Name: Vollständig-hängen Clearing und Färbung des Arabidopsis Blume Organe und Siliques (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Lernen Sie die Präparation von Arabidopsis-Blüten und -Schoten durch Clearing und Färbung für die Entwicklungsbiologie. Diese Methode ermöglicht die schnelle Analyse verschiedener Entwicklungsstadien.

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Diese Arbeit wurde unterstützt von der Universität Zürich, ein IEF Marie Curie Grant (keine zu gewähren. TransEpigen-254797, A.H.), ein Advanced Grant des Europäischen Forschungsrates (keine zu gewähren. Medea-250358, UG), und ein Projekt Forschung und Technologieentwicklung (Grant MecanX, UG) von SystemsX.ch, die Schweizer Initiative in Systembiologie.

1. Blume und Schote Fixierung
<ol><li>Ernte Blumen und Siliques aus Pflanzen synchronisiert bei der Eröffnung der ersten Blüte. Hinweis: Unter den experimentellen Bedingungen hier verwendete, Pflanzen blühen beginnen ungefähr 21 Tage nach der Transplantation von Murashige und Skoog (MS) Platten zu Boden. Samen sind geschichtete für 3 – 4 Tage bei 4 ° C und gekeimt/gewachsen auf MS-Platten bei 22 ° C/16 h Licht und 18 ° C/8 h dunkel für 8 bis 10 Tage vor der Verpflanzung der Sämlinge auf nährstoffreichen Böden in Töpfen gehalten unter den gleichen Bedingungen (Abbildung 1). Die Anzahl der Wiederholungen hängt von der spezifischen Forschungsziel, aber mindestens 5 Blütenstände (aus 5 einzelnen Pflanzen) für jede Behandlung wird empfohlen. Blumen sind das Versuchsgerät, empfiehlt ein Minimum von 10 Blüten pro replizieren.</li>
	<li>Schneiden Sie Blütenstände oder Blumen (Abb. 1E-H) mit einer kleinen Schere (z.B. Nagelschere) und legen Sie sie sofort in einem Microcentrifuge Schlauch (für einzelne Blütenstand/Blume Fixierung) oder eine konische Rohr (für kollektive Fixierungen) mit frisch gemacht Carnoy, Methanol/Essigsaure Säure oder FPA50 Fixiermittel (je nach Anwendung, siehe unten) auf dem Eis. Hinweis: Proben sollten vollständig in das Fixiermittel eingetaucht werden.</li>
	<li>Lassen Sie das Gewebe innerhalb der Fixiermittel für 4 h bei 4 ° c über Nacht Hinweis: Vakuum Infiltration kann verwendet werden, für die Beschleunigung des Eindringen von das Fixiermittel in das Gewebe, aber dies möglicherweise nachteilig für die Erhaltung der Struktur des Gewebes. Die Autoren umsetzen Vakuum Infiltration nicht.</li>
	<li>Das Fixiermittel zu entfernen, fügen Sie genügend 70 % igem Ethanol um die Proben zu decken, und bringt sie auf 4 ° C für mindestens 24 h; Proben können auf unbestimmte Zeit in dieser Lösung bleiben. Nach dem Entfernen von Ethanol, sofort mit dem nächsten Schritt fortfahren; Dissektion oder SDS-Clearing.</li>
</ol>2. Präparation unter dem Stereomikroskop
<ol><li>Setzen Sie gemacht frisch 70 % Ethanol in einem Uhrmacher Glas auf eine kleine Petrischale für Unterstützung.</li>
	<li>
Ort der Blütenstand/Blume/Schote dazu frisch aus Fixiermittel und unter dem Stereomikroskop mit Zange und eine Spritze mit einer Nadel zu sezieren.
	<ol>
<li>Verwenden Sie ein Uhrmacher Glas oder ähnliches Gerät, das die Proben mit Ethanol (empfohlen) für die Zerlegung der Blütenstände und zerreißen blütenorganen Reifen Blüten (Kelchblätter, Blütenblätter und Staubfäden können in diesem Stadium seziert werden total überzogen sein können ), das Risiko von Proben Austrocknen zu vermeiden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sezieren Sie Siliques und kleine Blütenknospen auf einer Folie, wie unten beschrieben.
	<ol>
<li>Der Uhrenhersteller Glas mit vorbehandelte Proben beiseite, und verwenden Sie eine normale Folie für die endgültigen Zerlegung.</li>
		<li>Verschieben der Probe von Interesse auf die Folie und fügen Sie 10 µL frisch 70 % Ethanol. Arbeiten Sie zügig auf die endgültigen Zerlegung und 10 µL Ethanol, fügen Sie, falls nötig, um die Probe ohne übermäßige Flüssigkeit feucht zu halten.</li>
		<li>Für Freigabe Pollenkörner von Staubblättern, siehe Punkt 5.1. Folgen Sie für sezieren Fruchtblätter und Eizellen, Verfahren Sie wie in Abbildung 2. Dieses Verfahren gilt für alle Phasen der Entwicklung von Fruchtblatt, einschließlich der Entwicklungsstand des grünen Siliques. Hinweis: Fügen Sie Ethanol nicht hinzu, wenn es ausreichend Ethanol Verschleppung gibt von bewegten die Proben; sehr kleine Proben sezieren ist viel einfacher in eine minimale Menge an Flüssigkeit. Halten Sie immer nur die Organe von Interesse (Kelchblätter, Blütenblätter, Staubblätter, Fruchtblätter, Eizellen, Samen oder Pollenkörner) auf der Folie. Dieses Verfahren sorgt für eine gleichmäßige Dicke zwischen der Folie und Deckglas, entspricht der Dicke des Organs untersucht, wodurch eine höhere Homogenität und damit Effizienz für mikroskopische Untersuchungen (höhere Anzahl von Ziel-Proben in der gleichen Brennebene).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verwenden Sie ein kleines Stück Löschpapier zu absorbieren und so viel Ethanol als möglich zu entfernen. Schnell fahren Sie mit dem nächsten Schritt (Kapitel 3, 4 oder 6) vor der Probe austrocknet.</li>
</ol>3. Chloral Hydrate-basierte Abrechnung und kombinierte Clearing-Färbung
Hinweis: Beste Ergebnisse für Chloral Hydrate-basierte Clearing werden mit FPA50 befestigt Material erzielt.
<ol><li>Platz 20 µL der clearing-Lösung (Chloral Hydrate/Glycerin, modifizierte Hoyers Medium, die Herr 4½ oder Herr der IKI-4½ Lösungen) auf der Probe-Lager-Folie. Mit ein paar Spritzen mit hypodermal Nadeln, positionieren die Proben nach Bedarf durch Verringerung des Raumes zwischen ihnen, und spiegeln diejenigen wo steht das Organ der Zinsen nach unten. Entfernen Sie alle verbleibenden Luftblase mit der Nadel.</li>
	<li>Senken Sie ein Deckglas seitlich zu sanft legen Sie es, sehr sanft drücken und warten Sie, bis die Clearing-Lösung den Raum dazwischen füllt. Bei Bedarf den gesamte Raum unter dem Deckglas füllen, fügen Sie minimale Clearing-Lösung hinzu.</li>
