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Advanced Biology

Einführung in die Zellmotilität und -migration

An Introduction to Cell Motility and Migration

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Cell Biology

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JoVE Science Education Cell Biology

An Introduction to Cell Motility and Migration

4.3: Live Cell Imaging of Mitosis

4.5: The Transwell Migration Assay

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08:52 min

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April 30, 2023

Overview

Zelle Motilität und Migration eine wichtige Rolle in beiden normalen Biologie und in der Krankheit. Auf der einen Seite Migration ermöglicht Zellen, komplexen Geweben und Organen während der Entwicklung zu generieren, aber auf der anderen Seite die gleichen Mechanismen dienen von Tumorzellen zu bewegen und in einem Prozeß bekannt als Krebsmetastasen ausbreiten. Eines der primären zellulären Maschinen, die Zellbewegung möglich machen ist ein intrazellulären Netzwerk von Myosin und Actin Moleküle, zusammen bekannt als “Actomyosin”, schafft eine Kontraktionskraft zu eine Zelle in verschiedene Richtungen ziehen.

In diesem Video präsentiert Jupiter einen historischen Überblick über den Bereich der Zellwanderung, feststellend wie Frühwerk auf Muskel-Kontraktion führte zur Entdeckung der Actomyosin Vorrichtung. Dann erkunden wir einige der Fragen, die Forscher sind noch Fragen über Zelle Motilität, und überprüfen Sie Techniken verwendet, um verschiedene Aspekte dieses Phänomens zu studieren. Schließlich betrachten wir, wie Forscher Zellwanderung, z. B. studiert werden um Metastasen besser zu verstehen.

Procedure

Zelle Motilität ist erforderlich bei vielen physiologischen und pathologischen Prozessen, einschließlich der Zellwanderung während der Embryonalentwicklung, Bewegung von weißen Blutkörperchen in Reaktion auf eine Infektion, und eine Metastasierung der Krebszellen. Zwei zelluläre Proteine Aktin und Myosin, bilden die wichtigsten Bausteine der Motilität Vorrichtung.

In diesem Einführungsvideo überprüfen wir einige der Wahrzeichen Entdeckungen auf dem Gebiet der Zelle Motilität und Migration. Dann werden wir ein paar offene Fragen bezüglich Zelle Motilität, gefolgt von einer Diskussion der klassischen und fortgeschrittene Werkzeuge zur Untersuchung Motilität markieren. Zu guter Letzt werden wir mit einigen Beispiel-Experimenten einpacken.

Beginnen wir mit Blick auf die wichtigen Entdeckungen, die mit diesem Bereich verbunden.

Im^{17. Jahrhundert} wurde Anton van Leeuwenhoek mit Hilfe eines Mikroskops, die erste Person, die Bewegung der Spermien und Bakterien zu beobachten. Ein paar Jahrhunderte später, Theodor Wilhelm Engelmann und Wilhelm Pfeffer entdeckt Reiz getrieben bakterielle Bewegung, einschließlich: Phototaxis, die Bewegung beeinflusst durch Licht; Chemotaxis-Bewegung in Richtung von verschiedenen chemischen Substanzen; und Aerotaxis-Bewegung als Reaktion auf Sauerstoff. Etwa zur gleichen Zeit durchgeführt Ilya Metchnikoff ein faszinierendes Experiment, in dem er stach die transparente Seestern Larve mit einem Rosendorn, und Zellen verschieben aus anderen Teilen des Körpers in die Wunde zu beobachten. Dies führte zu dem Begriff der Leukozyten, die Migration auf eine Stelle der Verletzung, Pionier der Immunologie.

Ein Verständnis des Mechanismus der Zellbewegung begann ein paar Jahre früher, wenn ein scheinbar unzusammenhängenden Phänomen studiert – Muskel-Kontraktion. Im Jahre 1859 isoliert Wilhelm Kühne ein Muskelprotein, das er dachte, war verantwortlich für seine Steifigkeit und nannte es Myosin.

Im Jahr 1942 Brunó Ferenc Straub entdeckt, dass die “Myosin” Vorbereitungen tatsächlich eine sekundäre Protein enthalten Actin. Wir wissen jetzt, dass Aktin und Myosin in Form der Actomyosin Komplex, interagieren die Kontraktion erzeugt. 1974 Margaret Clarke, während der Arbeit unter James Spudich Actomyosin-ähnlichen Strukturen in Slime Mold Dictyosteliumgekennzeichnet, und seine Beteiligung an nicht-Muskel Zelle Bewegung vorgeschlagen.

