Alternative In-vitro- Methoden zur Bestimmung der viralen Kapsid strukturelle Integrität

Das übergeordnete Ziel dieser Methoden besteht darin, tiefergehende Einblicke in die Auswirkungen einer Behandlung auf die Infektiosität oder Integrität der menschlichen Norovirus-Kapsidhülle zu gewinnen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Inaktivierung nicht umhüllter Viren zu beantworten, beispielsweise, was mit der Fähigkeit des viralen Kapsids geschieht, nach einer bestimmten Behandlung eine Zelle zu infizieren.

Der Hauptvorteil dieser Methoden besteht darin, dass sie zusätzliche mechanistische Erkenntnisse über die Wirkung einer bestimmten Behandlung auf das Virus liefern können. Obwohl diese Methode Einblicke in Strategien zur Inaktivierung des humanen Norovirus ermöglicht, besteht auch das Potenzial, sie auf andere nicht behüllte Viren wie Rhinovirus oder Hepatitis A anzuwenden.

Verdünnen Sie zunächst das gereinigte humane Norovirus-Hauptkapsidprotein, das in Kapside assembliert ist, auf 50 Mikrogramm pro Milliliter in 1X phosphatgepufferter Kochsalzlösung. Verwenden Sie ein maximales Volumen von 15 Mikrolitern in den einzelnen verschlossenen PCR-Röhrchen.

Stellen Sie sicher, dass das Röhrchen mindestens 600 Nanogramm Kapsid enthält und dass 600 Nanogramm Kapsid pro Behandlungs-Liganden-Kombination vorhanden sind. Danach erwärmen Sie den Thermocycler auf die gewünschte Temperaturbehandlung. Anschließend erwärmen Sie einen weiteren Thermocycler auf vier Grad Celsius, um eine sofortige Abkühlung durchführen zu können.

Fügen Sie die Röhrchen mit der Kapsid-Lösung für die gewünschte Zeit in den Thermocycler ein. Übertragen Sie die Röhrchen nach dem Erhitzen unverzüglich in den vorgekühlten Thermocycler bei vier Grad Celsius und lagern Sie sie dort fünf Minuten lang. Zentrifugieren Sie die Röhrchen kurz, um alle Tropfen an den Boden der Röhrchen zu bringen.

Verdünnen Sie die behandelten Kapsid-Lösungen und PBS auf drei Mikrogramm pro Milliliter. Stellen Sie sicher, dass mindestens 200 Mikroliter verdünnte behandelte Kapsid-Lösung vorhanden sind. Geben Sie anschließend 100 Mikroliter der Kapsid-Lösung in jedes Loch; stellen Sie sicher, dass pro Behandlung mindestens zwei Löcher vorhanden sind. Zusätzlich sind zwei Kontrolllöcher mit jeweils 100 Mikrolitern PBS pro Ligand vorzusehen. Dies liefert die Hintergrundabsorption des Assays. Bedecken Sie die Platte mit einem Deckel und versiegeln Sie die Ränder mit Parafilm, um Verdunstung zu vermindern. Lassen Sie die Platte über Nacht in einem schüttelnden Inkubator bei vier Grad Celsius oder zwei Stunden bei Raumtemperatur stehen.

Nach der Inkubation entfernen Sie die behandelten Kapsid-Lösungen von der Platte. Geben Sie dann 200 Mikroliter Blockierpuffer pro Loch hinzu. Inkubieren Sie zwei Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht verschlossen bei vier Grad Celsius.

In der Zwischenzeit verdünnen Sie den biotinylierten Aptameren auf eine Konzentration von einem Mikromolar in nukleasefreiem Wasser. Stellen Sie sicher, dass ausreichend Lösung für insgesamt 200 Mikroliter pro Behandlung vorhanden ist.

Verdünnen Sie außerdem das gewählte biotinylierte HPGA auf 30 Mikroliter pro Milliliter im Blockierpuffer. Stellen Sie erneut sicher, dass genügend Lösung für ein Gesamtvolumen von 200 Mikrolitern pro Behandlung vorhanden ist.

Nach der Inkubation das Blockierpuffer entfernen und die Platte dreimal mit jeweils 200 Mikrolitern PBST pro Mulde waschen. Die Platte auf sterilen Papiertüchern verkehrt herum abtupfen, um die restliche Feuchtigkeit zu entfernen. Danach jeweils 100 Mikroliter pro Mulde der Liganden-Bindungslösungen hinzufügen, wobei zwei Mulden pro Hitzebehandlungs-Liganden-Kombination vorgesehen sein sollen, und die abgedeckte Platte eine Stunde lang bei Raumtemperatur auf einem Rotationswellen-Schüttler bei etwa 60 U/min inkubieren.

Nach dem Waschen der Vertiefungen gemäß dem schriftlichen Protokoll 100 Mikroliter pro Vertiefung von 0,2 Mikrogramm pro Milliliter Streptavidin-Horseradish-Peroxidase in PBS hinzufügen.

