Name: Eine Seminiferous Röhrchen-Squash-Technik für die zytologische Analyse der Spermatogenese mit dem Maus-Modell (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Lernen Sie die Seminiferous-Tubulus-Squash-Technik zur zytologischen Analyse der Spermatogenese bei Mäusen. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung von Spermatozyten während der Meiose unter Erhaltung der Zellintegrität.

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Diese Arbeit wurde unterstützt durch NIGMS (R01GM11755), P.W.J und ein Training Stipendium Stipendium vom National Cancer Institute (NIH) (CA009110), S.R.W. und j.h.

Die Verwendung von Mäusen nahm die institutionellen Animal Care und verwenden Ausschuss der Johns Hopkins University. Experimente wurden durchgeführt auf Juvenile (20-26 Tage Post-Partum, Dpp) Mäusen C57BL/6J, unter Ausnutzung der halbsynchrone erste Welle der Spermatogenese. Jedoch kann diese Technik auch mit Erwachsenen Mäusen durchgeführt werden.
1. Präparation und Isolierung von seminiferous Röhrchen Maus
<ol><li>Bereiten Sie den Fix/Lyse Lösung und Antikörper Verdünnungspuffer (ADB) in Tabelle 1 und Tabelle 2beschrieben.</li>
	<li>Bereiten Sie eine 35-mm-Petrischale mit 3 mL 1 x Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (1 X PBS, pH 7,4) und ein weiteres 35-mm-Gericht mit 2 mL Lösung/Lyse Lösung per Mausklick.</li>
	<li>Opfern Sie die Maus durch zervikale Dislokation oder CO2 Erstickung zu und sprühen Sie ventrale Abdomen mit 70 % Ethanol. Öffnen Sie die Abdominopelvic Hohlraum mit sterile Schere, so dass eine v-förmige Öffnung. Dann entfernen Sie die Hoden durch Ziehen an der epididymal Fettpolster mit Pinzette und nicht zu stören der Tunica Albuginea. Legen Sie die Hoden in einer 35-mm-Petrischale mit 1 X PBS. Hinweis: Nutzen Sie die erste Welle der Spermatogenese, um ein angereichertes Zellpopulation Interesse14zu beobachten. Bestimmte Stufen der Spermatogenese sind bei verschiedenen Maus ab (Tabelle 3) angereichert.</li>
	<li>Entfernen Sie der Hoden Tunica Albuginea durch Punktion des Gewebes mit scharfen spitzen Pinzette und sammeln Sie lose seminiferous Röhrchen. Übertragen Sie die Tubuli auf eine neue 35 mm Petrischale mit 2 mL Lösung/Lyse Lösung.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Tubuli in die Verlegenheit/Lyse-Lösung für 5 min bei Raumtemperatur.</li>
</ol>2. Vorbereitung von seminiferous Röhrchen
<ol><li>Bereiten Sie einen Poly-L-Lysin beschichtete Objektträger umreißen die Ränder der Folie mit einem flüssigen Blocker Stift.</li>
	<li>Gelten Sie 100 µL Fix/Lyse-Lösung für die Mitte der Folie Glas.</li>
	<li>Mit sterilen Pinzette und Schere sanft zu necken auseinander seminiferous Röhrchen. Schneiden Sie lange einzelne Röhrchen Segmente ca. 20 mm Länge. Hinweis: Strukturen, die empfindlich auf Fixativ über längere Zeit, z. B. die Zentrosomen zu visualisieren, die Tubuli zuerst in 1 X PBS zu trennen, dann direkt Hackfleisch Tubuli auf der Oberfläche des Poly-Lysin-Folien in 100 µL Fix-Lyse Lösung beschichtet.</li>
	<li>Übertragen Sie fünf 20 mm lange seminiferous Röhrchen Segmente auf die vorbereiteten Poly-L-Lysin beschichtetes Glas-Folie mit Fix/Lyse Lösung.</li>
	<li>Mit steriler Schere Hackfleisch seminiferous Röhrchen in 1,5 bis 3,0 mm Segmente.</li>
	<li>Verwendung von sterilen Pinzette die Röhrchen Segmente auf dem Objektträger so anordnen, dass kein Gewebe übergreift, und die Tubuli sind gleichmäßig verteilt. Hinweis: Die optimale Anzahl von Röhrchen Segmente auf einen Glasobjektträger liegt zwischen 20 und 40.</li>
</ol>3. Quetschen von seminiferous Röhrchen
<ol><li>Die Glas-Folie mit verstreuten seminiferous Röhrchen Segmente auf einer Tischplatte zu übertragen. Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit mit einem Labor abwischen zu verlieren Gewebe während der Squash-Schritt.</li>
	<li>Wenden Sie ein Deckglas (22 x 60-1,5 mm) auf den Objektträger und Druck mit der Ferse des Palm für 10-20 Sekunden. Es ist wichtig, genügend Kraft, Spermatozyten von seminiferous Röhrchen zu zerstreuen. Hinweis: Beobachten Sie die Röhrchen mit einem Dissektion Mikroskop um die quetschen Schritt zu optimieren, so dass alle Röhrchen Segmente gestört werden.</li>
