll &#60; 80 % Zusammenfluss am Tag der Teilung Zellen, wuchernde und ruhende Bevölkerungen zu machen.</li>
	<li>In einer Gewebekultur-Platte in mehrere Platten, prewarm PBS, Trypsin und Medium mit Serum in einem 37 ° C Wasserbad 20 Minuten aufgeteilt.</li>
	<li>Aspirieren Sie oder verwenden Sie ein Pipettieren jede Gewebekultur-Platte mit Zellen, formulierte werden das Medium entfernt.</li>
	<li>Pipettieren warm PBS auf jede Platte (10 mL der Lösung für ein 150 mm Platte, 5 mL der Lösung für eine 100 mm-Platte, 2 mL für einen Brunnen von einem 6-well-Platte) und 1 mL für einen Brunnen von einem 12-well-Platte.</li>
	<li>Absaugen oder pipettieren, PBS aus jeder Gewebekultur-Platte zu entfernen.</li>
	<li>Sanft Pipettieren 1 x Trypsin-EDTA auf jede Platte (8 mL Lösung für einen 150 mm Teller, 3 mL der Lösung für eine 100 mm-Platte, 2 mL für einen Brunnen von einem 6-well-Platte und 1 mL für einen Brunnen von einem 12-well-Platte). Hinweis: Stellen Sie 1 x Trypsin-EDTA durch Verdünnung steril 10 x Trypsin-EDTA in sterilen PBS. Die letzte 1 X Lösung sollte 0,05 % Trypsin und 0,02 % EDTA.</li>
	<li>Inkubieren Sie Trypsin mit Zellen für 5 min.</li>
	<li>Klopfen Sie leicht die Platte, um Zellen von der Platte zu verdrängen.</li>
	<li>Pipettieren, Zellen in eine einzelne Zelle Suspension aufzuwirbeln.</li>
	<li>Übertragen Sie Zellen in Trypsin-Lösung auf eine konische Rohr mit dem gleichen Volumen DMEM mit 10 % Serum (8 mL Lösung für einen 150 mm Teller, 3 mL der Lösung für eine 100 mm-Platte, 2 mL für einen Brunnen von einem 6-well-Platte und 1 mL für einen Brunnen einer 12 gut Platte).</li>
	<li>Spin-down Zellen bei 4 ° C für 5 min bei 1000 X g , Trypsin zu entfernen.</li>
	<li>Aufschwemmen Sie Zellen in einem entsprechenden Volumen des Mediums und zählen mit einer Hemacytometer Zelle Konzentration bestimmt.</li>
	<li>Samen 5 x 105 Zellen pro 100 mm Gewebekultur Platte für wuchernden und Kontakt-gehemmt.</li>
	<li>Mit dieser Methode zu etablieren die wuchernden und Kontakt gehemmt Proben für Analyse (Abbildung 1) erforderlich.</li>
</ol>
(2) ActD zeitlicher Verlauf
<ol>
	<li>Aufschwemmen Sie ActD in ein Lager Konzentration von 1 mg/mL (für 1 mg des ActD, Einsatz 950 µL steriler PBS und 50 µL steriler DMSO). Hinweis: Gefrorene Stammlösungen ActD sollte stabil für einen Monat bei-20 ° c sein Verdünnte Lösungen sollten verworfen und nicht zur weiteren Verwendung gespeichert werden.</li>
	<li>Das entsprechende Volumen der vorgewärmte Medium ActD hinzufügen, für alle biologischen replizieren Zellkultur-Platten wurden für die 0, 120, 240 und 480 min Zeitpunkte (Abbildung 2) eingerichtet. ActD in einer Konzentration von 15 µg pro mL Medium hinzufügen. Mischen Sie gut, aspirieren Sie das alte Medium, und die Zellen fügen Sie ActD-haltigen Medium hinzu.
	<ol>
		<li>Für eine 1 mg/mL Brühe hinzufügen 15 µL ActD für jedes mL Medium, z. B.für 10 mL Medium für eine 100 mm-Platte hinzufügen 150 µL ActD.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Die Null Timepoint Probe sammeln, sanft aus dem ActD Medium und Pipettieren Aspirieren vorgewärmt PBS auf die Zellen. Pipettieren 10 mL der Lösung für ein 150 mm-Platte, 5 mL der Lösung für eine 100 mm-Platte, 2 mL für einen Brunnen von einem 6-well-Platte und 1 mL für einen Brunnen von einem 12-well-Platte.</li>
	<li>Aspirieren Sie sanft oder Pipettieren von PBS. Hinweis: Alle Schritte mit RNA Isolierung sollte mit RNase-freies Wasser, RNase-freie Mikrozentrifugenröhrchen und RNase-freie Pipetten durchgeführt werden. Handschuhe sollten getragen und verändert oft beim Arbeiten mit RNA.</li>
	<li>Fügen Sie Phenol-Guanidin-Herstellung-Lösung (1 mL/10-cm-Platte mit 4 x 105 4 x 107 Zellen) direkt in der Gewebekultur-Platte. Hinweis: Phenol-Guanidin erfolgt ist eine monophasische Lösung, die RNS-Qualität hält während der Lyse der Zellen und DNA, RNA und Protein voneinander zu trennen. Achtung: Phenol und Guanidin Herstellung sind korrosiv. Verwenden Sie geeignete Schutzmaßnahmen.</li>
	<li>Pipettieren der Phenol-Guanidin erfolgt Lösungszelle Gemisch nach oben und unten mehrmals, um eine homogene Mischung zu machen. Hinweis: Phenol-Guanidin erfolgt Lösung lysate kann bei 4 ° C über Nacht oder bei-20 ° C bis zu einem Jahr aufbewahrt werden.</li>
	<li>Sammeln Sie jeden Zeitpunkt, nachdem die entsprechende Menge an Zeit vergangen ist in Schritte 2.3-2.6 beschriebene Methode verwenden.</li>
</ol>
3. Isolation von Gesamt-RNS von Phenol-Guanidin erfolgt Lösung Lysate
<ol>