Inkubieren Sie 15 Minuten bei Raumtemperatur mit sanftem Schütteln auf einem Orbital-Schüttler, bevor Sie die Vertiefungen erneut waschen. Danach, nach einem weiteren Waschschritt, fügen Sie 100 Mikroliter pro Vertiefung TMB-Substrat hinzu und lassen Sie die Farbreaktion fünf bis 15 Minuten lang entwickeln. Beobachten Sie die Vertiefungen auf Farbentwicklung.

Stellen Sie sicher, dass die Inkubationszeit zwischen den einzelnen Platten konsistent ist, und beachten Sie den Absorptionsbereich des verwendeten Plattenlesegeräts. Beenden Sie die Reaktionsentwicklung durch Zugabe von 100 Mikroliter pro Vertiefung einer einmolarigen Phosphorsäure. Lesen Sie die Platte unverzüglich bei 450 Nanometern ab.

Erstellen Sie einen neuen Größen-Standardarbeitsablauf in der Software des DLS-Instruments, wie im Textprotokoll beschrieben. Wählen Sie dann den grünen Ausführen-Pfeil in der Software aus und benennen Sie die Probe.

Verdünnen Sie die hitzebehandelten virusähnlichen Partikel oder VLPs im Verhältnis 1 zu 10 in 1X PBS, um eine Endkonzentration von fünf Mikrogramm pro Milliliter zu erreichen. Filtern Sie die Probe anschließend mit einem Filter mit einer Porengröße von einem Mikrometer, um Staubpartikel zu entfernen. Die DLS ist sehr empfindlich gegenüber Staub, da große Partikel viel mehr Licht streuen als kleine Partikel. Geben Sie 50 Mikroliter der verdünnten VLPs in eine kleine Einwegküvette. Platzieren Sie die Küvette in die Probenkammer des Geräts. Starten Sie die Messung und verwenden Sie die Registerkarten „Korrelogramm-Kumulantenanpassung“ und „Expertenempfehlungen“, um die Datenqualität zu bewerten. Überprüfen Sie während der Messung, ob der Polydispersitätsindexwert unter 0,3 liegt, was eine qualitativ hochwertige Messung anzeigt.

Stellen Sie im Multiview-Tab sicher, dass der Korrelationskoeffizient kurzzeitig konstant und nahe, aber nicht über eins liegt und zu einem späteren Zeitpunkt stark auf null abfällt, was auf die Partikelgröße hinweist. Nutzen Sie den Expertentipp-Tab, um Rückmeldungen zur Datenqualität während der Messungen zu erhalten. Überprüfen Sie nach Abschluss der Messung erneut, ob der Polydispersitätsindexwert unter 0,3 liegt.

Stellen Sie sicher, dass die Kumulanten-Anpassungslinie den Datenpunkten im Reiter „Kumulanten-Anpassung“ eng folgt. Erstellen Sie eine neue Standardarbeitsanweisung für die Größenbestimmung in der DLS-Instrumentensoftware, wie im Textprotokoll beschrieben. Wählen Sie den Ausführen-Pfeil in der Software, um eine neue Probe zu öffnen und zu benennen, und lassen Sie das Instrument die Temperaturgleichgewicht einstellen.

Überführen Sie die VLP-Suspension langsam und blasenfrei in eine Quarzküvette mit kleinem Volumen, indem Sie entlang der Wand der Küvette pipettieren. Nachdem das Gerät die Temperaturgleichgewicht erreicht hat, setzen Sie die Küvette in die Probenkammer ein. Warten Sie 10 Sekunden, bis die Probentemperatur sich ausgeglichen hat, starten Sie dann die Messung und gleichzeitig einen Timer.

Stoppen Sie die Stoppuhr am Ende der ersten Messung. Verwenden Sie diese Zeit als den ersten Zeitpunkt. Ermitteln Sie nachfolgende Zeitpunkte aus den vom Software aufgezeichneten Messzeiten.

Führen Sie die Hitzebehandlung wie zuvor durch, ersetzen Sie jedoch PBS durch 10 Millimolar HEPES, pH 7,4, und verdünnen Sie die Kapside nach der Behandlung nicht weiter. Pipettieren Sie anschließend den gesamten 15-Mikroliter-Tropfen der behandelten Kapsidlösung auf Paraffinfolie. Greifen Sie die Gitterkante mit einer Pinzette, sodass diese sich an der Kante schließt, um das Gitter zu halten, und platzieren Sie das Gitter mit der Kohlenstoffseite nach unten auf den Tropfen der behandelten Lösung.

Lassen Sie das Gitter 10 Minuten lang inkubieren, damit die Kapside an das Gitter binden können. Je nach Reinheit der Kapsidpräparation fügen Sie Waschschritte mit der HEPES-Lösung in Form von 10 bis 15 µL-Tropfen hinzu, die in einer Linie nach dem behandelten Kapsidtropfen platziert werden. Heben Sie nach 10 Minuten das Gitter mit dem Tropfen auf.