	<li>Legen Sie die Folie auf einen Diahalter und lassen Sie es unter dem Abzug. Fahren Sie mit mikroskopischen Beobachtungen nach mindestens 4 h und in den nächsten 4 – 5 Tagen.</li>
</ol>4. Alexander Färbung und der Herr 4½ Räumung der Antheren kombiniert
Hinweis: Das ursprüngliche Alexander-Protokoll basiert auf Freigabe Pollenkörner auf der Folie vor Verschmutzung. Eine effiziente und informativer, Alexander Färbung und clearing-Verfahren ist die Färbung der Reife Pollenkörner im Reifen aber nicht aufspringende Antheren geändert.
<ol><li>Wählen Sie aus frisch geernteten Blütenknospen, die mit nicht aufspringende Antheren öffnen. Hinweis: Nehmen Sie jüngere Blütenknospen nicht, weil Alexander Färbung sich an Reife Pollenkörner richtet und nicht effizient unreifen Pollenkörner befleckt. Ein Minimum von 5 Blüten pro Behandlung aus verschiedenen Pflanzen und Blütenstände geerntet wird empfohlen.</li>
	<li>Bereiten Sie eine 96-Well-Platte mit genügend Alexander Lösung um eine Blütenknospe zu versenken. Setzen Sie die Staubbeutel durch Entfernen der Kelchblätter und Kronblätter und tauche sie in Alexanders Lösung. Halten Sie die Proben unter dem Abzug für 1 – 3 h.</li>
	<li>Ersetzen Sie Alexanders Lösung zu, mit der Herr 4½ Lösung und setzen Sie die Multi-well-Platte wieder unter dem Abzug für eine Inkubation über Nacht.</li>
	<li>Mit Pinzette, sanft bewegen Sie die geräumten Blütenknospen in eine neue Folie. Da einige Verschleppung von Alexanders Lösung auftreten kann, verwenden Sie ein Löschpapier, um soviel Clearing-Lösung wie möglich zu entfernen.</li>
	<li>Die staubblätter zu sezieren und andere Gewebe zu entfernen. Führen Sie die Schritte in Abschnitt 3 des Herrn 4½-Lösung.</li>
</ol>5. entfernen die Exine aus Pollenkörner
Hinweis: Wir empfehlen Carnoy Fixativ für DAPI-Färbung.
<ol><li>Führen Sie die Fixierung und Dissektion Verfahren, die in den Abschnitten 1 und 2 beschrieben. Jetzt sollte man ein bis viele staubblätter auf der Folie in einen Mindestbetrag von 70 % Ethanol haben.</li>
	<li>Verwenden Sie ein Löschpapier, um überschüssige Ethanol zu entfernen, und fügen Sie 5 – 10 µL DAPI-Lösung. Mit ein paar Spritzen mit Nadeln, lassen Sie die Pollenkörner in diese kleine Menge Lösung (z. B.Verwendung einer Spritze, die Staubfäden und andererseits die Pollenkörner freizugeben zu immobilisieren). Fügen Sie ein weiteres 5 µL DAPI, wenn die Lösung trocknet aus.</li>
	<li>Entfernen allen Schmutz von den Staubfäden ist ein wichtiger Schritt, so, dass nur Pollenkörner sind zwischen der Folie und dem Deckglas Links.</li>
	<li>Platzieren Sie ein Deckglas auf der Probe-Lager-Folie durch seitlich absenken und fügen Sie die minimale Menge an DAPI-Lösung erforderlich, um den Raum zu füllen. Legen Sie einen Zeigefinger auf das Deckglas und ohne quetschen zu viel machen eine schnelle, feste und kurze Gleitbewegung. Hinweis: Um die notwendige Kraft und die Amplitude der gleitenden Bewegung einschätzen zu können, sollte diesen Schritt mehrmals geübt werden überprüft die Ergebnisse jedes Mal unter die Lupe genommen.</li>
	<li>DAPI-Lösung bei Bedarf hinzufügen und statt die Folie in eine feucht-Box im Dunkeln bei 4 ° C für 15 min bis 1 Uhr weiter Proben unter Weitfeld-Fluoreszenz oder konfokalen Mikroskopie innerhalb von 24 Std. zu beobachten versuchen, dieses Verfahren mit SDS löschen um zu überprüfen, ob weitere kombinieren verbessern rungen können abgerufen werden.</li>
</ol>(6) Sodium Dodecyl Sulfat (SDS) löschen
Hinweis: Je nach floralen Organ analysiert werden, und auf der Forscher Fähigkeiten, sehr weich und kleine Exemplare zu zergliedern, die SDS-Behandlung kann erfolgen entweder vor (für erfahrene Forscher) oder nach der Dissektion Schritt (für weniger erfahrene Forscher) auf Methanol Essigsäure Säure Material fixiert.
<ol><li>Verwenden Sie ein Uhrmacher Glas, eine konkave Folie oder einem Microcentrifuge Schlauch sezierte oder nicht seziert Proben in 1 % SDS und 0,2 N NaOH-Lösung über Nacht bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Mit Vorsicht zu handhaben, weil die Probe sehr weich ist und eine transparente Erscheinung hat. Mehrmals mit Wasser abspülen. Hinweis: Reste der SDS-Lösung können zu Niederschlag führen, beim Hinzufügen der Färbelösung, z.B., Anilin-blau.</li>
	<li>Folgen Sie für nicht seziert Proben Dissektion Verfahren Sie wie in Abschnitt 2, mit Wasser statt 70 % Ethanol. Entfernen Sie nach sezieren das gewünschte Gewebe alle Reste und Schmutz und überschüssiges Wasser mit einem Löschpapier, dann fügen Sie 20 – 40 µL der Färbelösung und fahren Sie mit Schritt 6.5.</li>
	<li>Für seziert Proben sorgfältig bewegen der Probenmaterials aus der Waschlösung und legen Sie sie in eine saubere Folie und fügen Sie 20 – 40 µL der Färbelösung.</li>
	<li>Legen Sie ein Deckglas vorsichtig auf der Folie durch seitlich absenken. Achten Sie darauf, nicht um die Vorbereitung zu zerquetschen. Wenn das Gewebe zu weich ist, verlassen findet eine Trennlinie in der Folie und dem Deckglas an seinen Ecken (z.B., Band oder einem gebrochenen deckgläschen), dünn einen Kammer-artigen Raum zwischen Folie und Deckglas, derart, dass das Deckglas die Probe vernichten nicht.</li>
	<li>Legen Sie die Folien in einem feucht-Box, mit Alufolie decken Sie ab, und legen Sie sie bei 4 ° C für mindestens 1 Stunde fahren Sie mit die Probe mit Weitfeld-Fluoreszenz oder der konfokalen Mikroskopie innerhalb von 24 h zu beobachten.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Die Existenz von vielen Blütenknospen innerhalb einer einzigen Blütenstand der Arabidopsis, überspannt alle Blume Entwicklungsstadien, bietet eine einzigartige Gelegenheit für Studien, die darauf abzielen, einen Effekt der Behandlung oder eine Entwicklungsstörung Funktion charakterisieren gleichzeitig über die verschiedenen Phasen der Blütenentwicklung. Ein guter Bezugspunkt zwischen verschiedenen Einzelpflanzen ist die Eröffnung der ersten Blüte der wichtigsten Blütenstand. Pflanzen werden behandelt, so dass Bl...

