Messung der Wirkung von Chemikalien auf das Wachstum und die Vermehrung von Caenorhabditis elegans

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Wirkung von Chemikalien, wie z.B. dem Topoisomerase-Inhibitor Etoposid, auf das Wachstum und die Fortpflanzung des Modelltieres Caenorhabditis elegans zu messen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Toxikologie zu beantworten, wie z. B. die toxikologische Bewertung für die Entwicklung von Arzneimitteln und die Risikobewertung von Umweltgiften. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Toxizität verschiedener Chemikalien in Nicht-Säugetiersystemen überprüft werden kann, so dass diese Technik bequem und kostengünstig ist.

Verfahren wird von So Young Lee, einer Doktorandin aus meinem Labor, demonstriert. Bereiten Sie zunächst zwei saubere 200-Milliliter-Glasflaschen vor, indem Sie 0,6 Gramm Natriumchlorid, 0,5 Gramm Pepton, 3,4 Gramm Agar, 195 Milliliter destilliertes Wasser und einen Magnetrührer in eine Flasche geben. Geben Sie dann einen Magnetrührer in die andere leere Flasche.

Autoklavieren Sie die Flaschen 15 Minuten lang bei 121 Grad Celsius und kühlen Sie die Flaschen dann 30 Minuten lang in einem Wasserbad bei 55 Grad Celsius ab. Als nächstes geben Sie in die gefüllte Flasche 0,2 Milliliter eines molaren Calciumchlorids, 0,2 Milliliter fünf Milligramm pro Milliliter Cholesterin, 0,2 Milliliter eines molaren Magnesiumsulfats und fünf Milliliter eines molaren Kaliumphosphats. Dann die Lösung durch magnetisches Rühren auf einer heißen Platte bei 55 Grad Celsius mischen.

Gießen Sie die Hälfte des gemischten NGM-Mediums in die leere 200-Milliliter-Flasche. Geben Sie dann einen Milliliter DMSO in eine Flasche und mischen Sie es unter Magnetrührung erneut. Lagern Sie die andere Flasche in einem Wasserbad bei 55 Grad Celsius.

Dann aliquotieren Sie drei Milliliter des DMSO-haltigen Mediums auf 35 x 10 Millimeter große Petrischale. Nehmen Sie die andere Flasche aus dem Wasserbad und mischen Sie sie unter magnetischem Rühren. Fügen Sie dann einen Milliliter 75-millimolares Etoposid hinzu.

Wiederholen Sie nach dem erneuten Mischen den Aliquotierungsvorgang. Kühlen Sie die chemikalienhaltigen NGM-Platten ab, indem Sie sie etwa drei Stunden lang bei Raumtemperatur stehen lassen, und lagern Sie sie bis zur Verwendung bei vier Grad Celsius. Für den chemischen Test verteilen Sie 100 Mikroliter hitzeinaktiviertes E.coli OP50 auf jeder NGM-Platte.

Lassen Sie die Platten über Nacht in einem C.elegans-Inkubator bei 20 Grad Celsius trocknen. Übertragen Sie die alterssynchronisierten C.elegans-Eier auf eine NGM-Platte, die mit 1%DMSO oder 750-mikromolarem Etoposid ergänzt ist. Legen Sie die C.elegans für vier Tage bei 20 Grad Celsius in einen Inkubator.

Beobachten und fotografieren Sie jeden Tag mikroskopische Bilder von C.elegans unter dem Stereomikroskop. Nehmen Sie außerdem ein mikroskopisches Bild des Mikroskoptischmikrometers für die Kalibrierung der Wurmgröße auf. Um die Körperlänge von C.eleganen, die mit DMSO oder Etoposid behandelt wurden, zu jedem Zeitpunkt zu messen, öffnen Sie in ImageJ das Mikrometerbild des Mikroskoptisches.

Ziehen Sie dann mit dem Werkzeug "Gerade Linie" eine Linie von 1.000 Mikrometern auf das Bild. Klicken Sie auf Analysieren und dann auf Maßstab festlegen, und geben Sie 1.000 und Mikrometer in die Felder Bekannte Entfernung bzw. Längeneinheit ein. Aktivieren Sie dann Global und klicken Sie auf OK. Öffnen Sie die Wurmbilder mit Datei und dann mit Öffnen.

Zeichnen Sie dann mit dem Freihandlinienwerkzeug eine Linie entlang des Merkmals jedes Wurms. Rufen Sie die Körperlängendaten ab, indem Sie auf Analysieren und dann auf Messen klicken. Wiederholen Sie diese Schritte für 50 Würmer.

Inkubieren Sie die alterssynchronisierten Eier auf der NGM-Platte, die DMSO oder Etoposid enthält, bei 20 Grad Celsius für 64 Stunden bis zum Stadium des jungen Erwachsenen. Übertragen Sie fünf adulte Würmer auf neue NGM-Platten ohne Chemikalien oder neue NGM-Platten mit der gleichen chemischen Vorbehandlung und inkubieren Sie sie 24 Stunden lang. Übertragen Sie die erwachsenen Tiere, wie gerade gezeigt, auf neue NGM-Platten und zählen Sie die Anzahl der Eizellen jeden Tag.

Zählen Sie außerdem die Würmer, die abgekrochen sind, gestorben sind oder innerlich geschlüpft sind. Führen Sie Berechnungen gemäß dem Textprotokoll durch. Wie hier gezeigt, verzögerte die Behandlung mit Etoposid nach 24 bis 96 Stunden das Wachstum von C.elegans signifikant.

Nach 96 Stunden Inkubation wuchsen die mit Etoposid behandelten Würmer auf eine Körperlänge von 0,86 Millimetern, während die mit Vehikeln behandelten Würmer auf 1,04 Millimeter anwuchsen. Eine Wachstumsverzögerung wurde auch unter stereomikroskopischer Beobachtung beobachtet, wie in diesen Bildern von Etoposid-behandelten Würmern im Vergleich zu kontrolliert behandelten Würmern zu sehen ist. Nach 72 Stunden Inkubation wurden Eier von den mit Vehikeln behandelten Würmern beobachtet.

Im Gegensatz dazu wurden Eizellen nach 96 Stunden Etoposidbehandlung beobachtet, was die Möglichkeit erhöht, dass die Etoposidbehandlung den Zeitpunkt der Erstgeburt von C. Elegans verzögerte. Wie in diesen Diagrammen dargestellt, wurde eine Abnahme der Gesamtzahl der Eizellen durch Etoposidbehandlung beobachtet, wenn die jungen erwachsenen Würmer kultiviert wurden, entweder in Gegenwart oder ohne kontinuierliche Etoposidbehandlung. Einmal gemeistert, kann diese Technik in einer Woche durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die chemische Toxizität von C.elegans, einem Modellnematoden, bewertet werden kann.