Name: Modifizierte Roller Schlauch Methode genau lokalisierte und sich wiederholende intermittierende Bildgebung während langfristige Kultur Gehirnscheiben im geschlossenen System (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Lernen Sie die modifizierte Roller-Schlauch-Methode zur Langzeitkultur von Gehirnschnitten mit wiederholter hochauflösender Bildgebung. Diese Technik ermöglicht die Beobachtung identischer Neuronenpopulationen über Zeit.

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<ol><li>Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evage, E. K., Price, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+survival+of+hippocampal+neurons+in+B27-supplemented+Neurobasal%2C+a+new+serum-free+medium+combination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination.</a> J Neurosci Res. 35 (5), 567-576 (1993).</li>
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<li>Davis, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+beta+dimers%2Ftrimers+potently+induce+cofilin-actin+rods+that+are+inhibited+by+maintaining+cofilin+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurodegener%22%5BJournal%5D)">Amyloid beta dimers/trimers potently induce cofilin-actin rods that are inhibited by maintaining cofilin phosphorylation.</a> Mol Neurodegener. 6, 10(2011).</li>
<li>Walsh, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid-%CE%B2+and+proinflammatory+cytokines+utilize+a+prion+protein-dependent+pathway+to+activate+NADPH+oxidase+and+induce+cofilin-actin+rods+in+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Amyloid-β and proinflammatory cytokines utilize a prion protein-dependent pathway to activate NADPH oxidase and induce cofilin-actin rods in hippocampal neurons.</a> PLOS ONE. 9 (4), 95995(2014).</li>
<li>Woo, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RanBP9+at+the+intersection+between+cofilin+and+A%CE%B2+pathologies%3A+rescue+of+neurodegenerative+changes+by+RanBP9+reduction%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Disease%22%5BJournal%5D)">RanBP9 at the intersection between cofilin and Aβ pathologies: rescue of neurodegenerative changes by RanBP9 reduction.</a> Cell Death Disease. , 6(2015).</li>
<li>Shaw, A. E., Bamburg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+regulation+of+cofilin+activity+in+the+CNS%3A+a+novel+therapeutic+approach+for+treatment+of+multiple+neurological+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Ther%22%5BJournal%5D)">Peptide regulation of cofilin activity in the CNS: a novel therapeutic approach for treatment of multiple neurological disorders.</a> Pharmacol Ther. 175, 17-27 (2017).</li>
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Die hier beschriebene Methode der Walze-Röhre ermöglicht langfristige Kultivierung und hochauflösende live Imaging von geschnittenen Hirngewebe. Ein großes Problem mit der Slice-Technik wie hier ist bei der Montage und Wartung von Scheiben. Deckglas Beschichtungen, die Slice-Adhäsion, unterstützen fördern Slice Ausdünnung durch die Stärkung der Auswuchs Neuriten und Wanderung von Zellen aus der Scheibe; wir vermieden die Verwendung dieser Substrate. Das Einfügen von Aminogruppen auf das Glas durch Behandlung mit 3-Aminop...