1983 Spudich, zusammen mit Michael Sheetz, eine in-vitro- Actomyosin Modell entwickelt, die den Weg zu unserem heutigen Verständnis von ihren Mechanismus. Wir wissen jetzt, dass ATP, ein “energiereichen” Molekül in den Zellen Myosin bindet und das Myosin-Molekül treibt zu “kriechen” entlang eine parallele Actin-Molekül dadurch erzeugt eine kontraktile Kraft, die in nicht-Muskelzellen während der Migration die Zelle nach vorne ziehen kann.

Nach der kurzen historischen Abriss sprechen wir über ein paar Fragen über Zelle Motilität, die Wissenschaftler heute gefragt sind.

Forscher sind wie Cues direkte Zelle Umweltbewegung lernen interessiert. Zellen verschieben in Reaktion auf eine Vielzahl von Signalen, einschließlich derjenigen, die embryonale Entwicklung oder alert Immunzellen auf Sites der Infektion zu fahren. Diese Signale sind in der Regel chemische Verbindungen, die durch einige Zellen induzieren Migration eines bestimmten Typs von Zellen in Richtung zu ihnen freigegeben. Daher kann Studium des Mechanismus der diese Chemotaxis Induktion helfen Wissenschaftlern die Erkrankungen besser zu verstehen, in welcher, die Zelle Migration gestört ist.

Ein weiterer wichtiger Bereich der Untersuchung betrifft die molekularen Maschinen, mit denen Zellen bewegen. Neben der Actomyosin-Apparat, die Zellen mit flexiblen Formen, Vorsprünge zu erweitern und “kriechen” entlang Oberflächen ermöglicht, versuchen Forscher auch zu verstehen, wie die Zelle Motilität gefahren werden kann, durch andere Zellskelett Elemente, wie die Mikrotubuli, die die “Welle” Sperma Schwänze zu bilden sowie die komplexen molekularen Maschinen, die bakterielle Flagellen bilden.

Schließlich entdecken Sie einige Wissenschaftler, wie Zellen miteinander interagieren und Wandern gemeinsam in Gruppen, die in der frühen Embryogenese sowie der Wundheilung auftreten.

Zusätzlich, weil Zellen im Körper tatsächlich innerhalb eines Netzes von Molekülen bekannt als die extrazelluläre Matrix existieren, abgekürzt als ECM, untersucht, wie Zellen interagieren und in das ECM dringen helfen Verständnis Phänomene wie Krebsmetastasen.

Jetzt haben wir einen Überblick über die Fragen auf dem Gebiet betrachten einige prominente Techniken eingesetzt werden.

Der Scratch-Test wird verwendet, um wie Epithelzellen Modell neu auffüllen eine Freifläche — ähnlich wie Wundheilung. Bei diesem Verfahren entsteht eine Wunde durch die Ausführung einer Pipettenspitze durch die Zelle Kulturschale. Als Zellen wieder in diese Lücke im Laufe der Zeit wachsen, könnte ihre Bewegungstrajektorien mithilfe von Tracking-Software, um Bewegungsgeschwindigkeit und Verschiebung zu beurteilen nachverfolgt werden.

Die Transwell-Migration-Assay ist eine weitere klassische Methode verwendet, um Chemoattraction, die den Prozess der Gewinnung chemisch Zellen zu studieren. In diesem Assay wird Lockstoffgradient Lösung, Brunnen, dann die Transwell Kammern befinden sich im Inneren dieser Brunnen, und schließlich ein wandernder Zelltyp ist hinzugefügt auf der oberen Seite der Membran. Die Anzahl der Zellen in Richtung der Lockstoffgradient Migration kann mit einem Mikroskop und Hemocytometer gezählt werden.

Fortschritte in der engineering-Techniken ermöglichten den Bau der Mikrofluidik Geräte, bestehend aus Microfabricated Kanäle auf einer geeigneten Oberfläche geätzt. Für Migration Experimente, der Kanal hat in der Regel zwei Anschlüsse: einen für den Zusatz von eine Zellsuspension, und eine andere für den Zusatz eines chemischen Reizes. Die Wirkung des Reizes auf Cells Wanderungsverhalten kann dann unter dem Mikroskop untersucht werden.

Um das Eindringen von Zellen in das ECM zu studieren, können Forscher 3D Invasion Tests durchführen. Bei dieser Methode Kulturzellen Wissenschaftler in dreidimensionale Matrizen Komponenten wie Kollagen gebildet. Anschließend können sie mit Hilfe der ausgeklügelten Software Invasion in drei Dimensionen nachverfolgen. Diese Methode eignet sich besonders für das Studium der Tumorentwicklung.