	<li>Inkubieren Sie Proben bei Raumtemperatur für 5 min um die vollständige Auflösung der RNA-Protein-komplexe zu gewährleisten. Hinweis: Die Schritte des Protokolls Phenol-Guanidin erfolgt Lösung können bei Raumtemperatur durchgeführt werden, sofern nicht anders angegeben.</li>
	<li>Stellen Sie Spike-Steuerelement-Transkripte, die mit der Methodik erkannt werden können.</li></ol>Führen Sie diese Steuerelemente in jede Probe in einer bekannten Menge und Konzentration. Hinweis: Die externen RNA Kontrolle Konsortium (ERCC) Spike-Steuerelement Mischung14 hat als ein Spike-Steuerelement RNA-FF wurde speziell für Es kann auch für Nordflecken oder Echtzeit-qPCR verwendet werden. Spike-in Steuerungen speziell für Microarray Technologien sind auch erhältlich (siehe Tabelle der Materialien).
	<li>Übertragen Sie die Phenol-Guanidin erfolgt Lösung Mischung zu einem 2,0 mL Microcentrifuge Schlauch mit einer Pipette. Die Phenol-Guanidin erfolgt Lösung Mischung für jeden 1 mL der Phenol-Guanidin Herstellung eingesetzte Lösung 0,2 mL Chloroform hinzufügen (z. B.0,3 mL Chloroform zu 1,5 mL Phenol-Guanidin erfolgt Lösung Mischung hinzufügen).</li>
	<li>Schütteln Sie den Microcentrifuge Schlauch kräftig für 15 s und dann Mischung Chloroform-Phenol-Guanidin erfolgt bei Raumtemperatur 3 min inkubieren.</li>
	<li>Spin-Proben bei 12.000 X g 20 min bei 4 ° C. Hinweis: Nach der ersten Spin, sollte die Probe in 3 Schichten - eine rote organischen Schicht auf der Unterseite, ein weiß/rosa Interphase in der Mitte und einer klaren wässrigen Schicht auf der Oberseite (Abbildung 3) trennen.</li>
	<li>Übertragen Sie die wässrige Schicht auf einen neuen 2,0 mL Microcentrifuge Schlauch mit einer Mikropipette. Hinweis: Achten Sie darauf, die Defiant während dieses Prozesses zu stören. Es ist okay, einige der wässrigen Fraktion zu verlassen. Es ist besser, einige der wässrigen Fraktion zu verlassen, als auch einige der Interphase Schichten, als auch die Interphase ausgedehnt Schicht die RNA mit DNA verunreinigen würde. Die wässrige Schicht werden die Hälfte des ursprünglichen Volumens, also etwa 0,9 mL etwa, wenn die Phenol-Guanidin erfolgt Lösung/Chloroform Mischung 1,8 mL war.</li>
	<li>Entsorgen Sie die Interphase und organischen Fraktionen.</li>
	<li>Der wässrige Anteil ein gleiches Volumen von 2-Propanol hinzu und invertieren Sie die Röhre 10 Mal. Fügen Sie bis zu 1 µL 20 mg/mL wässrige Lösung von Glykogen pro 20 µL der Probe, vor allem, wenn die Ausbeute wird voraussichtlich niedriger sein, weil weniger als 106 Zellen gesammelt wurden. Hinweis: Dadurch wird eine Dichte, feste Pellet, das einfach nach den Spin-Schritten zu überwachen, die Folgen.</li>
	<li>Inkubieren Sie Proben bei Raumtemperatur für 10 min.</li>
	<li>Spin-Proben bei 12.000 X g 20 min bei 4 ° C. Sicherstellen Sie, dass am Ende dieser Runde, die RNA ausgefällt hat, um einen weißen Pellet am unteren Ende der Röhre bilden.</li>
	<li>Entfernen Sie mit einer Pipette und entsorgen Sie des Überstands besondere Sorgfalt nicht zu stören das weiße RNA-Pellet. Hinweis: Eine lose Pipettieren Spitze in der hand gehalten kann verwendet werden, um überschüssige Ethanol zu entfernen. Wenn die RNA-Pellet ist gestört, aber nicht verworfen, kann der Prüfer wiederholen Sie den Spin und überstand wieder entfernen. Vermeiden Sie verwerfen das Pellet, bedarf dies die Ermittler, den gesamten Vorgang wiederholen.</li>
	<li>Bereiten Sie eine Lösung von 75 % Ethanol und 25 % Nuklease-freies Wasser. Fügen Sie 1 mL 75 % Ethanol pro 1 mL der Phenol-Guanidin erfolgt Lösung Reagenz, das Pellet zu waschen.</li>
	<li>Spin-Proben bei 12.000 X g für 10 min bei 4 ° C.</li>
	<li>Nach dem entfernen die meisten des Überstands, verwenden Sie ein pipettieren, um so viel Ethanol wie möglich zu entfernen, während noch kümmert sich nicht um die Pellets zu stören. Hinweis: Die RNA-Pellet ist bei diesem Schritt weniger kompakt und neigt zu bewegen. Seien Sie besonders vorsichtig beim Umgang mit der Pellets zu diesem Zeitpunkt nicht zu verlieren die RNA.</li>
	<li>Drehen Sie Proben 12.000 X g für 2 min bei Raumtemperatur zu Pellets alle überschüssige Ethanol.</li>
	<li>Entfernen Sie alle überschüssige Ethanol aus dem Rohr mit einer Mikropipette kümmert sich um das Diabolo nicht zu stören.</li>
	<li>Lassen Sie die RNA-Pellet-Luft für 5 min trocknen.</li>
	<li>Die RNA-Pellet 50 µL Nuklease-freies Wasser hinzu und Aufschwemmen Sie das Pellet in der Nuklease-freies Wasser.</li>
	<li>Behandlung von Proben mit 1 µL DNase (2 Einheiten/µL), DNA zu entfernen und dann inaktivieren DNase und kationen (siehe Tabelle der Materialien).</li>
	<li>RNA-Proben in 2,0 mL Mikrozentrifugenröhrchen bei-80 ° c aufbewahren</li>