Primärkultur dissoziierten Neuronen aus Regionen des Gehirns Nagetier ist, ein wichtiges Instrument, die von den Forschern verwendet, um Antworten auf pathologisch beobachten reizen beteiligt. Solche Studien haben jedoch den Nachteil Neuronen nur 2D und ohne ihre Glia Support-System zu betrachten. Darüber hinaus unmöglich, es sei denn unter Bedingungen mit sehr hoher Dichte (640 Neuronen/mm2 oder etwa 16 % der Fläche) in dem sie angebaut, zufällige Auswuchs von einem Dendriten und Axon für mehr als eine kurze Strecke von den Zellkörper, hippocampal folgen neuronalen Lebensfähigkeit sinkt über 4 Wochen deutlich1, Begrenzung der Verwendung von dissoziierten Kulturen für erweiterte Studien von altersbedingten Krankheiten. Die Kultivierung von Scheiben aus Nagetier Gehirn vorbereitet, ist eine attraktive Option, die diese Grenzen überwindet durch die Aufrechterhaltung einer organisierten Zellarchitektur und Lebensfähigkeit für Wochen oder Monate. Bedingungen für die Aufrechterhaltung von vielen verschiedener Regionen Nagetier Gehirn im Stück Kultur wurden beschrieben2.
Zwei wichtige Methoden sind am meisten benutzt für langfristige Kultur Gehirnscheiben: Kultivierung auf Membranen in der Luft-Flüssigkeit-Schnittstelle3 oder Kultivierung auf Deckgläsern in versiegelten Röhren um in einem Roller-Inkubator Belüftung4zu drehen durfte. Scheiben-kultivierte auf Membranen können direkt mit hochauflösender Fluoreszenz-Mikroskopie mit einem aufrechten Mikroskop und Wasser eintauchen Ziele5abgebildet. Alternativ wurden Scheiben kultiviert auf Membranen in Glasschalen unten gute Auflösung von dendritischen Dornen mit einer inversen Mikroskop6erreicht übertragen. Jedoch sind beide Methoden von imaging-Scheiben auf Membranen angebaut offene Systeme, die mittlere Änderungen erfordern und oft Antimykotika und/oder Antibiotika zur Verhinderung oder Reduzierung der Verschmutzung5,6. Scheiben auf einer Membran an der Luft-Medium-Schnittstelle pflegen ausgezeichnete Morphologie und überleben, aber Rückkehr zur genauen Standorte während der sich wiederholenden Bildgebung bei hoher Vergrößerung ist extrem schwierig, es sei denn, das Experiment nur kleine Gruppen von Zellen folgt mit dem Ausdruck eines fluoreszierenden Markers. Obwohl Scheiben gewachsen auf Membranen mit viral-vermittelten Expression von transgenen5,6 verwendet wurden, können biologische Sicherheit Protokolle erfordern eine geschlossene Kultursystem eingesetzt werden, für bestimmte virale Vektoren, die für verwendet werden mit dem Ausdruck Eindringmittel getaggt Proteine und Reporter der Zellphysiologie. Darüber hinaus erfordern eintauchen Ziele Dekontamination zwischen Proben, die in Kultur5folgen werden. Eine wichtige Anwendung der Membran Schnittstelle Kulturen verbindet hochauflösende Bildgebung mit Elektrophysiologie bei Mal Punkte7.
Die Walze Rohr Methode mit Deckgläsern in das Kunststoffrohr lässt keine Elektrophysiologie oder hochauflösende Bildgebung ohne das Deckglas. So wurde diese Methode in den meisten Fällen zu Langzeitstudien angewendet in der Post-Fixierung Beobachtungen8vorgenommen wurden. Hier beschrieben, ist eine Methode, die nutzt die Walze Rohr Kultur Technik aber auf gebohrt-Out Röhren mit Scheiben auf Deckgläsern, die wiederholt können, so lange wie die Kulturen abgebildet werden sind gepflegt. Das geschlossene System erfordert keine mittlere Änderung für die Bildgebung und nutzt komplexeste Deckgläsern treuhändische Marken bieten, die es ermöglichen, imaging bei hoher Vergrößerung, nach Tagen oder Wochen, die präzise Felder vorher abgebildet.
Wir wenden diese Methode, um Änderungen im Nagetier Hippocampus, einer wichtigen Hirnregion beteiligt, Gedächtnis und lernen zu untersuchen. Nagetiere-Hippocampus ist oft untersucht, als Modell für pathologische oder altersbedingten Veränderungen, die während der Entwicklung der kognitiven Beeinträchtigung9, wie n. Chr. auftreten beobachtet. Unsere Methode eignet sich besonders gut für pathologische Veränderungen zu studieren, die innerhalb einer einzigen Scheibe zu im Laufe der Zeit als Reaktion auf Veränderungen der Umwelt, wie z. B. Anstieg der Aβ-Peptide entwickeln, die ist charakteristisch für AD8. Eine Pathologie mit menschlichen und Nagetier AD Gehirn verbunden ist das Vorhandensein von Cofilin-Aktin-Aggregate und Stangen, die letztere mit Bündel von Fäden in denen Cofilin und Aktin sind in einem 1:1 Molverhältnis10,11, 12. Stäbe in festen Scheiben des Ratte Hippocampus nach Aβ-Behandlung, sowie in eine live Nagetier Gehirn-Scheibe mit dem Ausdruck Cofilin-GFP Hypoxie8ausgesetzt eingehalten worden, und sie können zu der synaptischen Dysfunktion gesehen in AD und Schlaganfall. Hier verwenden wir diese neue Methode der Kultivierung der zeitlichen Verlauf und Verteilung in Scheiben zum Ausdruck gebrachten exogene Chimären fluoreszierende Proteine durch verschiedene Viren eingeführt. Wir nutzen dann die neuronale Konkretisierung von Cofilin Reporter Konstrukt, die Entwicklung von Cofilin Stab und aggregierte Pathologie in hippocampal Scheiben in Reaktion auf die Behandlung mit löslichen Aβ Oligomere (Aβo) verfolgen.

