Multiplex-Zytokin Profilierung der stimulierten Maus Splenocyten mit Hilfe einer durchflusszytometrischen Bead-basierte Immunoassay-Plattform

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist die gleichzeitige Quantifizierung mehrerer Zytokinziele in Gewebekulturüberständen, die aus stimulierten Maus-Splenozyten unter Verwendung eines Multiplex-Bead-basierten Immunoassays und eines Durchflusszytometers entnommen wurden. Mit dieser Methode lassen sich zentrale Fragen der Immunologie beantworten, wie zum Beispiel: Was sind die einzigartigen Zytokinprofile, die die Immunantwort im Kontext bestimmter Krankheitszustände orchestrieren? Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die gleichzeitige Quantifizierung mehrerer Ringelwürmer mit weitaus weniger Probenvolumina als bei herkömmlichen ELISA-Formaten durchgeführt werden kann, während gleichzeitig die unspezifische Bindung reduziert wird.

Das Verfahren wird von Nicholas Johnsen, einem wissenschaftlichen Mitarbeiter aus unserem Produktentwicklungsteam, vorgeführt. Beginnen Sie dieses Verfahren mit der biologischen Probenvorbereitung, wie im Textprotokoll beschrieben. Zur Herstellung der vorgemischten Antikörper-immobilisierten Kügelchen wird die Flasche mit den vorgemischten Kügelchen eine Minute lang in einem Ultraschallbad bei Raumtemperatur beschallt.

Dann vor der Verwendung 30 Sekunden lang vortexen. Wenn kein Ultraschallbad verfügbar ist, erhöhen Sie die Vortexzeit auf eine Minute. Für die Standardzubereitung fügen Sie 250 Mikroliter Assay-Puffer hinzu, um den lyophilisierten Maus-Th-Zytokin-Standard-Cocktail zu rekonstituieren.

Mischen Sie, indem Sie es kurz vortexen, und lassen Sie das Fläschchen 10 Minuten bei Raumtemperatur ruhen. Füllen Sie den Standardcocktail in ein Mikrozentrifugenröhrchen aus Polypropylen mit der Bezeichnung C7 um. Dies wird als oberster Standard verwendet. Beschriften Sie sechs Mikrozentrifugenröhrchen aus Polypropylen mit C1 bis C6. Geben Sie 75 Mikroliter Assay-Puffer in jedes dieser Röhrchen.

Füllen Sie dann 25 Mikroliter des Top-Standards C7 in das C6-Röhrchen um und mischen Sie es gut durch Vortexen. Dies wird der C6-Standard sein. Führen Sie weiterhin serielle Verdünnungen von eins bis vier Mal durch, indem Sie für jedes Röhrchen eine neue Pipettenspitze verwenden, um 25 Mikroliter des vorherigen Standards zu den 75 Mikrolitern Assay-Puffer im nächstniedrigeren Standardröhrchen hinzuzufügen.

Nach jeder Zugabe vortexen. Verwenden Sie den Assay-Puffer als Null-Pikogramm pro Milliliter-Standard. Um den Assay durchzuführen, lassen Sie alle Reagenzien vor der Verwendung auf Raumtemperatur erwärmen.

dieser Demonstration werden Polypropylen-Filterplatten verwendet. Es ist unbedingt erforderlich, dass die Platte während des gesamten Testvorgangs, einschließlich der Waschschritte, aufrecht gehalten wird, um ein Verlieren der Kügelchen zu vermeiden. Befeuchten Sie das Filterpapier vor, indem Sie 100 Mikroliter 1X Waschpuffer in jede Vertiefung geben und die Platten eine Minute lang bei Raumtemperatur ruhen lassen.

Entfernen Sie das Puffervolumen mit Hilfe des Vakuumverteilers. Tupfen Sie überschüssigen Waschpuffer vom Boden der Platte ab, indem Sie die Platte auf einen Stapel sauberer Papiertücher drücken. Lege dann die Platte auf die umgedrehte Plattenabdeckung.

Für Zellkulturüberstandsproben geben Sie 25 Mikroliter Assay-Puffer in alle Vertiefungen. Geben Sie 25 Mikroliter jedes Standards in die Standardvertiefungen. Geben Sie abschließend 25 Mikroliter jeder Probe in die Probenvertiefungen.

Die gemischten Kügelchen 30 Sekunden lang vortexen. Geben Sie dann 25 Mikroliter der gemischten Kügelchen in jede Vertiefung und schütteln Sie die Perlenflasche von Zeit zu Zeit, um ein Absetzen der Perlen zu vermeiden. Versiegeln Sie die Platte mit einem Plattenversiegeler.

Nach dem Versiegeln wickeln Sie die gesamte Platte, einschließlich der umgedrehten Plattenabdeckung, mit Alufolie ein. Stellen Sie die Platte auf einen Plattenschüttler, befestigen Sie sie und schütteln Sie sie zwei Stunden lang bei Raumtemperatur bei ca. 500 U/min. Legen Sie die Platte ohne Umdrehen auf den Vakuumverteiler und wenden Sie das Vakuum wie zuvor an.

Geben Sie dann 200 Mikroliter 1X Waschpuffer in jede Vertiefung. Entfernen Sie den Inhalt der Vertiefungen der Assay-Platte durch Vakuumfiltration. Tupfen Sie überschüssigen Waschpuffer mit einem saugfähigen Pad oder Küchenpapier vom Boden der Platte ab, bevor Sie diesen Schritt noch einmal wiederholen.

