Name: Messung der Influenza neutralisierenden Antikörperantworten gegen a/H3N2-Viren im menschlichen Serum von Microneutralization Assays mit MDCK-SIAT1 Zellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 9 s
Description: Erfahren Sie, wie man mit MDCK-SIAT1-Zellen und Mikroneutralisationstests die neutralisierenden Antikörpertiter gegen H3N2-Influenzaviren im menschlichen Serum misst. Diese Methode ermöglicht die Bewertung der Impfimmunität.

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Wir danken Dr. Xiuhua Lu, Dr. Feng Liu und Frau Ashley Burroughs aus der Influenza-Division des CDC für ihre kritische Überprüfung und Unterstützung bei der Vorbereitung dieser Handschrift. Wir danken Dr. Adrian Reber von Influenza Division des CDC für seine Hilfe bei der Vorbereitung der Grafik in Abbildung 3. Zu guter Letzt bedanken wir uns bei Dr. M. Matrosovich, Marburg, Deutschland für die Bereitstellung der MDCK-SIAT1-Zellen.

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</ol>

Die Autoren berichten keinen Interessenskonflikt. Die Ergebnisse und Schlussfolgerungen in dieser Publikation sind diejenigen der Autoren und repräsentieren nicht unbedingt die Ansichten der Centers for Disease Control and Prevention und die Leistungsträger.

Die MN-Assay ist eines der wichtigsten Assays für Influenza Serologie zur Antikörperantworten nach Influenza-Infektion oder Impfung eingesetzt. Titer von MN-Assays generiert werden oft als die primären Endpunkt vieler Grippe Seroepidemiology Studien verwendet. MN-Assays sind auch für Sero-Diagnostik und der Bewertung der Impfstoff Immunogenität verbreitet. Internationalen Inter Lab Studien wurden durchgeführt, um MN Assays trat in mehreren Laboratorien14zu vergleichen.
...