4. Analyse der Abschrift Fülle
<ol>
	<li>Quantifizieren Sie, RNA und prüfen Sie RNA auf Reinheit mit einem Spektralphotometer. Hinweis: Das Verhältnis der Absorption bei 260 nm, 280 nm sollte ungefähr 2.0 für RNA.</li>
	<li>Analysieren Sie RNA mit einer 1 % Agarosegel oder eine gleichwertige Technologie, das Ausmaß der Schädigung zu visualisieren. Hinweis: Zwei klare Bands vertreten 18 s und 28 s rRNA sollte deutlich sichtbar (Abbildung 4). Wenn diese Bänder nicht sichtbar sind, kann die RNA beeinträchtigt werden. Trouble shooting Tipps für RNA-Abbau sind in der Diskussion zur Verfügung gestellt.</li>
	<li>Northern blots18oder Monitor Transkript Fülle in den gesammelten Aliquote RNA verglichen mit Pfennigabsatz in internen Standards mittels Microarrays15, RNA-Seq16, Echtzeit-qPCR17.
	<ol>
		<li>Bestimmen Sie die Hülle und Fülle für jedes Protokoll zu jedem Zeitpunkt im Vergleich mit einer Steuerung versetzt-in der bekannten Fülle. Hinweis: Für Microarrays werden die Werte Fluoreszenz-Intensitäten. Für Nordflecken können Bands auf dem Röntgenfilm quantifiziert werden. Für Echtzeit-qPCR kann durch Vergleich mit bekannten Standards mit der 2- σσC-T -Methode19Transkript Fülle bestimmt werden. Für RNA-Seq können als FPKM oder Fragmente pro Kilobase Exon pro million liest abgebildet normalisierte Werte ermittelt werden. Isoform-spezifische Verfall Preise können mit Isoform bewusst Methoden wie DEXSeq20RNA-Seq-Daten analysiert werden. Isoform-spezifische Verfall Preise richten sich am besten mit RNA-seq. Wenn sie mit Microarray Daten ermittelt werden sollen, müssen die Daten auf einer Sonde durch die Sonde Basis anstatt einer gen durch gen-Basis analysiert werden. Die Analyst muss bei der Interpretation der Informationen aus einer begrenzten Anzahl von Sonden aufpassen. Z. B. möglicherweise höchstens 5 Sonden, die über eine bestimmte Isoform informativ sind. In diesem Fall wird die Analyst benötigen, um festzustellen, ob das Verhalten von diese Sonden hinreichend konsistent ist, damit die Ergebnisse zuverlässig sind.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Führen Sie in Echtzeit qPCR auf der isolierten RNA17 in den gesammelten Proben analysieren rasch verfallenden Gene, wie c-Myc und ein langsam verfallenden gen wie GAPDH, Vertrauen zu gewinnen das Transkript-Zerfall, die Preise genau erfasst wurden. Hinweis: Für weitere Bestätigung Echtzeit qPCR Isoform-spezifischen Sonden können entwickelt und verwendet, um die Fülle an spezifische Isoformen über Zeit21überwachen.</li>
</ol>
5.Konstante Tariffindung Verfall
<ol>
	<li>Für jede Timepoint Log-Transformation die Fülle Werte für jedes Protokoll (Gen-spezifische oder Isoform-spezifisch). Hinweis: Log-Transformation werden die Werte exponentiellen Zerfall Kurven Linien konvertieren, die mit einem linearen Verfall Modell22passen können.</li>
	<li>Passen Sie der Ausdruck Profil für jedes Protokoll (Gen-spezifische oder Isoform-spezifische) zu einem linearen Verfall Modell. Die Formel für ein solches Modell ist f(t) = C - R * t. In dieser Gleichung C ist eine konstante, die eine Abschrift des Ausgangsbetrags darstellt, R ist der Rückgang und t ist die Zeit seit Beginn des Experiments. Aus dieser Gleichung bestimmen die Zerfallsrate als r*ln(10) (siehe Referenz-11). Hinweis: Die MaSigPro-Software-Paket ist eine Regression basierenden Ansatz entwickelt, um signifikante gen Ausdruck Profil Unterschiede in Zeit Kurs Daten23erkennen. Beispielcode und Ergebnisse für die MaSigPro stehen an: https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/maSigPro/inst/doc/maSigProUsersGuide.pdf.</li>
	<li>Gene, die eine Log-lineare Verfall Modellanpassung nicht herausfiltern. Dies kann mit einem ANOVA F-Test erreicht werden. Hinweis: der F-Test basiert auf der F-Statistik, definiert als die Variation zwischen Probe dividiert durch die Variation innerhalb der Proben. Korrigieren Sie die p-Werte für multiple Vergleiche durch die Anwendung der linearen step-up Benjamini und Hochberg false Discovery Verfahren24. Ein Q-Wert größer als 0,05 mit dem F-Test als eine Abkürzung für Gene verwendet werden kann, die kein Log-lineare Verfall Modell passen.</li>
	<li>Führen Sie einen ANOVA F-Test um Abschriften mit eine signifikante Wechselwirkung Laufzeit zwischen einem kategorischen Zellzyklus Zustand und die Zeit zu bestimmen (false Discovery Rate, FDR &#60; 0,05).</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben keine Interessenskonflikte offenzulegen.

