Mit Hilfe der Dot-Assay, Migration der Zelle Blätter zu analysieren

Das übergeordnete Ziel des Dot-Assays ist es, den wandernden Phänotyp von angehängten kohäsiven Zellblättern als Reaktion auf Mikroumgebungsreize zu bewerten. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Krebsbereich zu beantworten, z. B. wie Zytokine oder Wachstumsfaktoren die Beweglichkeit von Tumorzellen verändern. Der Hauptvorteil des Dot-Assays besteht darin, dass er einfach durchzuführen und für reproduzierbare Ergebnisse verwendet werden kann.

Obwohl diese Methode Einblicke in die Zellmotilität geben kann, eignet sie sich auch für eine Reihe nachfolgender Assays, wie z. B. das Färben von Zellen zur Beurteilung der Morphologie von Wachstumskolonien und die Zellstreuung, Immunfärbung, Protein- und DNA- oder RNA-Analyse oder die Injektion von Zellen in Tiere. Tauen Sie zunächst Mauskollagen vier auf Eis auf und verdünnen Sie es mit 50 Mikromolaren HCL, um drei Milliliter einer Kollagen-Vier-Lösung von 10 Mikrogramm pro Milliliter herzustellen. Geben Sie 250 Mikroliter Kollagen-4-Lösung in die Vertiefungen der 12-Well-Glasbodenplatten und geben Sie sie in eine entsprechend große, dicht schließende Plastikbox.

Lege ein feuchtes Papiertuch über und um die Teller, um eine feuchte Kammer herzustellen, und schließe die Box. Inkubieren Sie die Platten dann über Nacht bei Raumtemperatur. Um nicht absorbiertes Kollagen und Puffer zu entfernen, spülen Sie die Platten am nächsten Morgen zweimal mit entionisiertem Wasser ab und leiten Sie das Wasser gut auf den Rand der Platte und nicht auf den Rand, der durch den Randboden und den Deckglas gebildet wird.

Trocknen Sie die Platten in einer Laminar-Flow-Haube an der Luft und verwenden Sie sie sofort oder lagern Sie sie bis zu fünf Tage bei vier Grad Celsius. Zur Herstellung der Zellsuspension verwenden Sie Zellen, die in einer 60-Millimeter-Gewebekulturschale in DMEMF12 Medium gezüchtet wurden, ergänzt mit 5 % Pferdeserum auf 80 % Konfluenz. Verwenden Sie kalzium- und magnesiumfreies DPBS, um die Zellen einmal zu spülen, fügen Sie dann 500 Mikroliter Trypsin EDTA bei Raumtemperatur hinzu und inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius in 5 % CO2 in einer befeuchteten Atmosphäre für drei bis fünf Minuten.

Suspendieren Sie die abgelösten Zellen in 4,5 Millilitern Kulturmedium, um die Trypsinaktivität zu stoppen, und verwenden Sie ein Hämozytometer, um ein Aliquot von 20 Mikrolitern der Zellsuspension zu zählen. Die restlichen Zellen werden in einem konischen 50-Milliliter-Röhrchen durch Zentrifugation bei 200-facher Schwerkraft für drei Minuten herausgezogen. Aspirieren Sie dann den Überstand und suspendieren Sie die Zellen in Kulturmedium auf dreimal 10 bis sechs Zellen pro Milliliter.

Um die Zellen in der Mitte jedes Deckglases der mit Kollagen vier beschichteten 12-Well-Glasbodenplatte zu plattieren, geben Sie einen 10-Mikroliter-Tropfen Zellsuspension und achten Sie darauf, die Beschichtung nicht zu berühren oder zu zerkratzen. Das Plattieren eines nicht kreisförmigen Tropfens ergibt keine kreisförmige Zellschicht, und wenn die Beschichtung berührt oder zerkratzt wird, verhindert sie, dass die Zellen gut haften. Inkubieren Sie die Platte 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in einer befeuchteten Atmosphäre, damit sich die Zellen anheften können.

Überprüfen Sie dann unter einem inversen Mikroskop, ob die Befestigung vorhanden ist. Waschen Sie die Vertiefungen mit einem Milliliter Kulturmedium zweimal, um nicht gebundene Zellen zu entfernen, und geben Sie dann einen Milliliter Kulturmedium in jede Vertiefung. Prüfen Sie unter einem inversen Mikroskop, ob keine schwimmenden Zellen übrig bleiben, andernfalls waschen Sie die Vertiefungen erneut.

Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius in 5 % CO2 in einer befeuchteten Atmosphäre, um gut definierte Zellschichten zu erhalten. Überprüfen Sie mit einem inversen Mikroskop alle Vertiefungen, um sicherzustellen, dass die Zellkolonien richtig gewachsen sind. Markieren Sie ggf. ungeeignete Vertiefungen und verwenden Sie diese nicht.