Blumen sind eines der wichtigsten Organe der Angiospermen definieren. Blühende Pflanzen erschienen vor 90 Millionen Jahren1, und so schnell, dass ihre schnelle aussehen als eine "abscheuliche Geheimnis" von Charles Darwin2beschrieben wurde diversifiziert. Die Interessen der Pflanzenforscher Blütenentwicklung sind vielfältig. Einige Forschung konzentriert sich auf das Verständnis des evolutionären Ursprungs der Blume als Ganzes oder die Entwicklung der spezifischen anatomischen, strukturelle und funktionelle Eigenschaften von Blumen3,4,5,6 . Die hohe Varianz in florale Form und Struktur sowie die Modi der sexuelle und asexuelle Reproduktion unter Berufung auf sie, machen der Blume ein hochkomplexes Gebilde. Dies führte zu vielfältigen Bemühungen um die Anatomie und strukturelle Eigenschaften von blütenorganen, mit Licht und Elektronen mikroskopischen Techniken, die in mit genetischen und molekularbiologischen Untersuchungen7 Kombinationzu charakterisieren. Darüber hinaus als Quelle von Früchten und Samen, sind Blumen von größter Bedeutung für die Human-und Tierernährung. Daher hat die Charakterisierung von Blüte und Frucht Entwicklung viele Konsequenzen für angewandte Forschung, einschließlich der Sicherung der Ernährung einer wachsenden Weltbevölkerung und ökologische Erhaltung Strategien im Rahmen einer sich ändernden Umwelt8 , 9 , 10.
Blütenentwicklung in Arabidopsis beginnt mit Blume Induktion und die Transformation von der vegetativen Meristem, ein Blütenstand (Gruppe von Blumen) Meristem. Blume Primordia sind seitlich an der Flanke der Blütenstand Meristem11eingeleitet. Die floralen Orgel Primordia schrittweise in konzentrischen Windungen von außen in die Mitte der Blüte zu bilden und schließlich in Kelchblätter, Blütenblätter, Staubblätter und Fruchtblätter7entwickeln. Diese blütenorganen erfüllen unterschiedliche nutritive, Schutz- und funktionale (z.B.Bestäuber Attraktion) Rollen in verschiedenen Pflanzenarten mit den Geschlechtsorganen, die nachhaltige Entwicklung der männlichen und weiblichen Gametophyten, bzw.12 , 13. die Gametophyten wiederum jeweils ein paar männlich (Sperma) unterscheiden und weiblichen Gameten (Ei und zentrale Zelle), die auf einen doppelte Befruchtung an die nächste Generation, die Zygote und primäres Endosperm bilden ein terminal Gewebe unterstützen die Entwicklung des Embryos14,15. Frucht und Samen Entwicklung unterstützen das Wachstum, Reifung und Konservierung des Embryo und schließlich seine Ausbreitung. Umfangreicher Forschung ist durchgeführt worden, zur Charakterisierung von Blume und Embryo Entwicklung in verschiedenen Pflanzenarten, vor allem in der Modell-Spezies Arabidopsis7,16,17.
Frühe mikroskopische Analysen der Blütenentwicklung beruhten auf zeitraubende Probenbearbeitung und Beobachtung, dass Techniken wie Paraffin oder Harz einbetten und -Schnitt, mit Licht oder Elektronenmikroskopie kombiniert. Diese traditionellen mikroskopischen Techniken wurden oft in Kombination mit molekularen genetischen Untersuchungen, wie mikroskopische Analysen von Mutanten, die Lokalisierung der RNA durch in Situ Hybridisierung oder die Immuno-Erkennung von Proteinen verwendet. Jüngste Fortschritte im Weitfeld- und konfokale Fluoreszenzmikroskopie in State-of-the-Art 3-d CAD-Bild-Analysen und die kontinuierliche Verfeinerung der molekularen Methoden, die auf gering verarbeitete ganze-Mount Proben verwendet werden kann führte zu einem Bedarf an Beispiel für effiziente und minimale Verarbeitungstechniken, die Quantitative Analysen bevorzugt zugänglich sind. In den letzten Jahren erhebliche Fortschritte bei der Entwicklung von Clearing-Techniken auf tierische Probe vollständig-hängen. Machen sie der Probe transparent entweder mit wässrigen Harnstoff oder zuckerhaltigen Reagenzien (z. B., Maßstab, SeeDB, KUBISCH)18,19,20, oder selektiv entfernen Lipide (unter Verwendung des Waschmittels SDS) nach Proben einbetten in stabilen Hydrogele; die Entfernung von Lipiden kann entweder durch passive Diffusion (z.B.Klarheit Protokoll21, Pakt-PARS-Felgen22geändert) oder aktiv durch Elektrophorese (ursprüngliche Klarheit Protokoll23 und ACT-PRESTO-24). Ermutigt durch diese schnelle Fortschritte, entstehen einige abgeleiteten Techniken auch für den Einsatz in Anlagen.
In diesem Methodenpapiers konzentrierte sich auf das Modell Arabidopsisbeschreiben wir das Verfahren für die ordnungsgemäße Zerlegung des jungen Siliques, Knospen und Blumen, und die Räumung des gesamten-Mount Proben für unterschiedliche Färbung und Beobachtung Verfahren mit klassische oder eine aktuelle SDS-basierte Clearing-Methode. Beispiele für Stärke, Zellstress und Chromatin zu beflecken. Obwohl diese Verfahren weitere Verbesserungen und Anpassungen bei Verwendung mit anderen Arten benötigen können, hoffen wir, dass sie die Bühne für die weitere Forschung auf diese einfachen, aber wichtigen Methoden festgelegt werden, die der Ausgangspunkt zahlreicher Forschungsprojekte sind.