Stille kann durch externe Signale einschließlich Rücknahme Mitogene oder Serum, mangelnde Zelladhäsion und Kontakt Hemmung induziert werden. Kontakt-Hemmung, einer von mehreren möglichen Methoden zur Induktion der Ruhe, ist ein höchst evolutionär konservierte Prozess in dem Zellen der proliferativen Zellzyklus in Reaktion auf Zell-Zell-Kontakt beenden. Wir konzentrieren uns hier auf Kontakt Hemmung als Beispiel für eine Methode, um Ruhe zu induzieren. Frühere Studien haben berichtet, dass Zell-Zell-Kontakt MicroRNA Bioge...

Steady-State widerspiegeln Protokolle den Beitrag der Abschrift Synthese und Transkript Verfall. Reguliert und koordiniert Transkript Zerfall ist ein wichtiger Mechanismus zur Steuerung von biologischen Prozessen1,2,3,4. Zum Beispiel wurden Transkript Verfall Preise gezeigt beizutragen, die zeitliche Abfolge der Ereignisse, die nach Aktivierung durch inflammatorische Zytokin Tumor-Nekrose-Faktor5.
Wir haben bisher gezeigt, dass der Übergang zwischen Verbreitung und Ruhe im primären menschlichen Fibroblasten mit Veränderungen in der Abschrift von vielen Genen6verbunden ist. Einige dieser Änderungen spiegeln Unterschiede in der Aktivität von Transkriptionsfaktoren zwischen diesen beiden Zuständen.
Änderungen in eine Abschrift Zerfallsrate können auch zu Änderungen bei der Ausdruck eine Abschrift in zwei verschiedenen Staaten7,8beitragen. Basierend auf unserer früheren Feststellungen, dass der Übergang zwischen Verbreitung und Ruhe verbunden mit Veränderungen in der Höhe von mehreren RNAs9wir gefragt, ob es auch ein Beitrag von differenziellen Transkript Verfall in der Veränderung ist Genexpression in versus Ruhestrom Fibroblasten vermehren.
Um die Abschrift Stabilität zu überwachen, haben wir die Rate des Zerfalls der Transkripte genomweite in versus ruhenden Zellen wuchern festgestellt. Um dies zu erreichen, überwachen wir Verfall Preise im wuchernden versus Ruhestrom Fibroblasten durch die Einführung eines Inhibitors der neue Transkription und Überwachung die Rate an die einzelnen Protokolle im Laufe der Zeit verschwunden. Der Vorteil dieses Ansatzes ist, dass im Vergleich zu Methoden, die einfach insgesamt Genexpression, überwachen, indem Sie neue Transkript-Synthese hemmen, werden wir in der Lage die Zerfallsrate für diese Protokolle getrennt von der Rate, mit der sie bestimmen transkribiert.
ActD Behandlung neue Transkription hemmen und Transkript Verfall Preise bestimmen wurde erfolgreich in mehreren früheren Studien angewendet. ActD wurde zur sezieren der Bedeutungdes der RNA-Stabilität in die Änderungen in Hülle und Fülle der Niederschrift, die von einer Behandlung mit Pro-inflammatorischen Zytokinen5ergeben. Ein ähnlicher Ansatz hat auch zur sezieren die Unterschiede im Transkript Zerfallsrate in versus differenzierten C2C12 Zellen wuchern, wie sie eine differenzierte Muskel Phänotyp10annehmen. Als weiteres Beispiel globale mRNA Halbwertszeiten auch in pluripotente erkannt wurden und differenzierte Maus embryonale Stammzellen-11. In diesen Beispielen nachweislich die mRNA Decay für die Regulierung der Abschrift Fülle und für den Übergang von Zellen in andere Zelle Staaten von Bedeutung sein.
Die nachfolgend beschriebenen Methoden anwenden, entdeckten wir Steuersatzänderungen Transkript Zerfall in ungefähr 500 Gene beim Vergleich von Fibroblasten in proliferierende und ruhende Staaten12. Insbesondere, entdeckten wir, dass die Ziele der MicroRNA MiR-29, die in ruhenden Zellen herunterreguliert, stabilisiert werden, wenn Zellen in Ruhe übergehen. Wir beschreiben hier die Methode verwendeten wir Zerfall in proliferierende und ruhende Zellen zu bestimmen. Diese Methode eignet sich für Zinsprodukten mRNA Zerfall in zwei unterschiedliche, aber ähnliche Bedingungen zu vergleichen, wenn Informationen über rasch verfallenden Genen gesucht wird. Es könnte auch verwendet werden, andere Fragen wie die Wirkung der Zelle Kulturbedingungen auf Transkript Zerfall, zum Beispiel in zweidimensional im Vergleich zu drei dimensionale Kulturen anzusprechen. Decay Rate können bestimmt genomweite mit Methoden wie Microarrays oder RNA-FF alternativ in Echtzeit qPCR oder Nordbeflecken kann verwendet werden, um Verfall auf gen-durch-gen oder Isoform von Isoform Basis zu bestimmen. Diese Sätze können dann verwendet werden, um die Halbwertszeit von jedem überwachten gen zu berechnen und Gene mit Verfall zu identifizieren, die in zwei Bedingungen unterschiedlich sind.