Schließlich kann Zeitraffer Fluoreszenz-Mikroskopie verwendet werden, um lebende Zellen in Vivozu verfolgen. Genen Codierung fluoreszierende Proteine können in einem Tiermodell eingeführt werden. Die wandernden Weg der Zellen jetzt zum Ausdruck fluoreszierende Proteine kann mit anspruchsvollen bildgebende Verfahren, wie zwei-Photonen-Mikroskopie zurückverfolgt werden.

Nun, schauen wir uns einige aktuelle Anwendungen von dieser Zelle Motilität und Migration-Assays.

Wie besprochen, spielt Zellwanderung eine entscheidende Rolle im Tumor Metastasen. Hier kultivierte Wissenschaftler Tumorzellen eingebettet in einer Matrix zusammen mit Gehirnscheiben in einer Transwell Kammer. Nach Inkubation die Proben waren voller Flecken und mit Immunfluoreszenz analysiert. Die Ergebnisse zeigten Invasion von Tumorzellen in den Gehirnscheiben.

Nach Infektion release Zellen Chemokine, die Lockstoffgradient Proteine, die Migration der Neutrophilen zu induzieren. Neutrophile sind phagocytic Zellen, die integraler des angeborenen Immunsystems Bestandteil. Hier bewertet die Forscher dieses Phänomen mit einem Transwell-Migration-Assay. Sie überzogen Bakterien infizierten Epithelzellen auf der Unterseite der Membran, während Neutrophile auf der Oberseite kultiviert wurden. Ergebnisse zeigten signifikante Neutrophilenzahl Migration in Anwesenheit von infizierten Zellen.

Schließlich können mikrofluidischen Kammer Assays zur bakteriellen Chemotaxis zu untersuchen. Wissenschaftler hier bewertet, Lockstoff und wasserabweisenden Eigenschaften der beiden Substanzen — L-Aspartat- und Nickel Sulfat – mit einer spezialisierten mikrofluidischen Kammer, die verschiedene Konzentrationen in einem Experiment testen konnten. Die gewonnenen Daten zeigen, dass mit einer Zunahme der Lockstoff und abweisend Konzentration, bakteriellen Migration hin und Weg von den Test-Moleküle, bzw. erhöht.

Sie habe nur Jupiters Einführung in die Zelle Motilität und Migration beobachtet. In dieser Präsentation haben wir die wichtigsten Meilensteine in der Studie der Zelle Motilität und Migration überprüft. Als nächstes haben wir einige aktuelle Fragen und Werkzeugen in Laboren heute diskutiert. Schließlich hob einige Beispiel-Experimente Anwendungen dieser Techniken. Wie immer vielen Dank für das ansehen!

Transcript

Cell motility is required for many physiological and pathological processes, including cell migration during embryonic development, movement of white blood cells in response to infection, and cancer cells undergoing metastasis. Two cellular proteins, actin and myosin, form the principal building blocks of the motility apparatus.

In this introductory video, we’ll review some of the landmark discoveries in the field of cell motility and migration. Then, we’ll highlight a few unanswered questions regarding cell motility, followed by a discussion of classical and advanced tools used to study motility. Finally, we’ll wrap up with some example experiments.

Let’s start by looking at the important discoveries associated with this field.

In the 17th century, Anton van Leeuwenhoek, with the help of a microscope, became the first person to observe the movement of spermatozoa and bacteria. A couple of centuries later, Theodor Wilhelm Engelmann and Wilhelm Pfeffer discovered stimulus-driven bacterial motion, including: phototaxis, which is movement influenced by light; chemotaxis—movement towards various chemical substances; and aerotaxis—movement in response to oxygen. Around the same time, Ilya Metchnikoff performed a fascinating experiment in which he pricked the transparent starfish larva with a rose thorn, and observed cells moving from other parts of the body to the wound. This led to the notion of leukocytes migrating to a site of injury, pioneering the field of immunology.

An understanding of the mechanism of cell movement began a few years earlier, when studying a seemingly unrelated phenomenon—muscle contraction. In 1859, Wilhelm Kühne isolated a muscle protein that he thought was responsible for its stiffness, and called it myosin.

In 1942, Brunó Ferenc Straub discovered that the “myosin” preparations actually contained a secondary protein, actin. We now know that actin and myosin interact to form the actomyosin complex, which produces contraction. In 1974, Margaret Clarke, while working under James Spudich, characterized actomyosin-like structures in the slime mold Dictyostelium, and suggested its involvement in non-muscle cell movement.