Platzieren Sie das Objektträgergitter nahezu senkrecht zu einem Stück Filterpapier, um den Tropfen abzuleiten. Verwenden Sie dann das Gitter, um den Tropfen von 10 bis 15 Mikroliter HEPES-Puffer aufzunehmen, und halten Sie ihn 30 Sekunden lang. Nach einer Spüldauer von 30 Sekunden leiten Sie den Tropfen mit einem weiteren Stück Filterpapier ab.

Als Nächstes einen 15-Mikroliter-Tropfen einer zweiprozentigen Uranylacetat-Lösung auf einen leeren Bereich des Paraffinfilms geben. Den Tropfen Uranylacetat mit dem Objektträger aufnehmen und 45 Sekunden lang halten. Anschließend das Uranylacetat mit einem Papierfilter abwickeln, wobei sichergestellt werden muss, dass der größte Teil der Lösung entfernt wird.

Legen Sie das Gitter mit der Kohlenseite nach oben auf ein Stück Filterpapier, wobei darauf geachtet werden muss, dass das Gitter nicht an der Feuchtigkeit auf den Pinzetten haftet. Anschließend wird das Filterpapier mit dem darauf liegenden Gitter in eine offene Glas-Petri-Schale gelegt. Nachdem dieser Vorgang für alle Behandlungen wiederholt wurde, werden die Petri-Schalenhälften mit den Gittern über Nacht in einen Exsikkator gegeben, um sie vor der Beobachtung mit dem TEM zu trocknen.

Das folgende Diagramm zeigt die zeitliche Abnahme der Bindungsfähigkeit menschlicher Norovirus-Kapside bei einer Behandlungstemperatur von 68 Grad Celsius. Wie ersichtlich ist, verschwindet die HPGA-Bindung als erstes Signal vollständig. Zu diesem Zeitpunkt wird angenommen, dass die überwiegende Mehrheit der Kapside in der Lösung ihre Fähigkeit verloren hat, an Wirtszell-HPGAs zu binden, und daher nicht in die Zelle aufgenommen werden kann.

Die Aptamerbindung ähnelt der von HBGA, erfordert jedoch eine leicht stärkere Hitzebehandlung, um das Signal zu entfernen. Dargestellt ist eine DLS-Korrelationskoeffizientenkurve, die für Daten von guter Qualität repräsentativ ist. Zu einem Zeitpunkt nahe null ist das Korrelogramm konstant bei einem Wert nahe, jedoch unter eins.

Anschließend fällt sie sprunghaft auf null ab, und zwar zu einem Zeitpunkt, der charakteristisch für die Partikelgröße ist. Die aus diesem Experiment erhaltenen Größenangaben können vermutlich vertrauenswürdig sein. Umgekehrt repräsentiert dieser Korrelationskoeffizientenverlauf Daten von geringer Qualität.

Das Korrelogramm beginnt mit einem Wert über eins und fällt allmählich auf null ab. Die Ergebnisse dieses Experiments sollten nicht verwendet werden. Hier zeigen die Partikelgrößendaten ein klares Aggregationsprofil für Kapside, die bei 68 Grad Celsius behandelt wurden, wobei sich nach etwa 20 Minuten Superaggregate bilden.

Der Zeitpunkt, zu dem die Superaggregation auftritt, ist charakteristisch für die Empfindlichkeit der VLPs gegenüber dieser Behandlung. Diese Abbildung zeigt die TEM-Ergebnisse der Hitzebehandlung von menschlichen Norovirus-Kapsiden. Hier wurden die Kapside von links nach rechts bei Temperaturen zwischen 60 und 80 Grad Celsius behandelt.

Wie ersichtlich ist, verändert sich die Kapsid-Morphologie deutlich durch die Behandlung, da Kapside aggregieren und denaturieren. Ein ähnliches Phänomen wird bei Kapsiden beobachtet, die bei 68 Grad Celsius für null bis 25 Minuten behandelt wurden.

Wenn diese Techniken einmal beherrscht sind, können sie bei korrekter Durchführung innerhalb von einer bis 24 Stunden durchgeführt werden.

Nach ihrer Entwicklung bot diese Technik den Forschern auf dem Gebiet der Lebensmittelvirologie eine zusätzliche Möglichkeit, die Mechanismen und Wirkungen der Inaktivierung auf den Kapsiden humaner Noroviren zu untersuchen. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie eine Echtzeit-RT-PCR mit und ohne RNase-Vorbehandlung, SDS-Page der viralen Kapside sowie Plaque-Assays mit kultivierbaren Ersatzviren durchgeführt werden, um einen umfassenderen Überblick über die virale Reduktion nach einer bestimmten Behandlung zu erhalten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Ligandenbindung, die dynamische Lichtstreuung und die Transmissionselektronenmikroskopie nutzen kann, um tiefere Einblicke in die Wirkmechanismen der Inaktivierungsbehandlung auf das Kapsid des humanen Norovirus zu gewinnen.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit einigen der verwendeten Reagenzien gefährlich sein kann, und beachten Sie stets Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von persönlicher Schutzausrüstung sowie die Einhaltung bewährter Labor-Sicherheitspraktiken, während Sie dieses Verfahren durchführen.