<table><tbody><tr><td>Zentrifugen für Mikrozentrifugenröhrchen mit einer Kapazität von 12.000 x g und 4°; C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ausrüstung zum Verarbeiten von Agarose-Gelen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterile Gewebekulturplatten und konische Röhrchen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>Life Technologies</td><td>11965-118</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>VWR</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Sterile serologische Pipetten, Pipettieren und Pipettenspitzen für die Gewebekultur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Einzeln verpackte, Rnasefreie Einwegpipetten, Pipettenspitzen und Röhrchen für die RNA-Isolierung und -Analyse</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Einweghandschuhe zum Tragen beim Umgang mit Reagenzien und RNA-Proben</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap</td><td>Invitrogen</td><td>AM9780</td><td>Zur Dekontamination von Arbeitsoberflächen aus RNase</td></tr><tr><td>2,0 ml Eppendorf-Röhrchen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA&nbsp; Lösung 10X</td><td>Millipore Sigma</td><td>9002-07-07</td><td></td></tr><tr><td>Steriles PBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Actinomycin D</td><td>Millipore Sigma</td><td>A1410-2 mg</td><td>hemmt die Transkription</td></tr><tr><td>Steriles DMSO</td><td>Fisher Scientific</td><td>31-761-00ML</td><td>Lösungsmittel für Actinomycin D</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Thermo Fisher</td><td>Scientific ICN19400225</td><td>MP Biomedicals, Inc Produkt</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2618500</td><td>molekularbiologisches</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP28184</td><td>molekularbiologisches</td></tr><tr><td>RNasefreies Glykogen (20 mg/ml wässrige Lösung)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0551</td><td>Träger für die RNA-Fällung</td></tr><tr><td>TURBO DNA-free Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM1907</td><td>entfernt DNA mit DNase und inaktiviert dann in einem nachfolgenden Schritt&nbsp; inaktiviert DNA und entfernt zweiwertige Kationen</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ICN820721</td><td>MP Biomedicals, Inc Produkt</td></tr><tr><td>Ladefarbstoff für RNA-Gel</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0641</td><td>auch für denaturierende Elektrophorese</td></tr><tr><td>geeignet Millenium RNA-Marker</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM7150</td><td>RNA-Leiter</td></tr><tr><td>Einfarbige RNA-Spike-in-Kit</td><td>Agilent Technology</td><td>5188-5282</td><td>Beispiel für eine Spike-in-Kontrolle für die Agient-Microarray-Analyse</td></tr><tr><td>Tris-Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td>Molekularbiologie-Qualität, für TAE-Puffer</td></tr><tr><td>Eisessig</td><td>Fisher Scientific</td><td>A38-500</td><td>für TAE-Puffer</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP120-500</td><td>Elektrophorese-Qualität, für Gele</td></tr><tr><td>Ethidiumbromid</td><td>Millipore Sigma</td><td>E7637</td><td>für die Molekularbiologie</td></tr><tr><td>External RNA Controls Consortium RNA Spike-in Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4456740</td><td>Spike-in-Kontrolle für RNA Seq</td></tr><tr><td>TruSeq Stranded mRNA Library Preparation Kit A (48 Proben, 12 Indexe)</td><td>Illumina</td><td>RS-122-2101</td><td>für RNA Seq</td></tr><tr><td>96-Well-PCR-Platte mit 0,3 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AB-0600</td><td>für real-time qPCR</td></tr><tr><td>Microseal B Klebedichtungen</td><td>Bio-Rad</td><td>MSB1001</td><td>für real-time qPCR</td></tr><tr><td>Rnase/Dnase-freie Reagenzreservoire</td><td>VWR</td><td>89094-662</td><td>für real-time qPCR</td></tr><tr><td>Rnase/Dnase-frei Acht Röhrchenstreifen und -kappen</td><td>Thermo Fisher</td><td>Scientific AM12230</td><td>für real-time qPCR</td></tr><tr><td>SuperScript Reverse Transkriptase</td><td>Invitrogen</td><td>18090010</td><td>für die real-time qPCR</td></tr><tr><td>AMPure XP Beads</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td>für real-time qPCR</td></tr></tbody></table>

bestimmung genomweite transkript verfall tarife im wuchernden und ruhenden menschlichen fibroblasten