Influenza-Viren weiterhin Morbidität und Mortalität in der Bevölkerung jedes Jahr verursachen. HA ist die große Oberfläche Glykoprotein von Influenza-Viren. Neutralisierende Antikörper gezielt HA sind die wichtigsten Immunmechanismus, die mit dem Schutz der Influenza-Infektion1,2korreliert. Hämagglutination Inhibition (HI) Assays und MN-Assays sind zwei Methoden, die häufig verwendet, um Antikörperreaktionen im menschlichen Serum nach Grippe-Infektion oder Impfung3messen. Die HI-Assay misst Antikörper Hemmung der Virus Hämagglutination der roten Blutkörperchen und gilt als einen Surrogat-Assay. Im Gegensatz zu HI kann die MN-Assay direkt die Ebenen von Antikörpern im menschlichen Serum messen, die Influenza-Infektion in Zellkulturen zu neutralisieren. MDCK-Zellen dienen häufig Influenza Virus isoliert und MN assays4.
Influenza-Viren werden ständig Antigendrift und Shift, Erwerb von Mutationen auf HA-Proteine, die verbindliche Rezeptorspezifität Viren verändern können. Seit 2014 neue Cluster a/H3N2-Viren entstanden und weiter bis zur aktuellen Saison zirkulieren. Die meisten dieser Viren gehören zu den genetischen Gruppe 3C.2a und 3C.3a basierend auf phylogenetische Analyse der HA Proteine. Viele der zirkulierenden Viren 3C.2a Fähigkeit, die roten Blutkörperchen hemagglutinate reduziert hatte und daher können nicht von HI-Assays5geprägt sein. Neutralisation Assays müssen verwendet werden, um die Antikörperreaktionen auf diese Viren zu messen, die nicht6hemagglutinate. Darüber hinaus haben Studien gezeigt, dass diese zeitgenössischen a/H3N2-Viren Rezeptor bindende Eigenschaften im Vergleich zu früheren a/H3N2-Viren verändert und neigen dazu haben, Kultur angepasst Mutationen und Polymorphismus bei in in-vitro- Zellen passagiert akkumulieren Kulturen7,8,9. Verglichen mit konventionellen MDCK-Zellen, ist MDCK-SIAT1 eine Zell-Linie von Matrosovich Et Al. entwickelt durch stabile Transfektion von MDCK Zellen mit cDNA des menschlichen α2, 6-Sialtransferase (SIAT1). Diese Zelllinie drückt erhöhte Mengen an α2, 6-sialic Galaktose Moieties und geringere Mengen an α2, 3 sialic Acid Moieties als das übergeordnete Element MDCK Zellen10. MDCK-SIAT1 Zellen haben gezeigt, um Isolierung Preise für a/H3N2-Viren im Vergleich zu MDCK Zellen11zu verbessern. Vor kurzem, Lin Et al. berichtet, dass für frisch geschlüpfte 3C.2a und 3C.3a menschlichen a/H3N2 Influenzaviren, treuer Virus Replikationen und bessere Virus Infektiosität erreicht wurden, wenn Viren in MDCK-SIAT1-Zell-Linien im Vergleich zu MDCK Zellen7kultiviert wurden. Somit eignen sich die MDCK-SIAT1 Zellen besser in MN-Assays Antikörperantworten den jüngsten Clustern von a/H3N2-Viren zu charakterisieren.
Hier beschreiben wir eine MN-Assay mit MDCK-SIAT1 Zellen zu Antikörperreaktionen auf zeitgenössische 3C.2a und 3C.3a a/H3N2-Viren im menschlichen Serum messen. Viren, die in Eiern oder Zellen gewachsen können in diesem Test verwendet werden. Hitze inaktiviert Sera, neutralisierende Antikörper enthält sind zunächst seriell verdünnt, dann inkubiert mit 100 TCID50/gut von Influenza-a/H3N2-Virus Antikörper im Serum, um das Virus zu binden zu ermöglichen. MDCK-SIAT1 Zellen sind dann die Virus-Antikörper-Mischung hinzugefügt und für 18-20 h bei 37 ° C, 5 % CO2 erlauben das a/H3N2 Virus MDCK-SIAT1 Zellen infizieren und replizieren inkubiert. Nach der Inkubation über Nacht die Platten werden fixiert und der Virusmenge in jede Vertiefung wird von einem ELISA mit Anti-Grippe A NP monoklonalen Antikörpern quantifiziert. Die Erkennung von NP zeigt das Vorhandensein des Virus-Infektion und das Fehlen von neutralisierenden Antikörpern. Neutralisierende Antikörpertiter ist definiert als der Kehrwert der höchsten Serum Verdünnung, die ≥ 50 % Hemmung der Virus Infektiosität bereitstellt.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco' s Modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) mit hohem Glukosegehalt</td><td>Life Science</td><td>11965</td><td>Ein kritischer Bestandteil von sterilen Zellkulturen, Virusvermehrungs- und Virusverdünnungsmedien</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Hyklon</td><td>SH30070,03</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA) Fraktion V, Protasefreies</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3117332001</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Life Science</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyruvat</td><td>Life Science</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Geneticin G-418 Disulfatsalz&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1720-5G&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life Science</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Life Science</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>VWR</td><td>67-64-1</td><td>Wird in einer Konzentration von 80 %</td></tr><tr><td>verwendet Phosphat-Citrat-Puffer mit Natriumperborat&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLBF2806V</td><td></td></tr><tr><td>O-Phenylendiamin Dihydrochlorid Tablette</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLBQ1086V</td><td>1 Tablette pro 100 ml Wasser in Zellkulturqualität</td></tr><tr><td>Schwefelsäure</td><td>Fisher Scientific</td><td>A510-P500</td><td>Verwendet 0,5 M Endkonzentration</td></tr><tr><td>Ethanol, denaturiert, 4L</td><td>VWR</td><td>EM-AX0422-3</td><td>Verwendet in einer Konzentration von 70 %</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Life Science</td><td></td><td></td>1748048</tr><tr><td>RDE II "Seiken"</td><td>Denka Seiken</td><td>370013</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Anti-NP Maus monoklonal Ab</td><td>Millipore Pool</td><td>MAB 8257 MAB 8258</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus IgG HRP&nbsp;</td><td>KPL</td><td>074-1802</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Platten mit flachem Boden</td><td>Thermo Scientific</td><td>3455</td><td></td></tr><tr><td>Plattenleser</td><td>Molekulares Gerät</td><td>Spectromax 384 plus</td><td></td></tr><tr><td>Zellkulturflasche 162 cm2/Vent Cap</td><td>Corning/VWR</td><td>3151</td><td></td></tr></tbody></table>