In 1983, Spudich, along with Michael Sheetz, developed an in vitro actomyosin model, which paved the way to our present-day understanding of their mechanism. We now know that ATP, a “high-energy” molecule in cells, binds to myosin and powers the myosin molecule to “crawl” along a parallel actin molecule, thereby generating a contractile force that in non-muscle cells can pull the cell forward during migration.

After the brief historical outline, let’s discuss a few questions about cell motility that scientists are asking today.

Researchers are interested in learning how environmental cues direct cell movement. Cells move in response to a variety of signals, including those that drive embryonic development, or alert immune cells to sites of infection. These signals are usually chemical compounds released by some cells to induce migration of a specific type of cells towards them. Therefore, studying the mechanism of this chemotaxis induction can help scientists better understand the disorders in which cell migration is disrupted.

Another important area of investigation concerns the molecular machinery that cells use to move. In addition to the actomyosin apparatus that allows cells with flexible shapes to extend protrusions and “crawl” along surfaces, researchers also seek to understand how cell motility can be driven by other cytoskeletal elements, such as the microtubules that form the “shaft” of sperm tails, as well as the complex molecular machines that form bacterial flagella.

Finally, some scientists explore how cells interact with each other and migrate together in groups, which occur in early embryogenesis, as well as the wound healing process.

Additionally, because cells in the body actually exist within a mesh of molecules known as the extracellular matrix, abbreviated as ECM, investigating how cells interact with and invade into the ECM can help in understanding phenomena such as cancer metastasis.

Now that we have an idea of the questions being asked in the field, let’s learn about some prominent techniques being employed.

The scratch assay is used to model how epithelial cells repopulate an open area—a process similar to wound healing. In this procedure, a wound is created by running a pipette tip through the cell culture dish. As cells grow back into this gap over time, their movement trajectories could be tracked using tracking software to assess movement speed and displacement.

The transwell migration assay is another classical method used to study chemoattraction, which is the process of chemically attracting cells. In this assay, chemoattractant solution is added to wells, then the transwell chambers are placed inside these wells, and finally, a migratory cell type is added on the upper side of the membrane. The number of cells migrating towards the chemoattractant can be counted using a microscope and hemocytometer.

Advances in engineering techniques have allowed the construction of microfluidics devices, composed of microfabricated channels etched on a suitable surface. For migration experiments, the channel usually has two ports: one for the addition of a cell suspension, and another for the addition of a chemical stimulus. The effect of the stimulus on cells’ migratory behavior can then be studied under a microscope.

To study the invasion of cells into the ECM, researchers can perform 3D invasion assays. In this method, scientists culture cells in three-dimensional matrices made of components such as collagen. Then, with the help of sophisticated software they can track invasion in three dimensions. This method is particularly useful for studying tumor development.

Finally, time-lapse fluorescence microscopy can be used to track live cells in vivo. Genes encoding fluorescent proteins can be introduced into an animal model. The migratory path of the cells now expressing fluorescent proteins can be traced using sophisticated imaging methods, such as two-photon microscopy.

Now, let’s examine some current applications of these cell motility and migration assays.

As discussed, cell migration plays a critical role in tumor metastasis. Here, scientists cultured tumor cells embedded in a matrix together with brain slices in a transwell chamber. Following incubation, the samples were stained and analyzed using immunofluorescence. Results demonstrated invasion by tumor cells into the brain slices.

Following infection, cells release chemokines, which are chemoattractant proteins that induce migration of neutrophils. Neutrophils are phagocytic cells, which form an integral part of the innate immune system. Here, researchers evaluated this phenomenon using a transwell migration assay. They plated bacteria-infected epithelial cells onto the underside of the membrane, while neutrophils were cultured on the upper side. Results showed significant neutrophil migration in the presence of infected cells.

Finally, microfluidic chamber assays can be used to examine bacterial chemotaxis. Here, scientists evaluated attractant and repellant properties of two substances—L-aspartate and nickel sulfate—using a specialized microfluidic chamber that could test several concentrations in one experiment. The data obtained demonstrated that with an increase in attractant and repellent concentration, bacterial migration towards and away from the test molecules also increased, respectively.

You’ve just watched JoVE’s introduction to cell motility and migration. In this presentation, we reviewed the major milestones in the study of cell motility and migration. Next, we discussed some current questions being asked, and tools being used in labs today. Lastly, some example experiments highlighted applications of these techniques. As always, thanks for watching!

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