<table><tbody><tr><td>Reagenzien und Materialien</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Scharlau</td><td>ET00102500</td><td></td></tr><tr><td>Essigsäure</td><td>Applichem</td><td>A3686,2500</td><td>100% Molekularbiologie</td></tr><tr><td>Gletscheressigsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320099</td><td></td></tr><tr><td>Molekularbiologie Methanol</td><td>Scharlau</td><td>ME03062500</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehydlösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1635</td><td></td></tr><tr><td>Propionsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81910-250 ml</td><td></td></tr><tr><td>Chloralhydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15307</td><td></td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Roth</td><td>3783.1</td><td></td></tr><tr><td>Gummi arabicum</td><td>Fluka</td><td>51198</td><td></td></tr><tr><td>Milchsäure</td><td>Fluka</td><td>69773</td><td></td></tr><tr><td>Phenol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77607-250ML</td><td>Wir haben flüssiges Phenol verwendet (verwenden Sie die Dichte, um das erforderliche Volumen für Ihre Lösung zu finden)</td></tr><tr><td>Nelkenöl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8392-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Xylol</td><td>Roth</td><td>4436.1</td><td></td></tr><tr><td>Jod</td><td>Fluka</td><td>57665</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumiodid</td><td>Merck</td><td>5043</td><td></td></tr><tr><td>Malachitgrün</td><td>Fluka</td><td>63160</td><td></td></tr><tr><td>Fuchsinsäure</td><td>Fluka</td><td>84600</td><td></td></tr><tr><td>Orange G</td><td>Sigma</td><td>7252</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71690</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdihydrogenphosphat</td><td>Applichem</td><td>A1047,1000</td><td></td></tr><tr><td>Natriumphosphat zweibasisch</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9763-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumphosphat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>04347</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Applichem</td><td>A2937,1000</td><td></td></tr><tr><td>Calcofluor</td><td>Sigma</td><td>F6259</td><td>Fluoreszierender Aufheller 28</td></tr><tr><td>Auramine</td><td>Chroma</td><td>10120</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>giftig</td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Anilinblau</td><td>Merck</td><td>1275</td><td></td></tr><tr><td>MS medium</td><td>Carolina</td><td>19-57030</td><td></td></tr><tr><td>Nährstoffreiches Substrat</td><td>Einheitserde</td><td>ED73</td><td></td></tr><tr><td>Uhrmacherglas</td><td></td><td></td><td>Keine Marke</td></tr><tr><td>15 ml Falcon Zentrifugenröhrchen</td><td>VWR</td><td>62406-200</td><td></td></tr><tr><td>Dumond Pinzette</td><td>Actimed</td><td>0208-5SPSF-PS</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>DUMONT BIOLOGY</td><td>0108-5</td><td></td></tr><tr><td>Spritze</td><td>BD</td><td>BD Plastipak 300013</td><td>1 ml</td></tr><tr><td>Präparationsnadel</td><td>BD</td><td>BD Microlance 304000</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger</td><td>Thermo Scientific</td><td>10143562CE</td><td>Schnittkanten</td></tr><tr><td>Deckgläser</td><td>Thermo Scientific</td><td>DV40008</td><td></td></tr><tr><td>Feuchtbox</td><td></td><td></td><td>Eine Plastikbox mit feuchtem Papiertuch und Schiebestützen inside</td></tr><tr><td>Name</td><td>Unternehmen</td><td>Katalognummer</td><td><>Kommentare</td></tr><tr><td>Lösungen<</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>strong>Fixatives</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>Fixiermittel <td></td><td></td> von <td>Carnoy (Farmer)</td><td>Absolutes Ethanol : Eisessig, 3:1 (ml:ml)</td></tr><tr><td>Methanol/Essigsäure-Fixiermittel</td><td></td><td></td><td>50 % (v/v) Methanol, 10 % (v/v) Eisessig in deionisiertem Wasser</td></tr><tr><td>FPA50-Fixiermittel</td><td></td><td></td><td>Formalin, Propionsäure, 50 % Ethanol; 5:5:90 (ml:ml:ml)</td></tr><tr><td><stark>Reinigungslösungen</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chloralhydrat/Glycerin</td><td></td><td></td><td>Chloralhydrat : Glycerin : Wasser, 8:1:2 (g:ml:ml). Kann für alle Entwicklungsstadien der Blüte und für die silique-Entwicklung mit DIC-Mikroskopie verwendet werden. Das beste Fixiermittel ist das auf Formalin basierende FPA50</td></tr><tr><td>Modified Hoyer</td><td></td><td></td><td>Gum arabicum 7,5 g, Chloralhydrat 100 g, Glycerin 5 ml, Wasser 30 ml. Kann für alle Entwicklungsstadien der Blüte und für die silique-Entwicklung mit DIC-Mikroskopie