Quantitative ganze-Mount Immunfluoreszenz Analyse der kardialen Vorläuferzellen Populationen in Mausembryonen

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, die Lokalisierung und Verteilung von kardialen Vorläuferzellen während der Herzorganogenese quantitativ zu bewerten. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Antworten auf dem Gebiet der Herzentwicklung zu beantworten, indem sie es uns ermöglicht, die Lokalisierung von kardialen Vorläuferpopulationen während der normalen Embryonalentwicklung zu beobachten. Die Hauptvorteile dieser Technik bestehen darin, dass die volumetrischen Bilder quantitative Informationen über die Dynamik auf Gewebeebene liefern können und dass die Analysepipeline für eine verbesserte Reproduzierbarkeit automatisiert werden kann.

Obwohl diese Methode Informationen über die frühe kardiale Organogenese liefert, kann sie auch auf die allgemeine Untersuchung der frühen Embryogenese oder auf die Morphogenese anderer Organe von Interesse angewendet werden. Desinfizieren Sie am Morgen des achten embryonalen Tages den Bauch der trächtigen Maus mit 70%igem Ethanol und machen Sie einen Bauchschnitt durch die Haut und die Körperwand. Beginnen Sie oberhalb eines Eileiters und zerlegen Sie vorsichtig das Fett entlang der Seite der Gebärmutter bis zum Gebärmutterhals.

Machen Sie einen Schnitt durch den Gebärmutterhals und fahren Sie mit dem Schnitt bis zum oberen Ende des anderen Eileiterschnitts fort, um die gesamte Gebärmutter freizugeben. Waschen Sie das überschüssige Blut aus der Gebärmutter in einer 10 Zentimeter großen Schale mit frischem PBS und schneiden Sie das Mesometrium zwischen jedem Deziduom. Übertragen Sie die Embryonen unter einem Präpariermikroskop in eine sechs Zentimeter große Schale mit frischem PBS und entfernen Sie mit einer feinen Pinzette Nummer fünf das Gebärmuttergewebe aus dem Dezidualgewebe.

Schneiden Sie dann vorsichtig die Spitze der embryonalen Hälfte des Deziduums ab, um die Embryonen freizulegen, und kneifen Sie das Deziduom zusammen, um den ersten Embryo vorsichtig herauszudrücken und herauszuziehen. Sezieren Sie so viel überschüssiges embryonales Gewebe wie möglich, ohne die Morphologie des Tieres zu beschädigen, und legen Sie den Embryo mit einer Transferpipette in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen mit frischem PBS auf Eis. Wenn alle Embryonen entnommen wurden, aspirieren Sie das PBS aus jedem Röhrchen und spülen Sie die Embryonen mit frischem PBS aus.

Nachdem Sie das PBS gründlich aus jedem Röhrchen abgesaugt haben, fixieren Sie die Embryonen eine Stunde lang bei Raumtemperatur in 4%igem Paraformaldehyd, gefolgt von drei Wäschen mit frischem PBS und lagern Sie die Embryonen dann bei vier Grad Celsius. Beginnen Sie damit, das PBS durch einen Milliliter Blockierungspuffer für eine vierstündige Inkubation bei Raumtemperatur zu ersetzen. Am Ende der Inkubation wird der Blockierungspuffer durch die entsprechende Primärantikörpermischung und den verdünnten Blockpuffer ersetzt, um eine Inkubation über Nacht bei vier Grad Celsius

Am nächsten Morgen aspirieren Sie den überschüssigen Antikörper und waschen Sie die Embryonen dreimal eine Stunde lang pro Waschgang in 0,1 % Triton in PBS. Nach dem dritten Waschen geben Sie die entsprechende Sekundärantikörpermischung für eine dreistündige Inkubation bei Raumtemperatur in die Embryonen, gefolgt von drei Waschgängen, wie gerade gezeigt. Als nächstes färbt man die Embryonen 10 Minuten lang mit DAPI in PBS, gefolgt von zwei fünfminütigen Wäschen, und suspendiert die Embryonen dann langsam in Anti-Fading-Eindeckmedium, so dass sich die Embryonen mindestens eine Stunde lang mit regelmäßigem sanftem Schnippen ausgleichen können, damit die Proben in die Lösung fallen.

Bevor Sie die Embryonen montieren, machen Sie zwei parallele Stapel von fünf bis sechs Lagen Doppelklebeband im Abstand von 15 bis 20 Millimetern auf einen Objektträger pro Embryo und geben Sie einen 15-Mikroliter-Tropfen Anti-Fade-Medium auf jeden Objektträger zwischen den Klebebandstapeln. Übertragen Sie vorsichtig einen Embryo in jeden Tropfen und positionieren Sie die Embryonen mit einem Seziermikroskop und einer feinen Pinzette, wobei die vorderen Seiten vom Objektträger abgewandt und ihre Körperachse in einer Linie mit der Längsachse der Objektträger liegt. Um die Deckgläser zu platzieren, legen Sie zuerst eine Seite des Glases auf einen Stapel Doppelklebeband und senken Sie das Deckglas mit einer Pinzette vorsichtig ab, bis es den anderen Klebebandstapel berührt.

