Modifizierte Roller Schlauch Methode genau lokalisierte und sich wiederholende intermittierende Bildgebung während langfristige Kultur Gehirnscheiben im geschlossenen System

Das übergeordnete Ziel dieser modifizierten Rollenrohrmethode für die Hirnschnittkultur ist es, ein geschlossenes Kultursystem für das langfristige Überleben von Schnitten bereitzustellen, das für repetitive hochauflösende Fluoreszenzbildgebung geeignet ist. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen bei der neuronalen Entwicklung und bei neurodegenerativen Erkrankungen zu beantworten, die Beobachtungen derselben Neuronen im Laufe der Zeit erfordern, wie z. B. die Lokalisierung von Schlüsselproteinen, die an der Bildung oder dem Verlust von Synapsen beteiligt sind.

Die Hauptvorteile dieser Technik sind das vollständig geschlossene Kultursystem, das die sichere Verwendung von Viren für die Proteinexpression ermöglicht, und die Verwendung von fotogeätzten Deckgläsern zur Lokalisierung derselben Zellen für die Bildgebung. Wir hatten die Idee zu dieser Methode, als wir Scheiben auf Deckgläsern in Rollenrohren kultivierten, brauchten aber eine bessere Möglichkeit, Veränderungen in lebenden Scheiben im Laufe der Zeit zu visualisieren. Die weit verbreitete Verwendung viraler Vektoren zur Expression von Transgenen und spezifischen Zellpopulationen für die mikroskopische Bildgebung veranlasste uns, ein geschlossenes System zu entwickeln, um die Benutzer zu schützen und eine Kontamination der Mikroskopobjektive zu vermeiden.

Die Fähigkeit, die identische Population von Zellen innerhalb von Hirnschnitten über die Zeit zu verfolgen, ermöglicht Studien zur Entwicklung pathologischer Veränderungen und Synapsenveränderungen in Nagetiermodellen für menschliche neurologische Störungen. Bereiten Sie zunächst das Rollenrohrgestell vor und machen Sie eine Vorrichtung, um ein Loch in die Rollenrohre zu bohren, wie im beigefügten Textprotokoll beschrieben. Halten Sie mit der Vorrichtung ein einen Zentimeter langes Kulturröhrchen aus Kunststoff mit der flachen Seite in Position, so dass die flache Seite nach oben zeigt.

Bohren Sie dann ein Loch mit einem Durchmesser von sechs Millimetern, wobei die Mitte einen Zentimeter von unten entfernt und mittig zwischen den Seiten des Rohrs liegt. Glätten Sie mit dem schwenkbaren Entgratwerkzeug die Kanten des Lochs und machen Sie vier Rillen an der Innenkante des Lochs, um das Entleeren des Lochs während der Drehung zu erleichtern. Spülen Sie anschließend die Tuben mit 70%igem Ethanol und trocknen Sie sie anschließend in einer biologischen Sicherheitswerkbank an der Luft.

Sterilisieren Sie die Schläuche in einigen 12 Millimeter gestanzten Klebescheiben aus Silikonkautschuk für 40 Minuten unter der UV-Lampe. Positionieren Sie die Schläuche und Scheiben nach 20 Minuten so, dass alle freiliegenden Oberflächen sterilisiert sind. Ziehen Sie anschließend die weiße Unterlage von der Klebescheibe ab, richten Sie die Löcher aus und befestigen Sie den Silikonkautschuk an der Außenseite der Tube.

Sobald die Scheiben erhalten wurden, geben Sie zwei Mikroliter Hühnerplasma auf die Mitte der fotogeätzten Seite eines vorbereiteten Deckglases. Verteilen Sie das Plasma leicht, um einen Fleck mit einem Durchmesser von drei bis vier Millilitern zu erhalten. Verwenden Sie dann einen sterilen Spatel mit schmaler Spitze, um eine vorbereitete Gehirnscheibe anzuheben.

Verwenden Sie eine geschlossene Pinzette, um die Scheibe auf der Spachtelspitze zu halten, während Sie die Scheibe anheben. Berühren Sie den Spachtel mit dem Plasmafleck auf dem Deckglas und schieben Sie mit geschlossener Pinzette die Scheibe auf das Deckglas. Tragen Sie eine dünne Schicht Kükenplasma auf das Deckglas auf, bevor Sie die Scheibe platzieren, und eine minimale Menge Thrombin-behandeltes Plasma, um die Scheibe abzudecken.

Wenn die Scheibe schwebt, bleibt sie nicht haften, wenn die Wolke entfernt wird. Mischen Sie anschließend 2,5 Mikroliter Plasma und 2,5 Mikroliter Thrombin in einem separaten Röhrchen. Geben Sie schnell 2,5 Mikroliter dieser Mischung über und um die Scheibe und pipettieren Sie vorsichtig auf und ab, um sie zu mischen.

Entfernen Sie die durchsichtige Kunststoffabdeckung von der freiliegenden Seite des Silikonkautschukklebers, der zuvor auf dem Rollenrohr angebracht war. Legen Sie dann das Deckglas mit der Gehirnscheibe auf den Klebstoff und richten Sie die Scheibe innerhalb des Lochs aus. Um die Haftung zu gewährleisten, üben Sie mit dem Daumen einen sanften, gleichmäßigen Druck auf das Deckglas aus, indem Sie das Deckglas gleichmäßig nach unten drücken und etwa eine Minute lang halten, während Sie es in die biologische Sicherheitswerkbank übertragen.

Der Druck auf das Deckglas, um es ohne Undichtigkeit mit dem Rohr zu verbinden, muss genau richtig sein und lange genug aufrechterhalten werden, um Luftkanäle im Vorsprung zu eliminieren. Zu viel Druck führt zu Rissen im Deckglas. Geben Sie in einer biologischen Sicherheitswerkbank 0,8 Milliliter vollständiges neurobasales A-Kulturmedium in jedes Röhrchen.