verwendet werden. Das beste Fixiermittel ist das auf Formalin basierende FPA50</td></tr><tr><td>Herr's 4&frac12; Reinigungsflüssigkeit</td><td></td><td></td><td>Milchsäure, Chloralhydrat, Phenolkristalle, Nelkenöl, Xylol; 2:2:2:2:1, nach Gewicht. Kann für alle Entwicklungsstadien der Blüten (insbesondere für die Staubblattentwicklung) und für die Siliqueentwicklung mit DIC-Mikroskopie verwendet werden. Das beste Fixiermittel ist die auf Formalin basierende FPA50</td></tr><tr><td>SDS/NaOH-Lösung</td><td></td><td></td>: <td>Verdünnen Sie das SDS und die NaOH-Stammlösung auf 1% SDS / 0,2 N NaOH (10-fache Verdünnung). Für alle Stadien der Blüten- und Silique-Entwicklung. Das beste Fixiermittel ist das Methan/Essigsäure-Fixiermittel; Die beiden anderen Fixiermittel können ebenfalls verwendet werden. Kann mit Calcofluor-, Auramin-, DAPI- und Anilinblau-Färbelösung kombiniert werden.</td></tr><tr><td>SDS-Stammlösung</td><td></td><td></td><td>10 % (w/v) Natriumdodecylsulfat. 10 g Natriumdodecylsulfat in 80 ml deionisiertem Wasser auflösen und mit entionisiertem Wasser auf 100 ml auffüllen.</td></tr><tr><td>NaOH-Stammlösung</td><td></td><td></td><td>2 N NaOH-Lösung: 4 g NaOH in 40 ml entionisiertem Wasser auflösen und mit entionisiertem Wasser auf 100 ml auffüllen</td></tr><tr><td><stark>Kombinierte Reinigungs- und Färbelösungen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Herr's IKI-4&frac12;</td><td></td><td></td><td>Zu einem Standard 4&frac12; (9 g insgesamt) fügen Sie hinzu: 100 mg Jod, 500 mg Kaliumjodid. Diese Reinigungslösung kann für alle Entwicklungsstadien der Blüten und für die Silique-Entwicklung verwendet werden, entweder zur Erhöhung des Kontrasts oder zur Charakterisierung der Stärkedynamik. Verwenden Sie FPA50 für die Strukturanalyse und Carnoy's Fixativ für die quantitative Stärkeanalyse.</td></tr><tr><td>Alexander-Färbung</td><td></td><td></td><td>Ethanol 95% 10ml, Malachitgrün (1% in 95% EtOH) 1 ml, Fuchsinsäure (1% in ddH2O) 5ml, orange G (1% in ddH2O) 0,5ml, Phenol 5g, Chloralhydrat 5g, Eisessig 2ml, Glycerin 25ml . Diese Reinigung/Färbung allein oder in Kombination mit Herr's 4&frac12; Die Lösung kann verwendet werden, um Pollenaborte bei Blüten mit reifen und dreizelligen Pollenkörnern zu bewerten. Es wird auf frisch geharvtem, nicht fixiertem Material verwendet.</td></tr><tr><td><stark>Färbelösungen</stark>Calcofluor-Lösung</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td></td><td></td><td>Calcofluor 0,007% in Wasser (g:ml). Ursprünglich als optischer Aufheller verwendet. Kann zum Färben von Cellulose, carboxylierten Polysacchariden und Callose in Zellwänden verwendet werden. Wird häufig verwendet, um das Intine des Pollenkorns zu färben. Alle drei Fixiermittel können mit dieser Lösung verwendet werden.</td></tr><tr><td>Auramin Lösung</td><td></td><td></td><td>Auramin 0,01% in Wasser (g:ml). Dieser lipophile Fluoreszenzfarbstoff kann unter anderem zum Färben von Nagelhaut, Cutin und Exin verwendet werden. Alle drei Fixiermittel können mit dieser Lösung verwendet werden</td></tr><tr><td>Calcofluor-Auramin Mischung</td><td></td><td></td><td>Auramin Lösung : Calcofluor Lösung, 3:1. Kann für eine kombinierte Färbung durch beide Lösungen verwendet werden. Andere Anteile können unter Beibehaltung eines geringeren Anteils von Calcofluor im Vergleich zu Auramin bestimmt werden.</td></tr><tr><td>DAPI-Lösung</td><td></td><td></td><td>DAPI 0,4 μg/ml, 0,1 M Natriumphosphatpuffer (pH 7), 0,1 % Triton-X-100, 1 mM EDTA. Diese Lösung kann zur Färbung von Chromosomenausbreitungen während der männlichen und weiblichen Meiose und von Zellkernen beliebiger Gewebe verwendet werden. Wird häufig zur Untersuchung der Entwicklung von Pollenkörnern verwendet. Carnoy und Methanol/Essigsäure sind die besten Fixiermittel für diese Lösung. Fixiermittel auf Formaldehydbasis wie FPA50 können die Färbung beeinträchtigen. Anregung im UV und maximale Emission um 461 nm.</td></tr><tr><td>Natriumphosphatpuffer (0,1 M)</td><td></td><td></td><td>Protonenrezeptor: 0,2 M Na2HPO4, Protonendonor: 0,2 M NaH2PO4, Verhältnis Protonendonor / Protonenrezeptor: 1,364 ( für einen pH 7)</td></tr><tr><td>Anilinblaulösung</td><td></td><td></td><td>0,1% (w/v) Anilinblau, 108 mM K3PO4 (pH 11), 2% Glycerin. Diese Lösung kann zum Färben von Callose und Cellulose in vielen Entwicklungsstadien verwendet werden (z. B. Calloseablagerung in männlichen und weiblichen Teraden, Callose-Pfropfen in Pollenschläuchen). Anregung im UV und maximale Emission um 455. Es kann auch bei 514 nm angeregt werden, wobei die Emission im roten Bereich für die Färbung des Zellinhalts erfolgt.</td></tr></tbody></table>