<table><tbody><tr><td>Böden ab 15 cm Kulturschalen</td><td>VWR Scientific</td><td>25384-326</td><td></td></tr><tr><td>Kreuzschlitz-Maschinenschrauben (#10-32)</td><td>Ace Hardware</td><td></td><td>2,5" lang und 3/16" Durchmesser</td></tr><tr><td>Unterlegscheiben #10</td><td>ACE Hardware</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maschinenschraubenmuttern (#10-32)</td><td>ACE Hardware</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gummitüllen &nbsp;</td><td>ACE Hardware</td><td></td><td>5/16", dick; 5/8", Lochdurchmesser; 1.125", OD</td></tr><tr><td>Polyethylenschlauch (5/16"; Außendurchmesser, 3/16"; ID)</td><td>ACE Hardware</td><td></td><td>Cut to 1,8"</td></tr><tr><td>Länge Sicherungsscheibe #10</td><td>ACE Hardware</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bohrmaschine, 5 Geschwindigkeiten&nbsp;</td><td>Ace Hardware</td><td>ProTech Modell 1201</td><td></td></tr><tr><td>Nunclon Delta Flachrohre</td><td>VWR</td><td>62407-076</td><td></td></tr><tr><td>Bohrer, 3 mm, 6 mm und 15 mm&nbsp;</td><td>Ace Hardware</td><td>Diablo Freud</td><td>Marke Bohrer zum Schneiden von Kunststoff.</td></tr><tr><td>Bohrer für Holz, 1,5 cm und 1 mm</td><td>Ace Hardware</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Holzfeile, 1/4" runde</td><td>Ace Harware</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Federklammern, 16 mm Schnapphalter,</td><td>Ace Hardware</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Drehkopf-Entgratwerkzeug, 5"</td> <td>Ace Hardware</td><td>26307</td><td></td></tr><tr><td>selbstklebende Silikonplatte (sichere Versiegelung)</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>666581</td><td>0,5 mm Dicke</td></tr><tr><td>6 mm Locher</td><td>Office Max</td><td></td><td></td></tr><tr><td>12 mm Locher</td><td>thepunchbunch.com</td><td></td><td></td></tr><tr><td>70% Ethanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phototeched Deckgläser, 12 mm</td><td>Durchmesser Bellco Glass, Inc.</td><td>1916-91012</td><td></td></tr><tr><td>Bunsenbrenner</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Absolutes Ethanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanoreines Wasser</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-Aminopropyltriethoxylan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3648</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179124</td><td></td></tr><tr><td>#5 Dumont Pinzette</td><td>Feinwissenschaftliche Werkzeuge</td><td>11251-30</td><td></td></tr><tr><td>McIlwain Tissue-Häcksler</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>10180</td><td></td></tr><tr><td>Doppelschneidige Rasierklingen</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>121-6</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Filterpapier</td><td>VWR</td><td>28450-182</td><td>In Kreise mit 5,8 cm Durchmesser geschnitten</td></tr><tr><td>Polychlortrifluorethylen (Aclar)</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>10501-10</td><td>In Kreise mit 5,8 cm Durchmesser schneiden</td></tr><tr><td>#21 Chirurgische Klinge</td><td>VWR Scientific</td><td>25860-144</td><td></td></tr><tr><td>#5 Dumont Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-30</td><td></td></tr><tr><td>Spatel, rostfrei mit konischem Ende</td><td>VWR</td><td>82027-518</td><td></td></tr><tr><td>Gey's Balanced Salt Solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9779&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Glukose</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15023-021</td><td>25% (w/v) Lösung, 0,2 mm Filter sterilisiert</td></tr><tr><td>Chicken Plasma</td><td>Cocalico Biologicals</td><td>30-0300-5L</td><td>Rehydrieren in sterilem Wasser, zentrifugieren bei 2500 x g 30 min bei 4 &Grad; C, Aliquote in flüssigem Stickstoff schnell einfrieren und aufbewahren bei&nbsp; -80 °C.</td></tr><tr><td>Thrombin, topisch (Rind)</td><td>Pfizer</td><td>Thrombin-JMI</td><td>Aliquote in flüssigem Stickstoff bei 1.000 internationalen Einheiten/ml im bereitgestellten Verdünnungsmittel einfrieren und bei -80 °C lagern. Bei 250 Einheiten/ml verwenden.</td></tr><tr><td>Cell Roller System</td><td>Bellco Biotech</td><td>SciERA</td><td></td></tr><tr><td>Roller Inkubator</td><td>Forma</td><td>Modell 3956</td><td></td></tr><tr><td>N21-MAX</td><td>ThermoFisher</td><td>Scientific AR008</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep (100X)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>200 mM Glutamin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Glukose</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15023-021</td><td>25% (w/v) Lösung, 0,2 mm Filter, sterilisiert</td></tr><tr><td>Neurobasal A</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10888-022&nbsp;</td><td>Vollständiges Medium: 48 mL Neurobasal A, 1 mL N21-MAX, 0,625 mL 200 mM Glutamin, 0,180 mL 25% Glukose, 0,250 mL 100x Pen/Streptokokken.</td></tr><tr><td>Lentivirus-Verpackung der dritten Generation</td><td>Life Technologies</td><td>K4975-00</td><td></td></tr><tr><td>159 K Cutoff-Zentrifugalfilter (Centricon)</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lentivirales Klonierungssystem (InFusion)</td><td>Clonetech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasmide 30323, 50856, 51279</td><td>Addgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neuronaler Zellviabilitätsfarbstoff (NeuO)</td><td>Stammzellentechnologien</td><td>1801</td><td>Einmal auftauen und in 4 & Mikro schnell einfrieren; L aliquots. Bei -20 Grad lagern; C</td></tr><tr><td>Inverses Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>IX83</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Objektive</td><td>Olympus</td><td>air: 4X, 20; Öl: 40X, 60X,Spinning</td><td></td></tr> <tr><td>Disc konfokales System</td><td>Yokagawa</td><td>CSU22</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop EMCCD-Kamera</td><td>Photometrie</td><td>Cascade II</td><td></td></tr><tr><td>Linear kodiert (x,y), Piezo z flacher Obertisch</td><td>ASI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskoplaser und -integration</td><td>Intelligente Bildgebung Innovationen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK293T Zellen</td><td>American Type Culture Collection</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>Human Plasmin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1867</td><td>0,002 U/ml in 0,1 % Rinderserumalbumin (0,2 mm Filter sterilisiert), schnell in flüssigem Stickstoff einfrieren und bei -80 °C lagern.</td></tr></tbody></table>