Beschriften Sie jede Vertiefung der Platte entsprechend für jede untersuchte Bedingung. Führen Sie jede Bedingung doppelt oder dreifach aus. Wechseln Sie das Medium, um die Zellen in DMEMF12 mit 0,1 % Pferdeserum drei Stunden vor der Stimulation der Zellen auszuhungern.

Stimulieren Sie dann die Zellen durch Zugabe von EGF oder anderen gewünschten Mediatoren. Verwenden Sie eine Ein-Mikroliter-Pipette oder schwenken Sie die Platte vorsichtig, um das Medium zu mischen. Inkubieren Sie die Platte ein bis vier Tage lang, um die Kantenverschiebung und die Kantenkontur zu beobachten.

Um die H- und E-Färbung durchzuführen, waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS und fixieren Sie sie etwa zwei Minuten lang. Fügen Sie Hämatoxylin für etwa zwei Minuten hinzu, um die Zellkerne zu färben. Waschen Sie die Zellen fünf bis 10 Minuten lang mit Leitungswasser, bis die Zellkerne blau sind.

Färben Sie dann das Zytoplasma zwei Minuten lang mit Eosin, bevor Sie die Zellen mit entionisiertem Wasser spülen. Trockne die Platte an der Luft, drehe sie dann um und verwende ein Lineal, um den Punktdurchmesser zu messen. Alternativ können Sie Bilder von der Platte mit einer Kamera aufnehmen und ImageJ verwenden, um den Punktdurchmesser zu analysieren.

Um Zeitraffermikroskopie durchzuführen, schalten Sie das Inkubatormikroskop ein und stellen Sie die Temperatur auf 37 Grad Celsius ein. Füllen Sie den Luftbefeuchter mit DH2O und stellen Sie dann den CO2-Gehalt auf 5 % ein. Stellen Sie sicher, dass die Inkubatorkammer befeuchtet ist und dass sich der motorisierte Tisch frei bewegen kann. Schließen Sie dann die Inkubatorkammer und lassen Sie das Mikroskop auf 37 Grad Celsius einstellen.

Platzieren Sie die Platte auf dem Tisch des Inkubatormikroskops und richten Sie die Tischliste ein, dann bilden Sie zwei gegenüberliegende Kanten und die Mitte jedes Zellpunkts ab. Nehmen Sie mit einem 10-fach-Objektiv 15 bis 24 Stunden lang alle drei Minuten Bilder auf. Laden Sie die Daten herunter und fahren Sie mit der Bildanalyse in einem Programm Ihrer Wahl wie Matlab fort.

Zunächst zeigte die Phasenkontrastbildgebung von Zellpunkten, dass invasive, lungenkoloniebildende Brustkrebszellen nach Stimulation mit EGF einen mesenchymalen Phänotyp beibehalten. Einzelne Zellen, die das Blatt verlassen, werden jedoch häufiger in EGF-stimulierten Zellpunkten beobachtet. Das Ansprechen von Lungenkolonie-bildenden Brustkrebszellen auf EGF wurde weiter durch H- und E-Färbung von Kulturen untersucht, die vier Tage lang mit EGF stimuliert wurden.

Tatsächlich führte die EGF-Stimulation zu einem vergrößerten Koloniedurchmesser, was darauf hindeutet, dass die Migration von EGF-stimulierten Zellen verändert sein könnte. In diesem Punktassay wurden Zellen an den Blatträndern neun Stunden lang abgebildet, nachdem sie koloniebildende Brustkrebszellen mit EGF stimuliert hatten. PIV zeigte, dass EGF die Zellgeschwindigkeit von 0,45 Mikrometern pro Minute in Kontrollzellen auf 0,63 Mikrometer pro Minute erhöhte.

Darüber hinaus reduzierte EGF die Variabilität der Zellrichtungsabhängigkeit oder der Winkelspreizung von 0,95 in Kontrollkulturen auf 0,79 in EGF-stimulierten Kulturen. Darüber hinaus erhöhte EGF, wie bei der H- und E-Färbung nach vier Tagen beobachtet wurde, die radiale Verschiebung des Epithelrandes über neun Stunden von 257 Mikrometern auf 356 Mikrometer. Sobald Sie diese Technik beherrschen, beträgt die praktische Zeit für diese Technik einige Stunden.

Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie Zeitraffer-Bildgebung, Immunfärbung sowie DNA- und RNA-Analyse durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten. So kann beispielsweise analysiert werden, ob Proteine in schnell oder langsam migrierenden Zellen unterschiedlich exprimiert werden oder wann Zellen in die Umgebung wandern. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie den Dot-Assay einrichten und ihn verwenden, um den migratorischen Phänotyp von angehängten kohäsiven Zellblättern als Reaktion auf mikroumgebungsbezogene Signale zu beurteilen.