Vollständig-hängen Clearing und Färbung des Arabidopsis Blume Organe und Siliques

In diesem Protokoll wir beschreiben Techniken für die richtige Zerlegung von Arabidopsis Blumen und Siliques, einige grundlegende Clearing-Techniken und Färbung Verfahren für ganz-Mount Beobachtungen der reproduktiven Strukturen ausgewählt.

Dieses Protokoll beschreibt, wie Blütenknospen, Blüten und junge Siliken richtig zerlegt werden. Und die anschließende Ganzmontage-Räumung für diverse Färbe- und Betrachtungstechniken. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der sexuellen Pflanzenproduktion zu beantworten.

Wie z.B. eine stetige Mutantenanalyse oder ein umwelt- und experimentell induziertes Versagen in der Blütenentwicklung und -funktion. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie ein einfaches und schnelles Screening vieler Entwicklungsstadien gleichzeitig ermöglicht. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Schritte zum Sezieren von Blütenorganen schwer zu erlernen sind, da sie Vorkenntnisse in der Anatomie der Blüten und Sezierfähigkeiten erfordern.

Verwenden Sie zunächst eine kleine Schere, um Blüten von synchronisierten Pflanzen zu entfernen. Und geben Sie sie sofort in einzelne Mikrozentrifugenröhrchen, die ein entsprechendes Fixiermittel enthalten. Entfernen Sie anschließend das Fixiermittel und fügen Sie so viel 70%iges Ethanol hinzu, dass die Proben vollständig bedeckt sind.

Bringen Sie die Proben für mindestens 24 Stunden auf vier Grad Celsius zurück. Füllen Sie dann ein Uhrmacherglas mit frisch hergestelltem 70%igem Ethanol und stellen Sie es zur Unterstützung in eine kleine Petrischale. Legen Sie dann den Blütenstand in das Uhrmacherglas und stellen Sie sicher, dass er vollständig mit dem Ethanol bedeckt ist.

Präparieren Sie die Blüte mit einer Pinzette und einer Spritze, die mit einer Nadel ausgestattet ist, unter dem Stereomikroskop, indem Sie die Kelchblätter, Blütenblätter und Staubgefäße auseinanderreißen. Legen Sie dann das Uhrmacherglas zur Seite und verwenden Sie einen Glasobjektträger für das abschließende Sezieren. Bewegen Sie die Probe auf einen Objektträger und fügen Sie 10 Mikroliter frisch hergestelltes 70%iges Ethanol hinzu.

Machen Sie Schnitte auf jeder Seite der Handwurzel und drehen Sie sie nach Bedarf. Entfernen Sie dann vorsichtig die Ventile, um die Samenanlagen freizulegen. Machen Sie einen scharfen kleinen Schnitt, um die Hälfte des übertragenden Gewebes aus dem Behälter zu lösen, und reißen Sie die beiden Hälften mit einer Pinzette und einer Nadel auseinander.

Entfernen Sie den Narbenstil und den Stiel mit scharfen Schnitten. Drehen Sie die noch anhaftenden Eizellen mit der Pinzette und der Nadel vorsichtig um und ordnen Sie sie so an, dass zwei parallele Reihen entstehen. Verwenden Sie ein kleines Stück Löschpapier, um Ethanol aus der Probe auf dem Objektträger zu entfernen.

Geben Sie dann 20 Mikroliter Reinigungslösung auf den Objektträger. Positionieren Sie die Proben mit einer Spritze mit Injektionsnadeln und entfernen Sie alle verbleibenden Luftblasen. Legen Sie anschließend vorsichtig einen Deckglas auf den Objektträger und warten Sie, bis die Reinigungslösung den Raum zwischen dem Deckglas und der Probe ausfüllt.

Legen Sie die Rutsche in einen Diahalter und lassen Sie sie unter dem Abzug. Lasst uns also frisch geerntete Blütenknospen, die sich kurz davor stehen, mit nicht dehiszenten Staubbeuteln zu öffnen. Bereiten Sie dann eine 96-Well-Platte mit genügend Alexander-Lösung vor, um die Blütenknospen vollständig einzutauchen.

Entferne die Kelchblätter und Blütenblätter, um die Staubbeutel freizulegen, und tauche sie in die Alexander-Lösung. Lassen Sie die Platte ein bis drei Stunden unter dem Abzug stehen. Ersetzen Sie dann die Alexander-Lösung durch die viereinhalb-Lösung von Herrn und brüten Sie die Platte über Nacht unter dem Abzug.

Am nächsten Tag beförderst Du die gereinigten Knospen vorsichtig mit einer Pinzette zu einer neuen Rutsche. Präparieren Sie anschließend die Staubgefäße und entfernen Sie alle anderen Gewebe aus den Proben. Fahren Sie dann mit der Klärung auf Chloralhydratbasis und der kombinierten Klärung mit der viereinhalbjährigen Herr-Lösung fort.