vollständig-hängen clearing und färbung des arabidopsis blume organe und siliques

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Aufgrund seiner gewaltigen Werkzeuge für Molekulare genetische Studien ist Arabidopsis Thaliana eines der prominentesten Modell Arten in Pflanzenbiologie und insbesondere Anlage Reproduktionsbiologie. Allerdings beinhalten Pflanzen-morphologische, anatomische und Ultrastrukturforschung Analysen traditionell zeitraubende einbetten und Verfahren für Hellfeld, Scannen und Elektronenmikroskopie-Schnitt. Jüngste Fortschritte in konfokale Fluoreszenzmikroskopie, State-of-the-Art 3-d-CAD-mikroskopische Analysen und die kontinuierliche Verbesserung der molekularen Techniken auf gering verarbeitete ganze-Mount Proben verwendet werden führte zu einer steigenden Nachfrage nach Entwicklung effizienter und minimale Probe Verarbeitungstechniken. In diesem Protokoll beschreiben wir Techniken für richtig sezieren Arabidopsis Blumen und Siliques, grundlegende Techniken, clearing und einige befleckenden Verfahren zur gesamten-Mount Beobachtungen der reproduktiven Strukturen.

Arabidopsis gehört zur Familie Brassicacea, Lager Blütenstände mit bisexuell Blumen in einer doldentraube (Abbildung 1). Jede Blume hat vier Kelchblätter, vier Blütenblätter, sechs staubblätter (vier lange und zwei kurze) und ein syncarpous Gynoeceum, bestehend aus zwei Geburt an geschmolzenen Fruchtblätter (Abb. 1F-H) in vier konzentrische Umgänge25,2...

In diesem Protokoll wir beschreiben Techniken für die richtige Zerlegung von Arabidopsis Blumen und Siliques, einige grundlegende Clearing-Techniken und Färbung Verfahren für ganz-Mount Beobachtungen der reproduktiven Strukturen ausgewählt.

Vollständig-hängen Clearing und Färbung des Arabidopsis Blume Organe und Siliques

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, ...

