Alternative In-vitro- Methoden zur Bestimmung der viralen Kapsid strukturelle Integrität

Das übergeordnete Ziel dieser Methoden ist es, weitere Einblicke in die Auswirkungen einer Behandlung auf die Infektiosität oder Integrität des humanen Norovirus-Kapsids zu gewinnen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der unbehüllten viralen Inaktivierung zu beantworten. Zum Beispiel, was mit der Fähigkeit des viralen Kapsids passiert, eine Zelle nach einer bestimmten Behandlung zu infizieren.

Der Hauptvorteil dieser Methoden besteht darin, dass sie zusätzliche mechanistische Einblicke in die Wirkung einer bestimmten Behandlung auf das Virus geben können. Obwohl diese Methode einen Einblick in die Inaktivierungsstrategien des humanen Norovirus geben kann, hat sie auch das Potenzial, auf andere unbehüllte Viren wie Rhinoviren oder Hepatitis angewendet zu werden, A.To beginnen, verdünntes gereinigtes humanes Norovirus-Hauptkapsidprotein, das in Kapsiden auf 50 Mikrogramm pro Milliliter in 1X phosphatgepufferter Kochsalzlösung assembliert ist. Verwenden Sie ein maximales Volumen von 15 Mikrolitern in den einzelnen verschlossenen PCR-Röhrchen.

Stellen Sie sicher, dass das Röhrchen mindestens 600 Nanogramm Kapsid enthält und dass 600 Nanogramm Kapsid pro Ligandenkombination der Behandlung vorhanden sind. Als nächstes heizen Sie den Thermocycler auf die gewünschte Wärmebehandlung vor. Heizen Sie dann einen zusätzlichen Thermocycler auf vier Grad Celsius vor, um ihn sofort abzukühlen.

Geben Sie die Röhrchen mit der Kapsidlösung für die gewünschte Zeit in den Thermocycler. Nach dem Erhitzen geben Sie die Röhrchen sofort für fünf Minuten in den vorgekühlten vier Grad Celsius heißen Cycler. Schleudern Sie die Röhrchen in der Zentrifuge kurz nach unten, um alle Tröpfchen an den Boden des Röhrchens zu bekommen.

Verdünnen Sie die behandelten Kapsidlösungen und PBS auf drei Mikrogramm pro Milliliter. Stellen Sie sicher, dass mindestens 200 Mikroliter verdünntes behandeltes Kapsid vorhanden sind. Tragen Sie anschließend 100 Mikroliter Kapsidlösung auf jede Vertiefung auf und stellen Sie sicher, dass mindestens zwei Vertiefungen pro Behandlung vorhanden sind.

Fügen Sie zusätzlich zwei Kontrollvertiefungen mit 100 Mikrolitern PBS für jeden Liganden hinzu. Dies liefert die Hintergrundabsorption des Assays. Decken Sie die Platte mit einem Deckel ab und versiegeln Sie die Ränder mit Paraffinfolie, um die Verdunstung zu reduzieren.

Lassen Sie die Platte über Nacht bei vier Grad Celsius oder zwei Stunden bei Raumtemperatur auf einem Schüttelbrutschrank stehen. Nach der Inkubation die behandelten Kapsidlösungen von der Platte nehmen. Fügen Sie dann 200 Mikroliter Blockierungspuffer pro Vertiefung hinzu.

Zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubieren oder über Nacht verschlossen bei vier Grad Celsius aufbewahren. In der Zwischenzeit verdünnen Sie das biotinylierte Aptamer in nukleasefreiem Wasser zu einem Mikromolaren. Stellen Sie sicher, dass für jede Behandlung genügend Lösung für insgesamt 200 Mikroliter vorhanden ist.

Verdünnen Sie außerdem das gewählte biotinylierte HPGA auf 30 Mikroliter pro Milliliter im Blockierungspuffer. Stellen Sie auch hier sicher, dass für jede Behandlung genügend Lösung für 200 Mikroliter Gesamtvolumen vorhanden ist. Entfernen Sie nach der Inkubation den Blockierungspuffer und waschen Sie die Platte dreimal mit 200 Mikrolitern PBST pro Vertiefung.

Tupfen Sie die Platte kopfüber auf sterile Papiertücher, um die Restfeuchtigkeit zu trocknen. Als nächstes wird bei 100 Mikrolitern pro Vertiefung der Ligandenbindungslösungen, wobei sichergestellt wird, dass zwei Vertiefungen pro Ligandenkombination der Wärmebehandlung vorhanden sind, die abgedeckte Platte auf einem Orbitalschüttler bei etwa 60 U/min für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem Waschen der Vertiefungen, wie im Textprotokoll beschrieben, fügen Sie 100 Mikroliter pro Vertiefung mit 0,2 Mikrogramm pro Milliliter Streptavidin, Meerrettichperoxidase und PBS hinzu.