modifizierte roller schlauch methode genau lokalisierte und sich wiederholende intermittierende bildgebung während langfristige kultur gehirnscheiben im geschlossenen system

Modified Roller Tube Method for Precisely Localized and Repetitive Intermittent Imaging During Long-term Culture of Brain Slices in an Enclosed System

Kultivierte Nagetier Gehirnscheiben eignen sich für die Erforschung der zellulären und molekularen Verhaltens der Neuronen und Glia in einer Umgebung, die viele ihrer normalen in-Vivo -Interaktionen unterhält. Scheiben aus unterschiedlichsten transgene Mauslinien oder Verwendung von viralen Vektoren für Ausdruck von Eindringmittel tagged Proteinen oder Reporter in Wildtyp Gehirnscheiben gewonnen ermöglichen hochauflösende Bildgebung durch Fluoreszenz-Mikroskopie. Obwohl verschiedene Methoden entwickelt worden sind, für imaging Gehirnscheiben kombiniert Stück Kultur mit der Fähigkeit zu führen hat sich wiederholende hochauflösende Bildgebung bestimmter Zellen in live Scheiben über längere Zeit Probleme aufgeworfen. Dies gilt insbesondere, wenn virale Vektoren für Expression exogene Proteine verwendet werden, da dies am besten geschieht in einem geschlossenen System zum Schutz der Nutzer und Kreuzkontamination zu verhindern. Einfache Änderungen an der Walze Rohr Gehirn Stück Kultur-Methode, die für sich wiederholende hochauflösende Bildgebung von Scheiben über viele Wochen in einem geschlossenen System zu ermöglichen, werden gemeldet. Kultivierung der Scheiben auf komplexeste Deckgläsern erlaubt die Verwendung von treuhändische Markierungen schnell und genau die Bühne, um das gleiche Feld im Laufe der Zeit vor und nach verschiedenen Behandlungen Bild neu positionieren. Beispiele sind für den Einsatz dieser Methode kombiniert mit spezifischen neuronalen Färbung und Ausdruck, Änderungen in der hippocampal Stück Architektur zu beobachten, viral-vermittelte neuronale Ausdruck von fluoreszierenden Proteinen und die Entwicklung von Cofilin Pathologie dargestellt, die zuvor im Hippocampus der Alzheimer-Krankheit (AD) in Reaktion auf die Scheibe Behandlung mit Oligomere von Amyloid-β (Aβ) Peptid beobachtet wurde.

Um festzustellen, wie genau so Markierungen können genutzt werden, um die gleichen Zellen in den gleichen Bereichen im Laufe der Zeit Reimaging, untersuchten wir Scheiben auf komplexeste Deckgläsern(Abbildung 6)angebaut. Neuronen wurden visualisiert durch Färbung mit einem vital-Farbstoff (100 nM für 2 h; nicht-neuronalen Zellen keine Flecken), die verschwindet aus Neuronen im Laufe der Zeit ohne Schädigung der Zellen-25</su...