messung der influenza neutralisierenden antikörperantworten gegen a/h3n2-viren im menschlichen serum von microneutralization assays mit mdck-siat1 zellen

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to A(H3N2) Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Neutralisierende Antikörper gegen Hämagglutinin (HA) von Influenza-Viren werden die wichtigsten Immunmechanismus angesehen, die mit Schutz für Influenza-Infektionen korreliert. Microneutralization (MN) Assays werden häufig verwendet, um neutralisierende Antikörperreaktionen im menschlichen Serum nach Influenza-Impfung oder Infektion zu messen. Verdeckte Darby Canine Kidney (MDCK) Zellen sind die häufigsten verwendeten Zelle Substrat für MN-Assays. Allerdings verändert die derzeit zirkulierenden 3C.2a und 3C.3a a/H3N2 Influenza Viren erworbenen Rezeptorspezifität Bindung. Die MDCK-SIAT1-Zell-Linie mit erhöhten α-2,6 sialic Galaktose Moieties auf der Oberfläche erweist sich verbesserte Infektiosität und treuere Repliken als herkömmliche MDCK-Zellen für diese zeitgenössischen a/H3N2-Viren zur Verfügung. Hier beschreiben wir eine MN-Assay mit MDCK-SIAT1 Zellen, die zu neutralisierende Antikörpertiter zu dieser zeitgenössischen a/H3N2-Viren quantifizieren optimiert wurde. In diesem Protokoll sind Hitze inaktiviert Sera, neutralisierende Antikörper enthält zunächst seriell verdünnt dann inkubiert mit 100 TCID50/gut von Influenza a/H3N2-Viren Antikörper im Sera binden an die Viren ermöglichen. MDCK-SIAT1 Zellen sind dann die Virus-Antikörper-Mischung hinzugefügt und inkubiert für 18-20 h bei 37 ° C, 5 % CO2 , a/H3N2-Viren MDCK-SIAT1 Zellen infizieren können. Nach der Inkubation über Nacht, sind Platten fixiert und der Virusmenge in jedem gut durch ein Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay (ELISA) mit Anti-Grippe quantifiziert ist ein monoklonaler Antikörper Nucleoprotein (NP). Neutralisierende Antikörpertiter ist definiert als der Kehrwert der höchsten Serum Verdünnung, die ≥50 % Hemmung der Virus Infektiosität bereitstellt.

Bestimmung der die Infektiosität der Virus Bestände ist der erste Schritt bei der MN-Assay. Abbildung 2 veranschaulicht die Platte Layout um die TCID50 der Virus Bestände zu bestimmen. Für Virus Bestände mit unbekannten Infektiosität kann das Virus aus mehreren Pre-Verdünnungen, z.B. 10-2 und 10-3, titriert werden, um die beste Titration Kurve zur Berechnung der Infektiosität des Virus zu erfassen. Die Virus-Menge in der MN-As...

Grippe neutralisierende Antikörper korrelieren mit dem Schutz der Influenza-Infektionen. Microneutralization Assays messen neutralisierende Antikörper im menschlichen Serum und dienen oft der menschlichen Grippe-Serologie. Wir beschreiben einen Microneutralization-Assay mit MDCK-SIAT1 Zellen um zu messen, neutralisierende Antikörpertiter zu zeitgenössischen 3C.2a und 3C.3a a/H3N2-Viren nach Influenza-Impfung oder Infektion.