Lassen Sie dann ein Gemisch aus 5 % Kohlendioxid und 95 % Luft durch eine sterile Pasteurpipette mit Wattestopfen fließen, die sicher von einer Klemme gehalten wird. Verwenden Sie dies, um das Rollenrohr mit dem Gasgemisch zu spülen und das Röhrchen schnell zu verschließen, wenn es um die Pipette herum herausgezogen wird. Beschriften Sie dann die Röhrchen mit der Scheibennummer und der Racknummer.

Legen Sie die Rohre in ein Rollengestell; geometrisch ausbalanciert. Wenn es eine ungerade Anzahl von Röhren gibt, fügen Sie leere Röhren hinzu, um sie auszugleichen. Stellen Sie die Gestelle in einen 35 Grad Celsius heißen Rolleninkubator, wobei die Rollen das Rollengestell mit 10 bis 13 Umdrehungen pro Stunde drehen.

Kippen Sie den Inkubator um ca. 5 Grad nach hinten, indem Sie die Vorderseite auf ein Brett heben. Übertragen Sie ein Röhrchen mit einer Scheibenkultur in einen speziell angefertigten Röhrchenhalter wie den hier gezeigten. Setzen Sie dann den Tubushalter in den Tischadapter ein, um das Deckglas während der Bildgebung senkrecht zum Objektiv zu halten.

Schieben Sie dann den Schieber am Tischadapter fest gegen das Rohr, um das Rohr in Position zu halten. Fokussieren Sie sich mit einem vierfachen Objektiv bei Hellfeld-Transbeleuchtung auf die fotogeätzte Rasterperiode unter der Schnitte. Für die erste Bildgebungssitzung scannen Sie schnell um die Scheibe herum, um die Anzahl für die verschiedenen Bereiche zu lokalisieren und aufzuzeichnen, in denen eine Bildgebung mit höherer Vergrößerung gewünscht wird.

Nachdem Sie die Interessenbereiche identifiziert haben, verschieben Sie die Phase zum ersten Rasterquadrat, das einen Interessenbereich enthält. Wechseln Sie dann zum 20-Stärke-Fehlerziel und suchen Sie eine Passermarkenmarke. Wechseln Sie dann zu einem Objektiv mit höherer Leistung, lokalisieren Sie dieselbe Passermarkenmarkierung und zeichnen Sie die x- und y-Position des Tisches auf.

Verschieben Sie die Bühne, um die anderen Interessenfelder in der Nähe zu suchen, und notieren Sie deren x- und y-Offsets von der Passermarkenmarkierung. Die Versatzpositionen ermöglichen eine konsistente Punktbestimmung derselben Deckglasposition, wenn die Scheibe abgebildet wird, auch wenn sich die ursprüngliche x- und y-Einstellung der Passermarkenmarke ändert, wenn die Röhre oder der Tischadapter entfernt und ausgetauscht werden. Erfassen Sie einen Bild-Z-Stick in jedem ausgewählten Feld entweder mit der Steuerung des Mikroskopobjektivs oder einer Piezotischsteuerung, falls verfügbar.

Die Verwendung eines neuronalen Vitalfarbstoffs, wie der konfokale Bilderstapel hier zeigt, hebt die 3D-Architektur sowohl der Neuriten als auch des Zellkörpers hervor, aber die Färbung wird aus dem Zellkern ausgeschlossen. Um zeitabhängige Veränderungen der Morphologie und Lebensfähigkeit von Wachstumsscheiben innerhalb von Schichten während der Langzeitkultur zu untersuchen, wurde dieselbe Schicht einmal pro Woche, 24 Stunden vor der Bildgebung, mit einem fluoreszierenden neuronalen Vitalfarbstoff markiert. Um die Reproduzierbarkeit der Abbildung der identischen Zellen über die Zeit zu demonstrieren, wurde an den Tagen 14, 15, 16 und 17 dasselbe Feld einer Scheibe abgebildet, die am 13. Tag mit neuronalem Vitalfarbstoff markiert war.

Die Position von drei Zellen an jedem Tag wird durch ein Symbol über dem Zellkern angezeigt. Neben dem neuronalen Vitalfarbstoff können mit diesem System viral vermittelte fluoreszierende Proteine zur Markierung von Zellen verwendet werden. Hier können sowohl ein Calcium-sensitiver Reporter als auch Cofilin-haltige Stäbchen 10 Tage nach der Infektion eindeutig identifiziert werden.

Die erfolgreiche Umsetzung dieses Verfahrens erfordert die vorherige Vorbereitung aller Tuben, Deckgläser und Lösungen. Die Möglichkeit, Schnitte in einem kurzen postmortalen Intervall zu erhalten, ist ebenfalls entscheidend für den Erfolg und erfordert viel Übung. Sobald diese Technik gemeistert ist, kann sie in etwa 90 Minuten durchgeführt werden, um 12-18 Hippocampus-Schnitte von einem Mäusewelpen zu erhalten, einschließlich Zeiten für das Sezieren und Plattieren.

Nach diesem Verfahren können Hirnschnitte zu verschiedenen Zeitpunkten mit Viren infiziert werden, um eine zelltypspezifische Expression von fluoreszenzmarkierten Proteinen zu erreichen, oder Stille für die Genexpression mit kleiner interferierender RNA oder kurzer Haarnadel-RNA, um die Genfunktion zu untersuchen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit rekombinanten Viren gefährlich sein kann und dass bei der Arbeit mit diesen Reagenzien immer Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen eines Augenschutzes getroffen werden sollten.