Determining Genome-wide Transcript Decay Rates in Proliferating and Quiescent Human Fibroblasts

Ruhe ist eine temporäre, reversibel in die Zellen Zellteilung aufgehört haben, aber weiterhin in der Lage zu vermehren. Mehrere Studien, einschließlich der unsrigen, haben gezeigt, dass Ruhe weitverbreitete Änderungen in der Genexpression zugeordnet ist. Einige dieser Veränderungen entstehen durch Veränderungen in der Ebene oder die Aktivität der Verbreitung-assoziierten Transkriptionsfaktoren, wie E2F und MYC. Wir haben bewiesen, dass mRNA Zerfall auch auf Veränderungen in der Genexpression zwischen proliferierende und ruhende Zellen beitragen kann. In diesem Protokoll beschreiben wir das Verfahren für die wuchernde und ruhende Kulturen der menschliche Vorhaut dermalen Fibroblasten. Wir beschreiben die Verfahren zur Hemmung der neue Transkription in proliferierende und ruhende Zellen mit Actinomycin D (ActD). ActD-Behandlung stellt einen einfache und reproduzierbaren Ansatz zu Wehre neue Transkription von Transkript Verfall dar. Ein Nachteil des ActD-Behandlung ist, dass der zeitliche Verlauf auf einem kurzen Zeitrahmen beschränkt sein muss, da ActD Zellviabilität auswirkt. Transkript-Spiegel sind im Laufe der Zeit zur Abschrift Zerfall bestimmen überwacht. Dieses Verfahren ermöglicht die Identifikation von Genen und Isoformen, die differenzielle Zerfall im wuchernden versus Ruhestrom Fibroblasten aufweisen.

Zuvor haben wir die Ergebnisse der Microarray Analysen der Abschrift Zerfall Sätze in wuchernden und Kontakt gehemmt primären menschlichen Fibroblasten über einen 8-Stunden-Kurs12berichtet. Eine Liste von Genen mit eine signifikante Veränderung im Transkript Stabilität Vergleich wuchernde und Kontakt gehemmt Fibroblasten dient in ergänzenden Tabelle1. Die Fluoreszenz-Intensitäten zum Zeitpunkt Null und über einen zeitlichen Verlauf nach ActD Behand...

Wir beschreiben ein Protokoll für die Generierung von wuchernden und ruhenden primären menschlichen dermalen Fibroblasten, Überwachung Transkript Verfall Preise und differentiell verfallenden Gene zu identifizieren.

Bestimmung genomweite Transkript Verfall Tarife im wuchernden und ruhenden menschlichen Fibroblasten