Messung der Influenza neutralisierenden Antikörperantworten gegen a/H3N2-Viren im menschlichen Serum von Microneutralization Assays mit MDCK-SIAT1 Zellen

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for ...

Das übergeordnete Ziel dieses Mikroneutralisationsassays ist es, neutralisierende Antikörperreaktionen auf zeitgenössische H3N2-Influenzaviren in menschlichen Seren mit MDCK-SIAT1-Zellen zu messen. Diese Methode kann verwendet werden, um Schlüsselfragen zur Bewertung der Influenza-Immunität zu beantworten. So kann beispielsweise festgestellt werden, ob die Grippeimpfung ausreichend neutralisierende Antikörperreaktionen auf zirkulierende H3N2-Viren hervorruft, um eine Infektion zu verhindern.Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass MDCK-SIAT1-Zellen und Mikroneutralisationsassays verwendet werden, um Antikörperreaktionen auf das Zurücksetzen antigener Cluster von H3N2-Influenzaviren nachzuweisen. Virusbestände sollten vor der Verwendung in Mikroneutralisationsassays auf hohe infektiöse Titer vermehrt werden. Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Vermehrung von AH3N2-Viren in MDCK-SIAT1-Zellen, wie im Textprotokoll beschrieben.Tauen Sie am ersten Tag ein Fläschchen mit dem Virus bei Raumtemperatur auf und legen Sie das Virus sofort auf Eis. Um das Virus in zwei verschiedenen Anfangsverdünnungen zu testen, geben Sie zunächst 100 Mikroliter Virus zu 99 Millilitern Virusverdü

measuring-influenza-neutralizing-antibody-responses-to-h3n2-viruses

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Dieses Video zeigt Mikroneutralisationsassays zur Messung neutralisierender Antikörper mit Hilfe von Madin-Darby Canine Kidney Zellen, die α2,6-verknüpfte Sialinsäure in menschlichen Seren überexprimieren. Dieser Assay wird häufig in der Influenza-Humanserologie...

Ein Mikroneutralisationsassay zur Messung neutralisierender Antikörpertiter im Humanserum

Dieses Video zeigt den bildgebenden Mikroneutralisationsassay zur Analyse der antigenen Beziehungen zwischen Influenza-A- und -B-Viren. Es bietet eine quantitative und visuelle Möglichkeit, die Wirksamkeit von Antikörpern oder anderen Behandlungen bei der Vorbeugung von Virusinfektionen zu beurteilen.

Analyse der antigenen Beziehung zwischen Viren mit Hilfe eines bildbasierten Mikroneutralisationsassays

Dieses Video zeigt eine Technik zur Erzeugung von Escape-Varianten von neutralisierenden monoklonalen Antikörpern des Influenzavirus. Antikörper-neutralisierte Virussuspension wird in embryonisierte Hühnereier injiziert, um Fluchtvarianten selektiv zu vermehren. Dies führt zu einer Viruspopulation, die überwiegend aus Escape-Varianten besteht, was durch einen Hämagglutinationsassay bestätigt wurde.

Entstehung von Influenzavirus-Escape-Varianten gegen neutralisierende Antikörper

Dieses Video zeigt einen Assay, der die Influenza-Neuraminidase (NA) misst, die die Antikörpertiter in einer Serumprobe hemmt. Eine Serumprobe, die Antikörper gegen NA enthält, wird auf eine mit Fetuin beschichtete Mikrotiterplatte gegeben. Nach Zugabe des Virus verhindern die Antikörper, dass virale NA Fetuin spaltet und seine Galaktose-Einheit freilegt. Anschließend wird ein Peroxidase-konjugiertes Lektin zugegeben, das an die exponierte Galaktose bindet. Der NA-hemmende Antikörpertiter wird...

Ein Assay zur Messung von Antikörpertitern zur Influenza-Neuraminidase-Hemmung

Dieses Video zeigt einen Immunfluoreszenz-Assay, der zur Messung der Neutralisation des humanen Cytomegalievirus (HCMV) entwickelt wurde. Virusspezifische Antikörper werden mit dem Virus gemischt und mit menschlichen Fibroblastenzellen inkubiert. Die Antikörper neutralisieren das Virus, so dass es die Wirtszellen nicht infizieren kann, während nicht neutralisierte Viren die Zellen infizieren. Nach der Inkubation wird das Ausmaß der Neutralisation durch Quantifizierung der virusinfizierten...