Inkubieren Sie 15 Minuten lang bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln auf einem Orbitalschüttler, bevor Sie die Vertiefungen erneut waschen. Fügen Sie dann nach einer weiteren Wäsche 100 Mikroliter TMB-Substrat pro Vertiefung hinzu und lassen Sie die Farbe fünf bis 15 Minuten lang entstehen. Beobachte die Vertiefungen auf Farbe.

Achten Sie darauf, dass Sie zwischen den Replikationsplatten konsistent die gleiche Zeit entwickeln, und beachten Sie den Absorptionsbereich des verwendeten Plattenlesers. Stoppen Sie die Entwicklung der Reaktion mit 100 Mikrolitern pro Vertiefung einer molaren Phosphorsäure. Lesen Sie die Platte sofort bei 450 Nanometern ab.

Erstellen Sie in der DLS-Gerätesoftware eine neue Standardarbeitsanweisung, wie im Textprotokoll beschrieben. Wählen Sie dann den grünen Laufpfeil in der Software aus und benennen Sie das Beispiel. Verdünnen Sie die wärmebehandelten virusähnlichen Partikel oder VLPs von eins bis 10 in 1X PBS für eine Endkonzentration von fünf Mikrogramm pro Milliliter.

Filtrieren Sie dann die Probe mit einer Porengröße von einem Mikrometer, um Staubpartikel zu entfernen. DLS ist sehr empfindlich gegenüber Staub, da große Partikel viel mehr Licht streuen als kleine Partikel. Übertragen Sie 50 Mikroliter der verdünnten VLPs in eine Einwegküvette mit kleinem Volumen.

Setzen Sie die Küvette in die Probenkammer des Geräts ein. Starten Sie den Lauf und verwenden Sie die Registerkarten correlogram cumulant fit und expert advice, um die Datenqualität zu bewerten. Überprüfen Sie während des Laufs, ob die Poly-Dispersion des Indexwerts kleiner als 0,3 ist, was eine Qualitätsmessung darstellt.

Stellen Sie auf der Registerkarte Multiview sicher, dass der Korrelationskoeffizient konstant und nahe bei, aber nicht mehr als eins auf einmal ist, und zu einem späteren Zeitpunkt stark bei Null abfällt, je nach Partikelgröße. Verwenden Sie die Registerkarte "Expertenratschläge", um Feedback zur Datenqualität während der Messungen zu erhalten. Überprüfen Sie nach Abschluss der Messung erneut, ob die Poly-Dispersion des Indexwerts kleiner als 0,3 ist.

Stellen Sie sicher, dass die Linie für die kumulative Anpassung genau den Datenpunkten auf der Registerkarte für die Anpassung der Kumulanten folgt. Erstellen Sie in der DLS-Gerätesoftware eine neue Betriebsanweisung für Größenstandards, wie im Textprotokoll beschrieben. Wählen Sie den Laufpfeil in der Software, um eine neue Probe zu öffnen und zu benennen und das Gerät das Temperaturgleichgewicht erreichen zu lassen.

Übertragen Sie die VLP-Suspension in eine Quarzküvette mit kleinem Volumen, vermeiden Sie Blasen und pipettieren Sie langsam gegen die Wand der Küvette. Nachdem das Gerät das Temperaturgleichgewicht erreicht hat, setzen Sie die Küvette in die Probenkammer ein. Nachdem Sie 10 Sekunden gewartet haben, bis sich die Probentemperatur ausgeglichen hat, starten Sie den Lauf und starten Sie gleichzeitig einen Timer.

Stoppen Sie den Timer am Ende der ersten Messung. Nehmen Sie diese Zeit als ersten Zeitpunkt. Gewinnen Sie aus den von der Software aufgezeichneten Messzeiten nachträgliche Zeitpunkte.

Die Wärmebehandlung ist wie zuvor durchzuführen, mit der Ausnahme, dass 10 Millimolare Haufen mit PBS bei einem pH-Wert von 7,4 ersetzt werden und die Kapside nach der Behandlung nicht weiter verdünnt werden. Pipettieren Sie anschließend den gesamten 15-Mikroliter-Tropfen der behandelten Kapsidlösung auf den Paraffinfilm. Fassen Sie die Gitterkante mit einer Pinzette, so dass sie sich an der Kante schließen können, um das Gitter zu halten, und legen Sie die Gitterkohlenstoffseite nach unten auf den Tropfen der behandelten Lösung.

Lassen Sie das Gitter 10 Minuten lang inkubieren, damit sich das Kapsid an das Gitter anheften kann. Abhängig von der Reinheit der Kapsidzubereitung werden Waschungen der Haufenlösung in Form von 10 bis 15 Mikrolitern Tröpfchen hinzugefügt, die in einer Reihe nach dem behandelten Kapsidtröpfchen platziert werden. Nach 10 Minuten nimmst du das Gitter mit dem Tröpfchen auf.