Quiescence is a temporary, reversible state in which cells have ceased cell division, but retain the capacity to proliferate. Multiple studies, including ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Zerfallsraten des Transkripts in proliferierenden und ruhenden Fibroblasten zu überwachen. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Molekularbiologie zu beantworten, z. B. ob Veränderungen in der Genexpression aus Änderungen der Transkriptzerfallsrate resultieren. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie Informationen über die Transkriptionsrate und nicht nur über die Transkripthäufigkeit liefert.Um das Protokoll zu beginnen, etablieren Sie proliferierende und ruhende Kulturen von Fibroblasten. Proliferierende Fibroblasten sollten regelmäßig trypsinisiert werden. Ruhekulturen können etabliert werden, indem die Platten mit regelmäßigen Mediumwechseln zusammenfließen.Geben Sie ActD 150 Mikroliter in das vorgewärmte Medium 10 Milliliter für alle biologisch replizierten Zellkulturplatten. Geben Sie ActD in einer Konzentration von 15 Mikrogramm pro Milliliter Medium zu. Mischen Sie die Lösung gut.Aspirieren Sie das alte Medium und fügen Sie den Zellen ActD-haltiges Medium hinzu. Um die Nullpunktprobe zu entnehmen, saugen Sie das ActD-Medium vorsichtig ab und pipettieren Sie zwischen fünf und 10 Milliliter vorgewärmtes PBS auf eine 100-Millimeter-Platte, fünf Milliliter Lösung für eine 100-Millimeter-Platte, zwei Milliliter für eine Vertiefung einer Sechs-Well-Platte und einen Milliliter für eine Vertiefung einer 12-Well-Platte. Saugen Sie das PBS vorsichtig an.Geben Sie dann die Phenol-Guanidin-Isothiocyanat-Lösung direkt auf die Gewebekulturplatte. Pipettieren Sie das Zellgemisch aus Phenol-Guanidin-Isothiocyanat-Lösung mehrmals auf und ab, um eine homogene Mischung zu erhalten. Erfassen Sie jeden Zeitpunkt, nachdem die entsprechende Zeitspanne abgelaufen ist, indem Sie die zuvor beschriebene Methode verwenden.Inkubieren Sie die Proben fünf Minuten lang bei Raumtemperatur, um die vollständige Auflösung der RNA-Proteinkomplexe sicherzustellen. Führen Sie als Nächstes kontrollierte Spike-in-Transkripte ein, die mit der verwendeten Methodik nachgewiesen werden können. Führen Sie diese Kontrollen in jeder Probe in einer bekannten Menge und Konzentration ein.Übertragen Sie das Phenylguanidin-Isothiocyanat-Lösungsgemisch mit einer Pipette in ein 2,0-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Fügen Sie dann 0,2 Milliliter Chloroform zur Phenylguanidin-Isothiocyanat-Lösungsmischung für jeden Milliliter verwendeter Phenylguanidin-Isothiocyanat-Lösung hinzu. Schütteln Sie das Mikrozentrifugenröhrchen 15 Sekunden lang kräftig und inkubieren Sie dann das Chloroform-Phenylguanidin-Isothiocyanat.Nach der Inkubation werden die Proben 20 Minuten lang bei vier Grad Celsius bei 12.000 g geschleudert. Die Probe sollte sich in drei Schichten aufteilen. Übertragen Sie die wässrige Schicht mit einer Mikropipette in ein neues 2,0-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und achten Sie darauf, die Zwischenphase während dieses Prozesses nicht zu stören.Die Interphasen- und organischen Fraktionen sind zu verwerfen. Geben Sie dann ein gleiches Volumen 2-Propanol zur wässrigen Fraktion und drehen Sie das Röhrchen 10 Mal um. Fügen Sie bis zu einem Mikroliter 20 Milligramm pro Milliliter wässrigem Glykogen pro 20 Mikroliter Probe hinzu, insbesondere wenn eine geringe Ausbeute erwartet wird.Inkubieren Sie die Proben 10 Minuten lang bei Raumtemperatur. Nach der Inkubation drehen Sie die Proben. Stellen Sie sicher, dass die RNA am Ende des Spins ausgefällt wurde, um ein While-Pellet am Boden des Röhrchens zu bilden.Entfernen und entsorgen Sie den Überstand mit einer Pipette, wobei Sie besonders darauf achten müssen, das weiße RNA-Kügelchen nicht zu stören. Fügen Sie einen Milliliter 75%iges Ethanol pro Milliliter Phenylguanidin-Isothiocyanat-Lösungsreagenz hinzu, um das Pellet zu waschen. Die Proben 10 Minuten lang bei 12.000 g schleudern.Nachdem Sie den größten Teil des Überstands entfernt haben, verwenden Sie eine Pipette, um so viel Ethanol wie möglich zu entfernen, aber stören Sie das Pellet nicht. Schleudert die Proben, um das überschüssige Ethanol zu pelletieren. Das RNA-Kügelchen ist in diesem Schritt weniger kompakt und neigt dazu, sich zu bewegen.Entfernen Sie nach dem Schleudern alles überschüssige Ethanol aus der Tube, ohne das Pellet zu stören. Lassen Sie das RNA-Pellet fünf Minuten lang an der Luft trocknen. Geben Sie 50 Mikroliter nukleasefreies Wasser in das RNA-Pellet und resuspendieren Sie das Pellet in nukleasefreiem Wasser.Behandeln Sie die Proben von einem Mikroliter Deanase, um DNA zu entfernen, und inaktivieren Sie dann die Deanase und die Kationen. Lagern Sie die RNA-Proben in 2,0-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen bei minus 80 Grad Celsius. Quantifizieren Sie die RNA und überprüfen Sie die RNA mit einem Spektralphotometer auf Reinheit.Nach der Überprüfung der Reinheit wird die RNA mit einem 1%Agarose-Gel analysiert, um das Ausmaß des Abbaus sichtbar zu machen. Zwei klare Banden, die 18S- und 28S-rRNA darstellen, sollten deutlich sichtbar sein. Wenn diese Banden nicht sichtbar sind, kann die RNA abgebaut werden.Überwachen Sie als Nächstes die Transkripthäufigkeit in den gesammelten RNA-Aliquoten im Vergleich zum internen Spike-in-Standard mithilfe von Real-Time qPCR. Microarrays, RNA-Sequenzierung oder Northern Blots können ebenfalls verwendet werden. Die Fluoreszenzintensitäten über die Zeit entsprechen der Genexpression.Während Fibroblasten kontakthemmt werden, wird das transkriptkodierende Kollagen 3A1, ein sehr wichtiges Gen für die Bildung der extrazellulären Matrix, das während der Wundheilung abgelagert wird, stabiler und zerfällt nicht so schnell. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Phenol äußerst gefährlich sein kann und es wichtig ist, dass es nicht mit Ihrer Haut in Berührung kommt. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Transkriptzerfallsraten in proliferierenden und ruhenden Fibroblasten überwachen können.Veränderungen der Transkriptzerfallsrate können ein wichtiger Mechanismus der Gentriangulation sein.

determining-genome-wide-transcript-decay-rates-proliferating

Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Wir beschreiben photobleaching Methoden einschließlich Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) und Fluoreszenz-Loss In Photobleaching (FLIP) zu Chromatin Protein Dynamik in embryonale Stammzellen (ES-Zellen) zu überwachen. Chromatin Protein Dynamik, die als eines der Mittel, um das Chromatin Plastizität zu studieren, ist in pluripotente Zellen verbessert.

Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) zu Chromatin Protein Dynamics in Living embryonalen Stammzellen Measure

RNA-Polymerase II Transkription Kinetik auf bestimmte Gene in lebenden Zellen gemessen. mRNAs aus dem Gen von Interesse transkribiert werden fluoreszenzmarkierten und mit Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) der in vivo Kinetik von Transkriptions-Dehnung erhalten werden.

Die Messung der Kinetik der mRNA Transkription in einzelnen lebenden Zellen

Zelluläre Gesamt-RNA ein Template für die Untersuchung schlechte kurzfristige Änderungen in der RNA-Synthese und Zerfall sowie die Kinetik der RNA-Prozessierung. Hier beschreiben wir metabolische Markierung der neu transkribierten RNA mit 4-Thiouridin gefolgt von Thiol-spezifische Biotinylierung und Aufreinigung von neu transkribierten RNA ermöglicht, diese Einschränkungen zu überwinden.

Metabolische Markierung der neu transkribierten RNA für High Resolution Gene Expression Profiling von RNA Synthese, Verarbeitung und Decay in Zellkultur

Die Steady-State-Level spezifischer mRNAs wird durch die Geschwindigkeit der Synthese und der Zerfall der mRNA bestimmt. Genomweite mRNA Abbauraten oder die Zerfallsraten spezifischer mRNAs kann durch Bestimmung mRNA Halbwertszeiten gemessen werden. Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Messung der mRNA-Zerfallsraten in Saccharomyces cerevisiae.

Die Messung der mRNA-Abbau Preise in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Verwenden<em&gt; Rpb1-1</em&gt; Die Stämme

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zum Bestimmen von Protein in einzelne lebende adhärente Zellen, Halbwertszeiten mit Puls Kennzeichnung und Zeitraffer Fluoreszenz-Bildgebung von Fusionsproteinen SNAP-Tag.

Einzellige Quantifizierung der Protein-Abbauraten von Time-Lapse Fluoreszenzmikroskopie in adhärente Zellkultur

Neurodevelopmental Prozesse wie Proliferation, Migration und Neurit Auswuchs bei neuropsychiatrischen Erkrankungen oft gestört sind. So präsentieren wir Protokolle, um schnell und reproduzierbar Diese Entwicklungsstörungen Prozesse im menschlichen iPSC-abgeleitete NPCs zu beurteilen. Diese Protokolle ermöglichen auch die Bewertung der Auswirkungen der relevanten Wachstumsfaktoren und Therapeutika auf NPC-Entwicklung.

Schnelle Erkennung von Entwicklungsstörungen Phänotypen in menschlichen neuronalen Vorläuferzellen (NPCs)

Dieses Protokoll beschreibt die kombinatorische Verwendung von ChIP-Seq, 4sU-Seq, total RNA-Seq und Ribosom profiling für Zelllinien und Primärzellen. Nachverfolgen von Änderungen im Transkriptionsfaktor verbindlich, de Novo Transkription, RNS-Verarbeitung, Umsatz und Übersetzung im Laufe der Zeit und zeigt den gesamten Verlauf der Ereignisse in aktivierten und/oder sich rasch verändernden Zellen ermöglicht.

Echtzeit-Analyse des Transkriptionsfaktors verbindlich, Transkription, Übersetzung und Umsatz, globale Ereignisse während der zellulären Aktivierung anzuzeigen

Hier stellen wir ein Werkzeug vor, mit dem die posttranskriptionische Modulation eines Transkripts in primären Alveolarepithelzellen mithilfe eines induzierbaren Expressionssystems, das an eine Pipettenelektroporationstechnik gekoppelt ist, untersucht werden kann.

Effizientes transkriptionsgesteuertes Plasmidexpressionssystem zur Untersuchung der Stabilität von mRNA-Transkripten in primären Alveolar-Epithelzellen

Dieses Protokoll beschreibt den Workflow für die metabolische Markierung von seneszenten und nicht teilenden Zellen mit gepulstem SILAC, ungezielter Massenspektrometrie-Analyse und einer optimierten Berechnung der Proteinhalbwertszeiten.

Messung von Proteinumsatzraten in seneszenten und nicht teilenden kultivierten Zellen mit metabolischer Markierung und Massenspektrometrie

Dieses Protokoll misst quantitativ die Stabilität und Halbwertszeit intergener und intragenischer Enhancer-RNAs in embryonalen Mausstammzellen mittels Actinomycin-D-Behandlung, RT-qPCR und nichtlinearer Regressionsanalyse. Positionsspezifische Normalisierungsstrategien werden integriert, um die Zerfallsdynamik von eRNA kontextabhängig genau zu modellieren.

Optimierte quantitative Bewertung der Stabilität der Enhancer-RNA in embryonalen Mausstammzellen

Dieser Artikel stellt ein lebendzelliges LysoTracker-Protokoll zur Messung der lysosomalen Remodellierung während der Seneszenz in humanen Fibroblasten von IMR-90 vor.

Lysosomales Profiling mit LysoTracker zur quantitativen Bewertung der zellulären Seneszenz bei humanen Fibroblasten

Erfahren Sie, wie Sie Transkript-Abbauraten in proliferierenden und ruhenden menschlichen Fibroblasten bestimmen. Diese Methode ermöglicht die Unterscheidung zwischen Transkriptabundanz und -stabilität.

Bestimmung genomweite Transkript Verfall Tarife im wuchernden und ruhenden menschlichen Fibroblasten

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