Eine Immunfluoreszenzmethode zur Messung der Neutralisation des humanen Cytomegalievirus

Wir beschreiben den Enzyme-linked Lectin Assay (ELLA) zur Messung von Influenza-Neuraminidase (NA)-Inhibitions-Antikörpertitern in Seren. Der Assay verwendet Erdnuss-Agglutinin, um Galaktose-Rückstände zu quantifizieren, die zugänglich werden, wenn NA Sialinsäure von Fetuin-beschichteten 96-Well-Platten entfernt.

Messung von Influenza-Neuraminidase Inhibition Antikörpertiter durch Enzyme-Linked-Lectin-Assay

Diese Studie beschreibt ein   Imaging-basierte Mikroneutralisationstest auf die antigenen Beziehungen zwischen Viren zu analysieren. Das Protokoll verwendet einen Flachbettscanner und hat vier Schritte, einschließlich der Titration Titration Quantifizierung, Neutralisierung und Neutralisierung Quantifizierung. Der Test funktioniert gut mit aktuellen zirkulierenden Influenza A (H1N1) pdm09, A (H3N2) und B-Viren.

Optimierung eines Assay Quantitative Mikroneutralisations

Die vorgestellten Protokolle wird beschrieben, wie einen Hämagglutination Inhibition Assay Quantifizierung des Influenza-spezifischen Antikörper-Titer von Serumproben von Grippe-Impfstoff Empfängern durchführen. Der erste Test bestimmt optimale virale Antigen-Konzentrationen durch Hämagglutination. Die zweite Probe quantifiziert Influenza-spezifischen Antikörper-Titer Hämagglutination Inhibition.

Eine optimierte Hämagglutination Inhibition (HI) Assay, Influenza-spezifischen Antikörper-Titer zu quantifizieren

Influenza A-Viren (IAVs) sind wichtige Humanpathogene Atemwege. Die Pathogenität von IAVs verstehen und neuartigen Impfstoff präklinischen Erprobung durchführen, sind Tiermodelle imitiert menschliche Physiologie erforderlich. Hier beschreiben wir Techniken zur Bewertung IAV Pathogenese, humorale Reaktionen und Wirksamkeit des Impfstoffes mit einem Maus-Modell der Infektion.

Influenza-A-Virus-Studien in einem Mausmodell der Infektion

Wir beschreiben eine Methode mit der identifizieren wir kritische Rückstände für die Bindung von menschlichen oder murinen monoklonalen Antikörpern, die die virale Hämagglutinin der Influenza A-Viren Zielen erforderlich. Das Protokoll kann zu anderen Virus Oberfläche Glykoproteine und ihre entsprechenden neutralisierende Antikörper angepasst werden.

Generation von Escape Varianten des Influenza-Virus Monoclonal Antikörper neutralisieren

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Verpackung von Pseudoviren und die Messung der Antikörper-neutralisierenden Aktivität.

Herstellung von pseudotypisierten H5-Aviären Influenzaviren mit Calciumphosphat-Transfektionsmethode und Messung der Antikörperneutralisationsaktivität

Erfahren Sie, wie man mit MDCK-SIAT1-Zellen und Mikroneutralisationstests die neutralisierenden Antikörpertiter gegen H3N2-Influenzaviren im menschlichen Serum misst. Diese Methode ermöglicht die Bewertung der Impfimmunität.

Messung der Influenza neutralisierenden Antikörperantworten gegen a/H3N2-Viren im menschlichen Serum von Microneutralization Assays mit MDCK-SIAT1 Zellen (Video) | JoVE Journal

Messung der Influenza neutralisierenden Antikörperantworten gegen a/H3N2-Viren im menschlichen Serum von Microneutralization Assays mit MDCK-SIAT1 Zellen

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