Hier ist eine modifizierte Roller Schlauch Methode zur Kultivierung und intermittierende hochauflösende Bildgebung des Gehirns Nagetier Scheiben über viele Wochen mit präzisen Neupositionierung auf komplexeste Deckgläsern. Neuronalen Lebensfähigkeit und Slice Morphologie sind gut gepflegt. Anwendungen dieses komplett geschlossenes System mit Viren für Zelltyp spezifische Ausdruck stehen zur Verfügung.

Modifizierte Roller Schlauch Methode genau lokalisierte und sich wiederholende intermittierende Bildgebung während langfristige Kultur Gehirnscheiben im geschlossenen System

Cultured rodent brain slices are useful for studying the cellular and molecular behavior of neurons and glia in an environment that maintains many of ...

Das übergeordnete Ziel dieser modifizierten Rollenrohrmethode für die Hirnschnittkultur ist es, ein geschlossenes Kultursystem für das langfristige Überleben von Schnitten bereitzustellen, das für repetitive hochauflösende Fluoreszenzbildgebung geeignet ist. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen bei der neuronalen Entwicklung und bei neurodegenerativen Erkrankungen zu beantworten, die Beobachtungen derselben Neuronen im Laufe der Zeit erfordern, wie z. B. die Lokalisierung von Schlüsselproteinen, die an der Bildung oder dem Verlust von Synapsen beteiligt sind.Die Hauptvorteile dieser Technik sind das vollständig geschlossene Kultursystem, das die sichere Verwendung von Viren für die Proteinexpression ermöglicht, und die Verwendung von fotogeätzten Deckgläsern zur Lokalisierung derselben Zellen für die Bildgebung. Wir hatten die Idee zu dieser Methode, als wir Scheiben auf Deckgläsern in Rollenrohren kultivierten, brauchten aber eine bessere Möglichkeit, Veränderungen in lebenden Scheiben im Laufe der Zeit zu visualisieren. Die weit verbreitete Verwendung viraler Vektoren zur Expression von Transgenen und spezifischen Zellpopulationen für die mikroskopische Bildgebung veranlasste uns, ein geschlossenes System zu entwickeln, um die Benutzer zu schützen und eine Kontamination der Mikroskopobjektive zu vermeiden.Die Fähigkeit, die identische Population von Zellen innerhalb von Hirnschnitten über die Zeit zu verfolgen, ermöglicht Studien zur Entwicklung pathologischer Veränderungen und Synapsenveränderungen in Nagetiermodellen für menschliche neurologische Störungen. Bereiten Sie zunächst das Rollenrohrgestell vor und machen Sie eine Vorrichtung, um ein Loch in die Rollenrohre zu bohren, wie im beigefügten Textprotokoll beschrieben. Halten Sie mit der Vorrichtung ein einen Zentimeter langes Kulturröhrchen aus Kunststoff mit der flachen Seite in Position, so dass die flache Seite nach oben zeigt.Bohren Sie dann ein Loch mit einem Durchmesser von sechs Millimetern, wobei die Mitte einen Zentimeter von unten entfernt und mittig zwischen den Seiten des Rohrs liegt. Glätten Sie mit dem schwenkbaren Entgratwerkzeug die Kanten des Lochs und machen Sie vier Rillen an der Innenkante des Lochs, um das Entleeren des Lochs während der Drehung zu erleichtern. Spülen Sie anschließend die Tuben mit 70%igem Ethanol und trocknen Sie sie anschließend in einer biologischen Sicherheitswerkbank an der Luft.Sterilisieren Sie die Schläuche in einigen 12 Millimeter gestanzten Klebescheiben aus Silikonkautschuk für 40 Minuten unter der UV-Lampe. Positionieren Sie die Schläuche und Scheiben nach 20 Minuten so, dass alle freiliegenden Oberflächen sterilisiert sind. Ziehen Sie anschließend die weiße Unterlage von der Klebescheibe ab, richten Sie die Löcher aus und befestigen Sie den Silikonkautschuk an der Außenseite der Tube.Sobald die Scheiben erhalten wurden, geben Sie zwei Mikroliter Hühnerplasma auf die Mitte der fotogeätzten Seite eines vorbereiteten Deckglases. Verteilen Sie das Plasma leicht, um einen Fleck mit einem Durchmesser von drei bis vier Millilitern zu erhalten. Verwenden Sie dann einen sterilen Spatel mit schmaler Spitze, um eine vorbereitete Gehirnscheibe anzuheben.Verwenden Sie eine geschlossene Pinzette, um die Scheibe auf der Spachtelspitze zu halten, während Sie die Scheibe anheben. Berühren Sie den Spachtel mit dem Plasmafleck auf dem Deckglas und schieben Sie mit geschlossener Pinzette die Scheibe auf das Deckglas. Tragen Sie eine dünne Schicht Kükenplasma auf das Deckglas auf, bevor Sie die Scheibe platzieren, und eine minimale Menge Thrombin-behandeltes Plasma, um die Scheibe abzudecken.Wenn die Scheibe schwebt, bleibt sie nicht haften, wenn die Wolke entfernt wird. Mischen Sie anschließend 2,5 Mikroliter Plasma und 2,5 Mikroliter Thrombin in einem separaten Röhrchen. Geben Sie schnell 2,5 Mikroliter dieser Mischung über und um die Scheibe und pipettieren Sie vorsichtig auf und ab, um sie zu mischen.Entfernen Sie die durchsichtige Kunststoffabdeckung von der freiliegenden Seite des Silikonkautschukklebers, der zuvor auf dem Rollenrohr angebracht war. Legen Sie dann das Deckglas mit der Gehirnscheibe auf den Klebstoff und richten Sie die Scheibe innerhalb des Lochs aus. Um die Haftung zu gewährleisten, üben Sie mit dem Daumen einen sanften, gleichmäßigen Druck auf das Deckglas aus, indem Sie das Deckglas gleichmäßig nach unten drücken und etwa eine Minute lang halten, während Sie es in die biologische Sicherheitswerkbank übertragen.Der Druck auf