Dieses Protokoll beschreibt, wie Blütenknospen, Blüten und junge Siliken richtig zerlegt werden. Und die anschließende Ganzmontage-Räumung für diverse Färbe- und Betrachtungstechniken. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der sexuellen Pflanzenproduktion zu beantworten.Wie z.B. eine stetige Mutantenanalyse oder ein umwelt- und experimentell induziertes Versagen in der Blütenentwicklung und -funktion. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie ein einfaches und schnelles Screening vieler Entwicklungsstadien gleichzeitig ermöglicht. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Schritte zum Sezieren von Blütenorganen schwer zu erlernen sind, da sie Vorkenntnisse in der Anatomie der Blüten und Sezierfähigkeiten erfordern.Verwenden Sie zunächst eine kleine Schere, um Blüten von synchronisierten Pflanzen zu entfernen. Und geben Sie sie sofort in einzelne Mikrozentrifugenröhrchen, die ein entsprechendes Fixiermittel enthalten. Entfernen Sie anschließend das Fixiermittel und fügen Sie so viel 70%iges Ethanol hinzu, dass die Proben vollständig bedeckt sind.Bringen Sie die Proben für mindestens 24 Stunden auf vier Grad Celsius zurück. Füllen Sie dann ein Uhrmacherglas mit frisch hergestelltem 70%igem Ethanol und stellen Sie es zur Unterstützung in eine kleine Petrischale. Legen Sie dann den Blütenstand in das Uhrmacherglas und stellen Sie sicher, dass er vollständig mit dem Ethanol bedeckt ist.Präparieren Sie die Blüte mit einer Pinzette und einer Spritze, die mit einer Nadel ausgestattet ist, unter dem Stereomikroskop, indem Sie die Kelchblätter, Blütenblätter und Staubgefäße auseinanderreißen. Legen Sie dann das Uhrmacherglas zur Seite und verwenden Sie einen Glasobjektträger für das abschließende Sezieren. Bewegen Sie die Probe auf einen Objektträger und fügen Sie 10 Mikroliter frisch hergestelltes 70%iges Ethanol hinzu.Machen Sie Schnitte auf jeder Seite der Handwurzel und drehen Sie sie nach Bedarf. Entfernen Sie dann vorsichtig die Ventile, um die Samenanlagen freizulegen. Machen Sie einen scharfen kleinen Schnitt, um die Hälfte des übertragenden Gewebes aus dem Behälter zu lösen, und reißen Sie die beiden Hälften mit einer Pinzette und einer Nadel auseinander.Entfernen Sie den Narbenstil und den Stiel mit scharfen Schnitten. Drehen Sie die noch anhaftenden Eizellen mit der Pinzette und der Nadel vorsichtig um und ordnen Sie sie so an, dass zwei parallele Reihen entstehen. Verwenden Sie ein kleines Stück Löschpapier, um Ethanol aus der Probe auf dem Objektträger zu entfernen.Geben Sie dann 20 Mikroliter Reinigungslösung auf den Objektträger. Positionieren Sie die Proben mit einer Spritze mit Injektionsnadeln und entfernen Sie alle verbleibenden Luftblasen. Legen Sie anschließend vorsichtig einen Deckglas auf den Objektträger und warten Sie, bis die Reinigungslösung den Raum zwischen dem Deckglas und der Probe ausfüllt.Legen Sie die Rutsche in einen Diahalter und lassen Sie sie unter dem Abzug. Lasst uns also frisch geerntete Blütenknospen, die sich kurz davor stehen, mit nicht dehiszenten Staubbeuteln zu öffnen. Bereiten Sie dann eine 96-Well-Platte mit genügend Alexander-Lösung vor, um die Blütenknospen vollständig einzutauchen.Entferne die Kelchblätter und Blütenblätter, um die Staubbeutel freizulegen, und tauche sie in die Alexander-Lösung. Lassen Sie die Platte ein bis drei Stunden unter dem Abzug stehen. Ersetzen Sie dann die Alexander-Lösung durch die viereinhalb-Lösung von Herrn und brüten Sie die Platte über Nacht unter dem Abzug.Am nächsten Tag beförderst Du die gereinigten Knospen vorsichtig mit einer Pinzette zu einer neuen Rutsche. Präparieren Sie anschließend die Staubgefäße und entfernen Sie alle anderen Gewebe aus den Proben. Fahren Sie dann mit der Klärung auf Chloralhydratbasis und der kombinierten Klärung mit der viereinhalbjährigen Herr-Lösung fort.Schieben Sie zuerst die Blume aus dem Uhrmacherglas auf den Objektträger und entfernen Sie mit einem Löschpapier überschüssiges Ethanol. Fügen Sie fünf bis 10 Mikroliter DAPI-Lösung hinzu. Präparieren Sie mit zwei Spritzen mit Injektionsnadeln die Staubgefäße und entfernen Sie alle anderen Blütenorgane.Geben Sie dann die Pollenkörner in die DAPI-Lösung ab. Entfernen Sie alle Rückstände von den Staubgefäßen des Objektträgers und stellen Sie sicher, dass nur die Pollenkörner auf dem Objektträger verbleiben. Das Entfernen aller Staubgefäßrückstände vom Objektträger ist der wichtigste Schritt bei der Exinentfernung.Zwischen Rutsche und Deckglas sollten nur Pollenkörner verbleiben. Legen Sie anschließend einen Deckglas auf den Probenlagerschlitten und fügen Sie die Mindestmenge an DAPI-Lösung hinzu, die erforderlich ist, um den Raum zwischen dem Objektträger und dem Deckglas zu füllen. Legen Sie einen Zeigefinger vorsichtig auf den Deckglas und machen Sie eine schnelle kurze Gleitbewegung.Legen Sie die Rutsche für mindestens 15 Minuten im Dunkeln bei vier Grad Celsius in eine menschliche Box. Beobachten Sie dann den Objektträger innerhalb von 24 Stunden unter Weitfeld-Fluoreszenz- oder konfokaler Mikroskopie. Bringen Sie die präparierte Probe aus dem Glas des Uhrmachers in eine Glasplatte mit Hohlräumen, die mit 1 % SDS und einer 0,2-Natronlauge gefüllt sind.Über Nacht bei Raumtemperatur inkubieren. Die SDS-Natronlauge reinigt die Proben schnell und lässt sie innerhalb weniger Minuten transparent erscheinen. Spülen Sie die Probe vorsichtig mit Wasser ab und legen Sie sie auf einen sauberen Objektträger.Geben Sie dann 20 bis 40 Mikroliter Färbelösung auf den Objektträger. Abhängig von dem zu analysierenden Blütenorgan und den Fähigkeiten des Forschers kann diese DS-Behandlung vor, für erfahrene Forscher oder nach dem Präparierschritt für weniger erfahrene Forscher durchgeführt werden. Legen Sie anschließend einen Deckglas auf die Folie und achten Sie darauf, dass die Zubereitung nicht zerdrückt wird.Legen Sie dann alle vorbereiteten Objektträger in eine mit Alufolie bedeckte menschliche Box und inkubieren Sie eine Stunde lang bei vier Grad Celsius. Betrachten Sie die Probe schließlich unter Weitfeld-Fluoreszenz- oder Konfokalmikroskopie. Nach dem im Protokoll beschriebenen Präparierverfahren werden unnötige Gewebe, die die Beobachtungen behindern könnten, entfernt und detailliertere Bilder erstellt.Je nach Zielsetzung kann die Chloralhydrat-Färbung verwendet werden, um die frühe Blütenentwicklung auf der Ebene der gesamten Blütenknospen, die Meiose und die Mikro-Gomedaillen-Genese im Staubbeutel, die frühe Eizellenentwicklung und die Spezifizierung der Megasporen-Mutterzelle, die weibliche Go-Med-ifizierte Entwicklung oder sogar die Pollenschlauchinvasion des Mittelgitters zu charakterisieren. Die kombinierte Alexander-Färbung und die viereinhalbjährige Reinigung von Herrn ermöglichen die Beurteilung des Pollenabbruchs innerhalb eines gegebenen Lappens oder eines Antheren als Ganzes. Während lebensfähige Pollenkörner ein rotes Zytoplasma aufweisen, zeigen abgetriebene ein leeres Zytoplasma und sind schließlich unregelmäßig geformt und vollständig zerkleinert.Die Entfernung des Exins führt zu einer erhöhten Färbeintensität der Zellkerne und einer höheren Detailgenauigkeit der Chromatinorganisation. Die Verwendung und SDS-Natronlaugereinigung vor dem Färben machte den Blütenstand transparent. Und führte zu einer höheren Färbung von Callose im Blütengewebe.Es zeigten sich normalerweise schwer zu erkennende Callose-Ansammlungen. Wie zum Beispiel die Callose-Schicht, die die generative Zelle von der vegetativen Zelle trennt. Auch wenn noch Pollenkörner im Staubbeutel enthalten waren.Einmal gemeistert, können diese Techniken in weniger als 48 Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt werden. Wenn Sie dieses Verfahren ausprobieren, ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Ergebnisse weitgehend von einer guten Probenvorbereitung abhängen, z. B. von der Verwendung des richtigen Fixiermittels, der ordnungsgemäßen Durchführung der Dissektion und der Isolierung des interessierenden Gewebes auf dem Objektträger.

whole-mount-clearing-staining-arabidopsis-flower-organs

Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Die Zusammensetzung der pflanzlichen Zellwand variiert je nach Gewebetyp und kann Lignin, Zellulose, Hemicellulosen und Pektin umfassen. Es wurden verschiedene Färbetechniken entwickelt, um Unterschiede auf Zelltypebene sichtbar zu machen. Dieser Artikel ist eine Zusammenstellung häufig verwendeter Techniken zur Zellwandfärbung.