Geben Sie anschließend 25 Mikroliter Nachweisantikörper in jede Vertiefung. Nachdem Sie die Platte mit einem frischen Plattenversiegeler versiegelt haben, wickeln Sie die gesamte Platte, einschließlich der umgekehrten Plattenabdeckung, mit Alufolie ein. Stellen Sie die Platte auf einen Plattenschüttler und schütteln Sie sie eine Stunde lang bei ca. 500 U/min bei Raumtemperatur.

Geben Sie ohne Vakuumieren 25 Mikroliter Streptavidin-Phycoerythrin-Reagenz direkt in jede Vertiefung. Verschließen und wickeln Sie die Platte wie zuvor ein. Stellen Sie dann die Platte auf einen Plattenschüttler und schütteln Sie sie 30 Minuten lang bei ca. 500 U/min bei Raumtemperatur.

Nachdem Sie den Vakuumfiltrationsschritt zweimal wiederholt haben, geben Sie 200 Mikroliter 1X Waschpuffer in jede Vertiefung. Hängen Sie die Perlen wieder für eine Minute auf einen Plattenschüttler. Übertragen Sie die Proben mit einer Mehrkanalpipette von der Filterplatte in FACS-Röhrchen, um die Proben auf einem Durchflusszytometer abzulesen.

Starten Sie das Durchflusszytometer und die Erfassungssoftware gemäß den Anweisungen des Herstellers, die mit dem Gerät geliefert wurden. Erstellen Sie ein Punktdiagramm mit Vorwärtspunktung auf der X-Achse und Seitenpunktung auf der Y-Achse. Stellen Sie die Vorwärtsstreuung und die Seitenstreuung auf den linearen Modus ein.

Bewegen Sie das Fläschchen mit den rohen Kügelchen, die im Kit enthalten sind, 30 Sekunden lang, um die Kügelchen wieder aufzuhängen. Übertragen Sie 400 Mikroliter der Rohkügelchen in ein neues FACS-Röhrchen. Stellen Sie die Durchflussrate des Durchflusszytometers auf niedrig ein.

Lassen Sie die Rohperlen laufen und passen Sie die Verstärkung und die Spannung für Durchlassstreuung und Seitenstreuung sorgfältig an, so dass beide Größenpopulationen dieser Kügelchen sichtbar getrennt und leicht zu gaten sind. Passen Sie den Schwellenwert für die Vorwärtsstreuung an, um unerwünschte Ereignisse auszuschließen. Zeichnen Sie im Streudiagramm zwischen Vorwärts- und Seitenstreuung ein Tor, das alle Perlenpopulationen enthält.

Zeigen Sie die Gated Bead-Populationen aus dem Streudiagramm nach vorne im Vergleich zum seitlichen Streudiagramm im zweiten Punktdiagramm an, wobei PE auf der X-Achse und APC für die Y-Achse angezeigt wird. Passen Sie die PMT-Spannung für den APC-Fluoreszenzkanal so an, dass das APC-Signal für alle Bead-Populationen eine mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) zwischen 10 und 5.000 aufweist. Als nächstes wirbeln Sie das Fläschchen mit den PE-Setup-Kügelchen 30 Sekunden lang vortexen, um die Kügelchen wieder aufzuhängen.

Übertragen Sie 400 Mikroliter der resuspendierten PE-Kügelchen in ein neues FACS-Röhrchen. Ersetzen Sie das Rohkügelchenröhrchen im Durchflusszytometer durch das PE-Kügelchenröhrchen. Passen Sie die Spannung der Photomultiplier-Röhre für die Einstellung des PE-Fluoreszenzkanals so an, dass der MFI der PE-Kügelchen zwischen dem chargenspezifischen Bereich liegt, der auf dem PE-Kügelchenfläschchen aufgeführt ist.

Um die Datenerfassung durchzuführen, legen Sie die Anzahl der zu erfassenden Bead-Ereignisse auf etwa 300 pro Anolyt fest. Wirbeln Sie jede Probe fünf Sekunden lang vor, bevor sie analysiert wird. Lesen Sie dann die Beispiele.

Stellen Sie beim Ablesen der Proben das Durchflusszytometer zuerst in den Setup-Modus und warten Sie, bis sich die Bead-Population stabilisiert hat, bevor Sie in den Erfassungsmodus wechseln. Exportieren Sie nur die Gated Events und nicht die Gesamtereignisse, bevor Sie die Datenanalyse durchführen, wie im Textprotokoll beschrieben. Repräsentative Standardkurven für Zielanolyten wurden mit dem Maus-T-Helfer-Zytokin-Panel erstellt.

Ordnungsgemäß durchgeführte Assays zeigen Kurven mit breiten dynamischen Bereichen, wie hier gezeigt. Bei jeder Durchführung des Assays müssen Standardkurven ausgeführt werden. Maus-Splenozyten wurden unter verschiedenen Bedingungen für 48 Stunden kultiviert.

Kulturüberstände wurden gesammelt und dann die Konzentrationen von 13 Zielen mit dem T-Helfer-Zytokin-Panel der Maus quantifiziert. Differentielle Zytokin-Expressionsprofile als Reaktion auf Stimulationsbedingungen sind deutlich sichtbar. Einmal gemeistert, kann die Labortischarbeit dieser Technik in weniger als fünfeinhalb Stunden abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Die Datenerfassung und die nachgelagerten Analysezeiten variieren je nach Anzahl der Proben. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie dieses Protokoll anwenden und die Anolytkonzentrationen in biologischen Proben mit einem zytometrischen, bead-basierten Immunoassay quantifizieren können. Dazu gehören die Vorbereitung der Reagenzien, die Inkubationsschritte und die Einrichtung des Durchflusszytometers für die Datenerfassung.