	<li>Mit Folie Pinzette, sofort Blitz Einfrieren der Objektträger in einem kleinen Dewar Flüssigkeit N2 für 15 Sekunden, oder bis die Flüssigkeit aufhört zu blubbern. Wenn Immunolabeling umgehend entfernen das Deckglas mit einer geraden Kante Rasierklinge, feine Spitze Zange oder 21-Gauge-Nadel. Hinweis: Um optimale Ergebnisse zu erzielen, Immunolabel Folien sofort (siehe Schritt 4). Jedoch können an dieser Stelle Folien bei-80 ° C bis zu zwei Wochen lang beibehalten werden. Um die Lebensdauer von Proteinen und Zellstrukturen zu maximieren, sofort lagern Sie die Folien auf Trockeneis oder Übertragung auf-80 ° C Gefrierschrank, und das Deckglas auf der Folie. Wenn Immunolabeling Folien gespeichert, entfernen Sie das Deckglas durch Eintauchen der Folien in flüssigen N2 für 15 Sekunden, wie unter Punkt 3.3 beschrieben.</li>
</ol>4. Immunolabeling der berittenen seminiferous Röhrchen
<ol><li>Tauchen Sie die Folie in 1 x PBS und drei Mal für 5 min in ein 50 mL Coplin JAR-Datei mit 1 X PBS waschen. Hinweis: Lassen Sie niemals die Folien zu trocken während der Immunolabeling.</li>
	<li>Gelten Sie 1 mL der Antikörper Verdünnungspuffer auf den Objektträger für 1-2 h in eine feuchte Kammer sperren.</li>
	<li>Entfernen Sie die Antikörper Verdünnungspuffer und 100 µL Primärantikörper in Verdünnungspuffer Antikörper in eine feuchte Kammer verdünnt. Hinweis: Inkubieren Sie für beste Ergebnisse primären Antikörper über Nacht bei 4 ° c Verwenden Sie kleinere Mengen von Antikörpern (z. B. 50 µL) durch die Folie mit einem Deckglas oder Parafilm abdecken. Überprüfen Sie und optimieren Sie Primärantikörper15.</li>
	<li>Spülen Sie Folien drei Mal für 5 min in ein 50 mL Coplin JAR-Datei mit 1 X PBS. Hinweis: Verbessern Waschungen, agitieren Coplin Gläser mithilfe einer kleinen magnetischen Stir Bar und auf einem Teller magnetische Rühren bei niedriger Drehzahl, platzieren oder das Coplin Glas auf eine Tischplatte Mixer bei geringer Geschwindigkeit.</li>
	<li>Wenden Sie 100 µL der Sekundärantikörper in Verdünnungspuffer Antikörper für 1 bis 1,5 h in eine feuchte Kammer bei Raumtemperatur verdünnt an. Inkubieren Sie die Folien in einer dunklen Box Foto Ausbleichen der Fluorophor konjugierten Antikörpern zu vermeiden. Hinweis: Verwenden Sie kleinere Mengen von Antikörpern (z. B. 50 µL) durch die Folie mit einem Deckglas oder Parafilm abdecken.</li>
	<li>Spülen Sie Dias zwei Mal für 5 min in ein 50 mL Coplin JAR-Datei mit 1 X PBS.</li>
	<li>Montieren Sie die Folien in Eindeckmittel mit 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI, 1,5 µg/mL) und wenden Sie Deckgläsern (22 x 60-1,5 mm).</li>
	<li>Versiegeln der Deckgläsern, die Folien mit klaren Nagellack zu bewahren die Folien und verhindern, dass die Deckgläsern bewegt.</li>
</ol>5. Analyse und bildgebenden Röhrchen Squash Vorbereitungen
<ol><li>Verwenden Sie ein Epifluoreszenz-Mikroskop mit automatisierten Bühne, die präzise Bewegung der z-Achse und eine hochauflösende Kamera für Bildaufnahme ermöglicht. Alternativ können Sie einen Laser confocal Mikroskop. Hinweis: Verwenden Sie alle verfügbaren Hardware und Software für diesen Schritt. Beispielsweise wurden in Abbildung 1 und Abbildung 2 angezeigten Bilder mit ein Zeiss Cell Observer Z1 mit einer ORCA-Flash 4.0 CMOS Kamera verknüpft und analysiert mit dem Zeiss ZEN 2012 blau Edition Image-Software erfasst.</li>
	<li>Beurteilen Sie die Folien mit einer 20 X Objektiv zur Bestimmung der Qualität der Squash-Vorbereitung. Gute Qualität Folien haben eine Monolage von Kernen, die gleichmäßig verteilt sind. Hinweis: Einige Bereiche der Folie können besser sein als andere, ist es sinnvoll, beachten die Koordinaten, wo die besten Regionen der Folie zur weiteren Analyse mit stärkerer Vergrößerung gefunden werden kann.</li>