Schieben Sie zuerst die Blume aus dem Uhrmacherglas auf den Objektträger und entfernen Sie mit einem Löschpapier überschüssiges Ethanol. Fügen Sie fünf bis 10 Mikroliter DAPI-Lösung hinzu. Präparieren Sie mit zwei Spritzen mit Injektionsnadeln die Staubgefäße und entfernen Sie alle anderen Blütenorgane.

Geben Sie dann die Pollenkörner in die DAPI-Lösung ab. Entfernen Sie alle Rückstände von den Staubgefäßen des Objektträgers und stellen Sie sicher, dass nur die Pollenkörner auf dem Objektträger verbleiben. Das Entfernen aller Staubgefäßrückstände vom Objektträger ist der wichtigste Schritt bei der Exinentfernung.

Zwischen Rutsche und Deckglas sollten nur Pollenkörner verbleiben. Legen Sie anschließend einen Deckglas auf den Probenlagerschlitten und fügen Sie die Mindestmenge an DAPI-Lösung hinzu, die erforderlich ist, um den Raum zwischen dem Objektträger und dem Deckglas zu füllen. Legen Sie einen Zeigefinger vorsichtig auf den Deckglas und machen Sie eine schnelle kurze Gleitbewegung.

Legen Sie die Rutsche für mindestens 15 Minuten im Dunkeln bei vier Grad Celsius in eine menschliche Box. Beobachten Sie dann den Objektträger innerhalb von 24 Stunden unter Weitfeld-Fluoreszenz- oder konfokaler Mikroskopie. Bringen Sie die präparierte Probe aus dem Glas des Uhrmachers in eine Glasplatte mit Hohlräumen, die mit 1 % SDS und einer 0,2-Natronlauge gefüllt sind.

Über Nacht bei Raumtemperatur inkubieren. Die SDS-Natronlauge reinigt die Proben schnell und lässt sie innerhalb weniger Minuten transparent erscheinen. Spülen Sie die Probe vorsichtig mit Wasser ab und legen Sie sie auf einen sauberen Objektträger.

Geben Sie dann 20 bis 40 Mikroliter Färbelösung auf den Objektträger. Abhängig von dem zu analysierenden Blütenorgan und den Fähigkeiten des Forschers kann diese DS-Behandlung vor, für erfahrene Forscher oder nach dem Präparierschritt für weniger erfahrene Forscher durchgeführt werden. Legen Sie anschließend einen Deckglas auf die Folie und achten Sie darauf, dass die Zubereitung nicht zerdrückt wird.

Legen Sie dann alle vorbereiteten Objektträger in eine mit Alufolie bedeckte menschliche Box und inkubieren Sie eine Stunde lang bei vier Grad Celsius. Betrachten Sie die Probe schließlich unter Weitfeld-Fluoreszenz- oder Konfokalmikroskopie. Nach dem im Protokoll beschriebenen Präparierverfahren werden unnötige Gewebe, die die Beobachtungen behindern könnten, entfernt und detailliertere Bilder erstellt.

Je nach Zielsetzung kann die Chloralhydrat-Färbung verwendet werden, um die frühe Blütenentwicklung auf der Ebene der gesamten Blütenknospen, die Meiose und die Mikro-Gomedaillen-Genese im Staubbeutel, die frühe Eizellenentwicklung und die Spezifizierung der Megasporen-Mutterzelle, die weibliche Go-Med-ifizierte Entwicklung oder sogar die Pollenschlauchinvasion des Mittelgitters zu charakterisieren. Die kombinierte Alexander-Färbung und die viereinhalbjährige Reinigung von Herrn ermöglichen die Beurteilung des Pollenabbruchs innerhalb eines gegebenen Lappens oder eines Antheren als Ganzes. Während lebensfähige Pollenkörner ein rotes Zytoplasma aufweisen, zeigen abgetriebene ein leeres Zytoplasma und sind schließlich unregelmäßig geformt und vollständig zerkleinert.

Die Entfernung des Exins führt zu einer erhöhten Färbeintensität der Zellkerne und einer höheren Detailgenauigkeit der Chromatinorganisation. Die Verwendung und SDS-Natronlaugereinigung vor dem Färben machte den Blütenstand transparent. Und führte zu einer höheren Färbung von Callose im Blütengewebe.

Es zeigten sich normalerweise schwer zu erkennende Callose-Ansammlungen. Wie zum Beispiel die Callose-Schicht, die die generative Zelle von der vegetativen Zelle trennt. Auch wenn noch Pollenkörner im Staubbeutel enthalten waren.

Einmal gemeistert, können diese Techniken in weniger als 48 Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt werden. Wenn Sie dieses Verfahren ausprobieren, ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Ergebnisse weitgehend von einer guten Probenvorbereitung abhängen, z. B. von der Verwendung des richtigen Fixiermittels, der ordnungsgemäßen Durchführung der Dissektion und der Isolierung des interessierenden Gewebes auf dem Objektträger.