das Deckglas, um es ohne Undichtigkeit mit dem Rohr zu verbinden, muss genau richtig sein und lange genug aufrechterhalten werden, um Luftkanäle im Vorsprung zu eliminieren. Zu viel Druck führt zu Rissen im Deckglas. Geben Sie in einer biologischen Sicherheitswerkbank 0,8 Milliliter vollständiges neurobasales A-Kulturmedium in jedes Röhrchen.Lassen Sie dann ein Gemisch aus 5 % Kohlendioxid und 95 % Luft durch eine sterile Pasteurpipette mit Wattestopfen fließen, die sicher von einer Klemme gehalten wird. Verwenden Sie dies, um das Rollenrohr mit dem Gasgemisch zu spülen und das Röhrchen schnell zu verschließen, wenn es um die Pipette herum herausgezogen wird. Beschriften Sie dann die Röhrchen mit der Scheibennummer und der Racknummer.Legen Sie die Rohre in ein Rollengestell; geometrisch ausbalanciert. Wenn es eine ungerade Anzahl von Röhren gibt, fügen Sie leere Röhren hinzu, um sie auszugleichen. Stellen Sie die Gestelle in einen 35 Grad Celsius heißen Rolleninkubator, wobei die Rollen das Rollengestell mit 10 bis 13 Umdrehungen pro Stunde drehen.Kippen Sie den Inkubator um ca. 5 Grad nach hinten, indem Sie die Vorderseite auf ein Brett heben. Übertragen Sie ein Röhrchen mit einer Scheibenkultur in einen speziell angefertigten Röhrchenhalter wie den hier gezeigten. Setzen Sie dann den Tubushalter in den Tischadapter ein, um das Deckglas während der Bildgebung senkrecht zum Objektiv zu halten.Schieben Sie dann den Schieber am Tischadapter fest gegen das Rohr, um das Rohr in Position zu halten. Fokussieren Sie sich mit einem vierfachen Objektiv bei Hellfeld-Transbeleuchtung auf die fotogeätzte Rasterperiode unter der Schnitte. Für die erste Bildgebungssitzung scannen Sie schnell um die Scheibe herum, um die Anzahl für die verschiedenen Bereiche zu lokalisieren und aufzuzeichnen, in denen eine Bildgebung mit höherer Vergrößerung gewünscht wird.Nachdem Sie die Interessenbereiche identifiziert haben, verschieben Sie die Phase zum ersten Rasterquadrat, das einen Interessenbereich enthält. Wechseln Sie dann zum 20-Stärke-Fehlerziel und suchen Sie eine Passermarkenmarke. Wechseln Sie dann zu einem Objektiv mit höherer Leistung, lokalisieren Sie dieselbe Passermarkenmarkierung und zeichnen Sie die x- und y-Position des Tisches auf.Verschieben Sie die Bühne, um die anderen Interessenfelder in der Nähe zu suchen, und notieren Sie deren x- und y-Offsets von der Passermarkenmarkierung. Die Versatzpositionen ermöglichen eine konsistente Punktbestimmung derselben Deckglasposition, wenn die Scheibe abgebildet wird, auch wenn sich die ursprüngliche x- und y-Einstellung der Passermarkenmarke ändert, wenn die Röhre oder der Tischadapter entfernt und ausgetauscht werden. Erfassen Sie einen Bild-Z-Stick in jedem ausgewählten Feld entweder mit der Steuerung des Mikroskopobjektivs oder einer Piezotischsteuerung, falls verfügbar.Die Verwendung eines neuronalen Vitalfarbstoffs, wie der konfokale Bilderstapel hier zeigt, hebt die 3D-Architektur sowohl der Neuriten als auch des Zellkörpers hervor, aber die Färbung wird aus dem Zellkern ausgeschlossen. Um zeitabhängige Veränderungen der Morphologie und Lebensfähigkeit von Wachstumsscheiben innerhalb von Schichten während der Langzeitkultur zu untersuchen, wurde dieselbe Schicht einmal pro Woche, 24 Stunden vor der Bildgebung, mit einem fluoreszierenden neuronalen Vitalfarbstoff markiert. Um die Reproduzierbarkeit der Abbildung der identischen Zellen über die Zeit zu demonstrieren, wurde an den Tagen 14, 15, 16 und 17 dasselbe Feld einer Scheibe abgebildet, die am 13. Tag mit neuronalem Vitalfarbstoff markiert war.Die Position von drei Zellen an jedem Tag wird durch ein Symbol über dem Zellkern angezeigt. Neben dem neuronalen Vitalfarbstoff können mit diesem System viral vermittelte fluoreszierende Proteine zur Markierung von Zellen verwendet werden. Hier können sowohl ein Calcium-sensitiver Reporter als auch Cofilin-haltige Stäbchen 10 Tage nach der Infektion eindeutig identifiziert werden.Die erfolgreiche Umsetzung dieses Verfahrens erfordert die vorherige Vorbereitung aller Tuben, Deckgläser und Lösungen. Die Möglichkeit, Schnitte in einem kurzen postmortalen Intervall zu erhalten, ist ebenfalls entscheidend für den Erfolg und erfordert viel Übung. Sobald diese Technik gemeistert ist, kann sie in etwa 90 Minuten durchgeführt werden, um 12-18 Hippocampus-Schnitte von einem Mäusewelpen zu erhalten, einschließlich Zeiten für das Sezieren und Plattieren.Nach diesem Verfahren können Hirnschnitte zu verschiedenen Zeitpunkten mit Viren infiziert werden, um eine zelltypspezifische Expression von fluoreszenzmarkierten Proteinen zu erreichen, oder Stille für die Genexpression mit kleiner interferierender RNA oder kurzer Haarnadel-RNA, um die Genfunktion zu untersuchen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit rekombinanten Viren gefährlich sein kann und dass bei der Arbeit mit diesen Reagenzien immer Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen eines Augenschutzes getroffen werden sollten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Dieses Protokoll beschreibt eine organotypischen Slice-Assay für die postnatale Gehirn und hochauflösenden Zeitraffer-Bildgebung von Neuroblasten Migration in der rostralen wandernde Stream optimiert.