Besonders wichtig ist es, die Embryonen sorgfältig zu positionieren und zu montieren. Embryonen, die nicht richtig positioniert sind, sind viel schwieriger abzubilden und erfordern möglicherweise eine zusätzliche Verarbeitung, um gute quantifizierbare Daten zu erhalten. Verwenden Sie eine Pipette, um zusätzliches Anti-Fade-Medium zwischen dem Objektträger und dem Deckglas hinzuzufügen, um ein Austrocknen der Probe während der Bildgebung zu verhindern, und wählen Sie das Objektiv mit der höchsten verfügbaren Vergrößerung, mit dem die gesamte kardiale Sichelregion in einem Sichtfeld erfasst werden kann.

Richten Sie dann die Bildgebungsparameter mit den standardmäßigen Best Imaging Practices ein und verwenden Sie die Nyquist-Abtastraten, um die XYZ-Voxelabmessungen jedes Embryos zu bestimmen. Um die Embryonenbilder zu analysieren, laden Sie die Rohbilddatensätze in die entsprechende Bildanalysesoftware und öffnen Sie die erste Datei in der Überblendungsansicht. Die Daten werden in einer 3D-Ansicht im Projektionsmodus mit maximaler Intensität geladen.

Öffnen Sie das Fenster zur Anzeigeanpassung und wählen Sie nur den Referenzkanal aus. Passen Sie den Schwellenwert des Bildes nach Bedarf an. Wenn das Signal-Rausch-Verhältnis für die Segmentierung zu niedrig ist, passen Sie das Gamma an.

Die Befolgung von Best Practices während der Bildaufnahme ist entscheidend für die Gewinnung geeigneter Daten und hängt von der verwendeten Mikroskopieeinrichtung ab. Wenn Anpassungen des Gammas erforderlich sind, sollten diese Bilder nicht zum Vergleich von Fluoreszenzintensitäten verwendet werden. Verwenden Sie das Dialogfeld Oberflächenalgorithmus, um eine neue Oberfläche für den Referenzkanal zu erstellen, und aktivieren Sie das Kontrollkästchen Nur Segmentursprung von Interesse.

Passen Sie den Begrenzungsrahmenbereich so an, dass er den interessierenden Bereich enthält, der durch den Referenzfarbstoff abgegrenzt wird, und wählen Sie den Referenzkanal aus dem Dropdown-Menü des Quellkanals aus. Stellen Sie die Glättung auf die Hälfte der Z-Voxelgröße ein, und verwenden Sie die Schwellenwert-Schieberegler, um die untere Grenze auf die absolute Intensität einzustellen, um sicherzustellen, dass die Oberfläche nicht über das Kanalsignal hinausragt. Filtern Sie die Objekte nach Voxelnummer oder Volumen, lehnen Sie alle Hintergrundobjekte ab, die der Algorithmus möglicherweise generiert hat, und beenden Sie den Algorithmus.

Wählen Sie als Nächstes die neu erstellte Oberfläche aus und wählen Sie die Funktion Maskensatz aus dem Bearbeitungsfenster. Wählen Sie den gewünschten experimentellen Kanal aus, wobei Sie darauf achten müssen, dass das Kontrollkästchen Kanal vor dem Anwenden der Maske duplizieren aktiviert ist, und wählen Sie den Maskenkanal nur im Anzeigeanpassungsfenster aus. Erstellen Sie dann eine neue Oberfläche, wie gerade gezeigt.

Um die volumetrischen Daten für jede ausgewählte Oberfläche zu erhalten, öffnen Sie die Unterregisterkarte Detail auf der Registerkarte Statistik, und wählen Sie Durchschnittswerte aus dem Dropdown-Menü aus. Das Gesamtvolumen der Fläche wird in der Summenspalte der generierten Tabelle angezeigt. Hier ist ein embryonaler Tag 8.25 Mausembryo mit GFP-positiven ventrikulären kardiovaskulären Vorläuferzellen gezeigt, die mit einem anti-kardialen Sichel-Antikörper markiert sind, wie gerade gezeigt.

Nach der Auswahl des Referenzkanals für das gefärbte Gewebe werden die Intensität und das Gamma angepasst, bevor mit dem Algorithmus zum Erstellen von Oberflächen begonnen wird. Der Interessenbereich wird ausgewählt, und der Detaillierungsgrad der Oberfläche wird ausgewählt. Die Anfangsfläche ist mit einem Schwellenwert versehen, um alle echten Signale in der Oberfläche einzuschließen.

Anschließend wird eine Filterung durchgeführt, um kleine Hintergrundfragmente zu entfernen und eine endgültige Referenzoberfläche zu erhalten. Durch Auswahl der Referenzfläche kann der Vergleichskanal dupliziert und maskiert werden. Die Intensität und das Gamma für diesen Kanal werden angepasst, bevor eine zweite Oberfläche in der gleichen Abfolge von Schritten erzeugt wird.

Das Gesamtvolumen für jede Fläche wird dann automatisch berechnet und kann sowohl quantitativ als auch visuell verglichen werden. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Qualität der präparierten Embryonen, die Wirksamkeit der Antikörper, die Ausrichtung der Montage und die Bildgebung die Qualität der endgültigen Daten beeinflussen. Zusätzlich zu dieser quantitativen Analysepipeline können andere Methoden wie die Dekonvolution durchgeführt werden, um zusätzliche qualitative Daten zu erhalten.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technologie den Weg für Forscher in der kardiologischen Entwicklung, um die Dynamik neuartiger kardialer Vorläuferpopulationen während der frühen Embryogenese zu erforschen.