Lege das Gitter fast senkrecht zu einem Stück Filterpapier, um das Tröpfchen abzuleiten. Nehmen Sie dann mit dem Gitter das Tröpfchen mit 10 bis 15 Mikrolitern Heapspuffer auf und halten Sie es 30 Sekunden lang. Nach 30 Sekunden Waschzeit mit einem weiteren Stück Filterpapier ableiten.

Geben Sie anschließend einen 15-Mikroliter-Tropfen mit zwei Prozent Uranylacetatlösung auf den Paraffinfilm in einer leeren Fläche. Nehmen Sie das Tröpfchen Uranylacetat mit dem Gitter auf und halten Sie es 45 Sekunden lang. Saugen Sie dann das Uranylacetat ab und achten Sie darauf, den größten Teil der Lösung zu entfernen.

Legen Sie das Gitter mit der Kohleseite nach oben auf ein Stück Filterpapier und achten Sie darauf, dass das Gitter nicht an der Feuchtigkeit auf der Pinzette kleben bleibt. Legen Sie dann das Filterpapier mit dem Gitter darauf in eine offene Petrischale aus Glas. Nachdem Sie diesen Vorgang für alle Behandlungen wiederholt haben, legen Sie die Petrischalenhälften mit den Gittern über Nacht in einen Exsikkator, um sie zu trocknen, bevor Sie mit TEM beobachten.

Die folgende Grafik zeigt die Verringerung der Bindungsfähigkeit von humanen Norovirus-Kapsiden im Laufe der Zeit, wenn sie bei 68 Grad Celsius behandelt wurden. Wie zu sehen ist, ist die HPGA-Bindung das erste Signal, das vollständig verschwindet. Zu diesem Zeitpunkt wird davon ausgegangen, dass die große Mehrheit der Kapside in der Lösung die Fähigkeit verloren hat, Wirtszell-HPGAs zu binden und daher nicht in die Zelle internalisiert werden kann.

Die Aptamerbindung spiegelt die von HBGA wider, obwohl etwas mehr Wärmebehandlung erforderlich ist, um das Signal zu entfernen. Hier ist eine DLS-Korrelationskoeffizientenkurve dargestellt, die für Daten von guter Qualität repräsentativ ist. Zu einem Zeitpunkt nahe Null ist das Korrelogramm konstant bei einem Wert nahe eins, aber unter eins.

Dann fällt er zu einem für die Partikelgröße charakteristischen Zeitpunkt stark auf Null ab. Den Größenergebnissen dieses Experiments kann wahrscheinlich vertraut werden. Umgekehrt ist diese Korrelationskoeffizientenkurve repräsentativ für Daten von schlechter Qualität.

Das Correlogramm beginnt bei einem Wert über eins und fällt allmählich auf Null ab. Die Ergebnisse dieses Experiments sollten nicht verwendet werden. Hier zeigen die Partikelgrößendaten ein klares Aggregationsprofil für Kapside, die bei 68 Grad Celsius behandelt wurden, wobei sich nach etwa 20 Minuten Superaggregate bilden.

Der Zeitpunkt, zu dem die Superaggregation auftritt, ist charakteristisch für die Empfänglichkeit der VLPs für diese Behandlung. Diese Abbildung visualisiert die TEM-Ergebnisse für die Wärmebehandlung von humanen Norovirus-Kapsiden. Hier wurden die Kapside bei 60 bis 80 Grad Celsius von links nach rechts behandelt.

Wie zu sehen ist, verändert sich die Kapsidmorphologie mit der Behandlung deutlich, da die Kapside aggregieren und denaturieren. Ein ähnliches Phänomen wird bei Kapsiden beobachtet, die bei 68 Grad Celsius für null bis 25 Minuten behandelt wurden. Einmal gemeistert, können diese Techniken in einer bis 24 Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt werden.

Nach ihrer Entwicklung bot diese Technik Forschern auf dem Gebiet der Lebensmittelvirologie eine zusätzliche Möglichkeit, die Mechanismen und Auswirkungen der Inaktivierung auf das Kapsid menschlicher Noroviren zu erforschen. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie eine Echtzeit-RT-PCR mit und ohne RNase-Vorbehandlung, STS-Seite von viralen Kapsiden und Plaque-Assays mit kultivierbaren Surrogatviren durchgeführt werden, um einen vollständigeren Gesamtüberblick über die Virusreduktion nach einer bestimmten Behandlung zu erhalten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Ligandenbindung, dynamische Lichtstreuung und Transmissionselektronenmikroskopie nutzen können, um weitere mechanistische Einblicke in die Auswirkungen der Inaktivierungsbehandlung auf das humane Norovirus-Kapsid zu erhalten.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit einigen der verwendeten Reagenzien gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen persönlicher Schutzausrüstung und die Befolgung der Best Practices für die Laborsicherheit getroffen werden sollten.