Ein organotypischen Assay für High-Resolution Time-Lapse Imaging neuronaler Migration in der postnatalen Gehirn

Hier beschreiben wir eine schnelle und einfache Methode, um Bild fluoreszenzmarkierten Zellen in semi-dicken Hirnschnitten. Durch die Fixierung, Schneiden und optisch Clearing Hirngewebe beschreiben wir, wie Standard-epifluoreszenten oder konfokale Bildgebung verwendet werden, um einzelne Zellen und neuronalen Netzwerken im intakten Nervengewebe zu visualisieren.

Eine schnelle Annäherung an High-Resolution Fluoreszenz-Imaging in Semi-Thick Hirnschnitten

In diesem Protokoll, aktualisieren wir die jüngsten Fortschritte in der Bildgebung...

Imaging Calcium Antworten in GFP-markierten Neuronen des Hypothalamus Maus Hirnschnitten

Dieses Video zeigt eine modifizierte Rollenrohrmethode für die Langzeitkultivierung von Hirnschnitten aus einem Nagetiermodell. Zuerst werden die Hirnschnitte an Deckgläsern befestigt. Dann werden flache Rollenrohre mit einem Loch auf der flachen Seite entnommen und die Deckgläser mit Klebepunkten auf dem Loch positioniert. Schließlich werden ein Nährmedium und ein Kohlendioxid-Luft-Gemisch in das Röhrchen gegeben, und die Röhrchen werden mit einer Walzbewegung inkubiert.