	<li>Verwendung mit höherer Vergrößerung Ziel (z.B. 63 X oder 100 X), Gefangennahme Regionen der Folie eine konsequente Monoschicht der Kerne. Sobald ein Bereich ausgewählt ist, den oberen und unteren Sie Z-Stapel um sicherzustellen, dass alle im Fokus Licht eingefangen wird. Hinweis: Die optimale Anzahl der Z-Stapel gefangen zwischen der oberen und unteren Grenzwert bezeichnet man in der Regel durch die Bild-Datenerfassungs-Software und unterscheidet sich für jedes Ziel.</li>
	<li>Verwenden Sie die Bildverarbeitungs-Software, um eine erweiterte Tiefenbild Fokus zu kompilieren. Die Software verbindet das Licht im Fokus von jedem Z-Stapel und ist wichtig für die optimale Darstellung von Röhrchen Squash Vorbereitungen.</li>
</ol>

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<li>Henriksén, K., Parvinen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stage-specific+apoptosis+of+male+germ+cells+in+the+rat%3A+Mechanisms+of+cell+death+studied+by+supravital+squash+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Cell%22%5BJournal%5D)">Stage-specific apoptosis of male germ cells in the rat: Mechanisms of cell death studied by supravital squash preparations.</a> Tissue Cell. 30 (6), 692-701 (1998).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Mäuse haben sich als nützliche Modellorganismus für die zelluläre Ereignisse, die meiotische Fortschreiten in der Spermatogenese regieren zu studieren. Weiter, es ist notwendig, kümmerten sich um die Untersuchung der Spermatogenese, weil viele Veranstaltungen, wie z. B. Ausstieg aus meiotischen Prophase ich Werkzeuge zu entwickeln, sind sexuell dimorphen. Dieses Protokoll beschreibt eine seminiferous Röhrchen Squash Methode zur Visualisierung und Studium der verschiedenen Phasen der Maus Spermatogenese. Diese Methode zel...

Meiose ist ein komplexes zellulären Ereignis, in dem eine einzelne Runde der DNA-Replikation von zwei aufeinander folgenden Runden der Zellteilung gefolgt. Meiose-spezifische Veranstaltungen müssen während der Anfangsphase der Meiose zu gewährleisten genaue Chromosom Abtrennung koordiniert werden. Diese Ereignisse gehören der Abschluss der homologen Rekombination, Co Ausrichtung der Schwester Kinetochore während die erste meiotische Teilung und der schrittweise Verlust der Cohesin-komplexe, Chiasmata zwischen homologen zu lösen. Präzise Regulation dieser Prozesse ist notwendig, um die Fruchtbarkeit zu erhalten und Chromosom Missegregation Ereignisse zu verhindern, die zu genetischen Entwicklungsstörungen und spontanen Fehlschlag1führen können.
Während die wichtigsten Ereignisse der Meiose in Männchen und Weibchen stattfinden, bestehen erhebliche zeitliche und mechanistische Unterschiede zwischen Spermatogenese und Oogenese2. Zum Beispiel, während der weibliche Meiose, Prophase I tritt während der Embryonalentwicklung und Verhaftungen in der Dictyate-Phase bis zur Pubertät. Im Gegensatz dazu beginnt Spermatogenese um Pubertät und schreitet in Wellen im gesamten Erwachsenenlebens ohne Haftbefehl. Die Unterschiede zwischen männlichen und weiblichen Meiose betont die Notwendigkeit, Methoden zu entwickeln, die speziell zur Beurteilung dieser Prozesse in Spermatozyten und Eizellen gesorgt werden. Derzeit beruht weitgehend meiotic Progression Beurteilung auf der Verwendung von Chromatin breitet sich3,4,5. Während Chromatin breitet sich nützlich für das Studium meiotische Chromosomen sind, Scheitern sie Erhaltung zellulären Integrität, Bewertung von Zellstrukturen wie Spindel Mikrotubuli, Zentrosomen, die Kernhülle und Telomere Anlagen zu verhindern. Live imaging und langfristigen Kultivierung Techniken haben unser Verständnis der weibliche Meiose stark fortgeschritten; ähnliche Konzepte für die gesamte intakten Zelle zu visualisieren sind jedoch weniger häufig für die Untersuchung der Spermatogenese6,7implementiert. Um dynamische Ereignisse in der gesamten männlichen Meiose zu visualisieren, haben wir etablierte Röhrchen Squash Techniken um schnell beurteilen die zytologischen Merkmale entwickeln Maus Spermatozyten8,9angepasst. Die hier beschriebene Methode bewahrt die Integrität der Zelle ermöglicht die Untersuchung von mehreren Zellstrukturen während der verschiedenen Phasen der Spermatogenese.