Histochemische Färbung von<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Sekundärzellwand-Elemente

Wir bieten hier eine effiziente und zuverlässige Protokoll für die Immunfärbung, Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung, DNA-Färbung, gefolgt von quantitativen und hochauflösende Bildgebung in der whole-mount Arabidopsis thaliana Samenanlagen. Diese Methode wurde erfolgreich eingesetzt, um Chromatin-Modifikationen und Zellkernarchitektur zu analysieren.

Eine effiziente Methode zur quantitativen, Einzel-Zell-Analyse von Chromatin Modifikation und Reaktor Architektur in Whole-Mount-Samenanlagen in<em&gt; Arabidopsis</em

Kristalline Cellulose ist ein wichtiger Bestandteil der pflanzlichen Zellwand. Die Quantifizierung mit zellulärer Auflösung ist jedoch eine technische Herausforderung.  Hier berichten wir über den Einsatz von Polarisationslichttechnologie und Wurzelquerschnitten, um Informationen über die Zusammensetzung der Zellwände mit raumzeitlicher Auflösung zu erhalten.

Hohe Auflösung Quantifizierung kristalliner Cellulose Akkumulation in<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Roots Gewebespezifische Zellwand Änderungen überwachen

Live-konfokale Abbildung stellt Biologen ein leistungsfähiges Werkzeug zum Studium der Entwicklung. Hier präsentieren wir ein detailliertes Protokoll für die Live - konfokale Abbildung von Arabidopsis Blumen zu entwickeln.

Live-konfokale Bildgebung Entwicklung Arabidopsis Blumen

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Beobachtung der Embryogenese in Arabidopsis über Ovulum Abstand gefolgt von der Inspektion der Embryo Musterbildung unter dem Mikroskop.

Eine Methode zur Charakterisierung der Embryogenese in Arabidopsis

Wir berichten über eine einfache und vielseitige Methode zur Durchführung von fluoreszierenden live-Imaging von Arabidopsis Thaliana Blätter über einen längeren Zeitraum hinweg. Wir verwenden eine transgene Arabidopsis -Pflanze mit dem Ausdruck einer fluoreszierenden Reporter-gen unter der Kontrolle von einer Immunität im Zusammenhang mit Promoter als Vorbild für die räumlich-zeitliche Verständnis der Pflanze Immunantworten.

Eine vielseitige Methode für die Montage von Arabidopsis verlässt für intravitalen Zeitraffer Aufnahmen

Hier beschreiben wir die Erzeugung und Anwendung einer Reihe von transgenen Arabidopsis Thaliana Linien förderliches induzierbaren, gewebespezifische Ausdruck in den drei wichtigsten Meristeme, schießen Sprossapikalmeristem Meristem, die Wurzel Sprossapikalmeristem Meristem und das Kambium.

Induzierbaren, Zelle Typ-spezifischen Ausdruck in Arabidopsis Thaliana durch LhGR-vermittelten Trans-Aktivierung

Hier wird ein Verfahren beschrieben, um pflanzliches Gewebe transparent zu machen und gleichzeitig die Stabilität fluoreszierender Proteine zu erhalten. Diese Technik ermöglicht eine tiefe Bildgebung von gereinigtem Pflanzengewebe ohne physikalische Schnitte.

Optische Reinigung von Pflanzengeweben für die Fluoreszenzbildgebung

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine optimierte Methode zur histologischen Beobachtung von Gallen, die durch Plasmodiophora brassicae induziert werden. Vibratomschnitte von Hypokotylen werden vor der Fluoreszenzbildgebung entfernt, um die Beteiligung von Transkriptionsfaktoren und Phytohormonen während des Krankheitsverlaufs zu untersuchen. Dieses Protokoll überwindet Einschränkungen bei der Einbettung von Harz und ermöglicht die Visualisierung fluoreszierender Proteine in planta .

Kombination von Clearing- und Fluoreszenzmikroskopie zur Visualisierung von Veränderungen der Genexpression und physiologischen Reaktionen auf Plasmodiophora brassicae

Hier beschreiben wir eine Verbesserung der Semi-in-vitro (SIV) Methode zur Beobachtung der Pollenschlauchführung und -aufnahme bei Arabidopsis thaliana, die die Empfänglichkeit der Eizellen erhöht. Die Hochdurchsatz-SIV-cum-Septum-Methode kann mit Gametophyten-Markerlinien und genetisch kodierten Biosensoren gekoppelt werden, um den dynamischen Prozess der Befruchtung zu überwachen.

Live-Bildgebung der Arabidopsis-Pollensondenaufnahme und Doppelbefruchtung mit der Semi-In-vitro-Cum-Septum-Methode

Eine verbesserte Methode zur Messung von Pollenhydratationsprofilen in Arabidopsis thaliana wird hier beschrieben. Die neue Methode bietet eine höhere Auflösung, ist nicht-invasiv und sehr gut reproduzierbar. Das Protokoll stellt ein neues Werkzeug dar, um die Prozesse, die die frühen Stadien der Bestäubung regulieren, genauer zu analysieren.

Ein hochauflösender Einzelkorn-In-vivo-Pollenhydratations-Bioassay für Arabidopsis thaliana

Lernen Sie die Präparation von Arabidopsis-Blüten und -Schoten durch Clearing und Färbung für die Entwicklungsbiologie. Diese Methode ermöglicht die schnelle Analyse verschiedener Entwicklungsstadien.

Vollständig-hängen Clearing und Färbung des Arabidopsis Blume Organe und Siliques

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