Eine modifizierte Rollenrohrmethode für die Langzeitkultur von Hirnschnitten von Nagetieren

Quelle: Wiegreffe, C., et. al.,  Konfokale Zeitraffer-Bildgebung von migrierenden Neuronen in der organotypischen Schnittkultur des embryonalen Mausgehirns unter Verwendung von In utero{ Elektroporation. {{}}J. Vis. Exp.{{TAG_ 44}} (2017) Dieses Video zeigt die konfokale Zeitraffermikroskopie, um die radiale Migration kortikaler Neuronen von der subventrikulären Zone zur kortikalen Platte über radiale Gliagerüste in transduzierten embryonalen Hirnschnitten der Maus zu beobachten.

Zeitraffer-Bildgebung der radialen Migration kortikaler Neuronen in transduzierten embryonalen Hirnschnitten von Mäusen

Eine Technik zur Untersuchung von NG2-Zellen und Oligodendrozyten unter Verwendung eines Schnittkultursystems des Vorderhirns und des Kleinhirns wird beschrieben.  Diese Methode ermöglicht die Untersuchung der Dynamik der Proliferation und Differenzierung von Zellen innerhalb der Oligodendrozytenlinie, bei der die extrazelluläre Umgebung leicht manipuliert werden kann, während die Zytoarchitektur des Gewebes erhalten bleibt.

Organotypischen Kulturen zu Oligodendrozyten Dynamik und Myelinisierung Studieren

Verwenden von mehreren Winkeln Sie die Maus pup Gehirn zu schneiden, verbessern wir die auf einem zuvor beschriebenen akuten Hirnschnitt, die die Verbindungen zwischen den meisten der großen auditorischen Mittelhirn und Vorderhirnstrukturen erfasst.

Modifikation eines Colliculo-thalamokortikalen Maus Hirnschnitt, Einbindung der 3D-Druckkammerkomponenten und Multiskalen Optical Imaging

Dieses Protokoll enthält Anweisungen für die direkte Beobachtung von radial migrierenden kortikalen Neuronen. In der utero- Elektroporation werden die organotypische Scheibenkultur und die konjunkturelle Bilddarstellung kombiniert, um die Effekte der Überexpression oder der Abregulation von Genen von Interesse bei der Migration von Neuronen direkt und dynamisch zu untersuchen und ihre Differenzierung während der Entwicklung zu analysieren.

Zeitraffer-konfokale Bildgebung der Migration von Neuronen in der organotypischen Scheibe Kultur der embryonalen Maus Gehirn mit<em&gt; In Utero</em&gt; Elektroporation

Mikroglia, die ansässigen Immunzellen des Gehirns, reagieren schnell auf Änderungen ihrer Umgebung mit morphologischen Veränderungen. Dieses Protokoll beschreibt, wie zwei-Photonen-Mikroskopie zu verwenden, um die Anziehungskraft der Mikroglia Prozesse gegenüber Serotonin oder ATP in akuten Hirnschnitten von Mäusen zu studieren.

Zwei-Photon Imaging der Mikroglia Prozesse Anziehung in Richtung ATP oder Serotonin im akuten Gehirnscheiben

Wir beschreiben ein Protokoll zur zelltypspezifischen Expression des genetisch codierten FRET-basierten Sensors ATeam1.03YEMK in organotypischen Scheibenkulturen des Mausvorhirns. Darüber hinaus zeigen wir, wie dieser Sensor für die dynamische Bildgebung von zellulären ATP-Spiegeln in Neuronen und Astrozyten verwendet wird.

Bildgebung von intrazellulärem ATP in organotypischen Gewebescheiben des Maushirns mit dem FRET-basierten Sensor ATeam1.03YEMK

Während der Entwicklung der Großhirnrinde stammen Neuronen und Gliazellen aus der ventrikulären Zone, die den Ventrikel auskleidet, und wandern zur Gehirnoberfläche. Viele Gene sind an diesem Prozess beteiligt. Dieses Protokoll stellt die Technik für die Zeitraffer-Bildgebung von migrierenden Neuronen und glialen Vorläuferzellen vor.

Zeitraffer-Bildgebung von migrierenden Neuronen und glialen Vorläuferzellen in embryonalen Hirnschnitten von Mäusen

Lernen Sie die modifizierte Roller-Schlauch-Methode zur Langzeitkultur von Gehirnschnitten mit wiederholter hochauflösender Bildgebung. Diese Technik ermöglicht die Beobachtung identischer Neuronenpopulationen über Zeit.

Modifizierte Roller Schlauch Methode genau lokalisierte und sich wiederholende intermittierende Bildgebung während langfristige Kultur Gehirnscheiben im geschlossenen System (Video) | JoVE Journal

Modifizierte Roller Schlauch Methode genau lokalisierte und sich wiederholende intermittierende Bildgebung während langfristige Kultur Gehirnscheiben im geschlossenen System

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