Diese Röhrchen-Squash-Technik ist eine ganze Zelle Ansatz, der für die Beurteilung der Zellstrukturen durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie ermöglicht. Gemeinsamen histologischen Ansätze zur meiotic Progression bei männlichen Mäusen wie Hämatoxylin und Eosin Färbung von Paraffin eingebettet Hoden und immunofluorescent Kennzeichnung von Cryosections visualisieren ermöglichen einen umfassenden Überblick über die meiotische fortschreiten. Aber nicht diese Techniken, Einzelzellen, soweit dies zur detaillierten Analyse der Ereignisse in der gesamten Meiose10,11zu lösen. Alternative Techniken meiotische Prozesse visualisieren beruhen auf bedeutende chemiosmotischen Unterbrechung der Spermatocyte zu isolieren und beheben von nuklearem Material3,4,5. Diese chemischen Behandlungen behindern die Beobachtung der Zelltypen als primären Spermatozyten. Eine kürzlich beschriebene Methode durch Namekawa ermöglichte die Forschungsgemeinschaft, die nukleare Architektur des isolierten Spermatozyten zu bewahren, aber erfordert den Einsatz von einem Cytospin und Accessoires, die möglicherweise nicht ohne weiteres zur Verfügung stehen einige Labors4. Im Gegensatz dazu erfordert die Röhrchen Squash Technik nur Geräte, die in der Regel standard in den meisten Zelle Biologie Labors.
Die hier beschriebene Röhrchen Squash-Methode lässt sich die unterschiedlichen Zelltypen gefunden innerhalb der seminiferous Röhrchen, einschließlich Sertoli-Zellen, Spermatogonien, primäre und sekundäre Spermatozyten und Spermatids visualisieren. Durch die Kopplung dieser Technik mit der in der Nähe von synchronen erste Welle der Spermatogenese bei jungen Mäusen, ist es möglich, angereicherte Populationen von spermatogenic Zellen zu erhalten, wie sie durch Meiose12 Fortschritte. Dieses Verfahren ermöglicht die detaillierte Analyse der Prozesse innerhalb der gesamten Spermatogenese, wie frühe Prophase Ereignisse, die G2/MI und Metaphase Anaphase Übergänge und Spermiogenesis. Darüber hinaus können Röhrchen Squash Vorbereitungen zur zytologischen Merkmale der Chromosomen (z. B. interchromatid Domains (ICD) und Kinetochore) und Zentrosomen (Centriolen und Pericentriolar Material/Matrizen) zu visualisieren. Die Squash-Methode kann ohne weiteres parallel andere experimentelle Ansätze, wie z.B. Chromatin Spreads und Proteingewinnung durchgeführt werden. Darüber hinaus wurde diese Technik erfolgreich geändert spermatogenic Frischzellen auf Folien für direkte Visualisierung13zu hinterlegen.
Die hier beschriebene Methode beinhaltet eine ganze Zelle seminiferous Röhrchen Squash Technik um den G2/MI Übergang in Wildtyp C57BL/6J Mäuse zu analysieren. Die zytologischen Merkmale des primären Spermatozyten betreten die erste meiotische Teilung wurden mit Immunfluoreszenz-Mikroskopie, beobachten die meiotische Spindel visualisiert. Dieses vielseitige Technik kann leicht geändert werden, um andere meiotische Stufen und verschiedene Zelltypen zu visualisieren. Die Technik ist auch offen für alternative Visualisierung Strategien, wie DNA und RNA Fisch Ansätze.

<table><tbody><tr><td>16% Paraformaldehyd Wässrige</td><td>Elektronenmikroskopie Wissenschaften (EMS)</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>10x</td><td>PBS Qualität Biologisch</td><td>119-069-161</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A1470</td><td></td></tr><tr><td>Pferdeserum</td><td>Sigma</td><td>H-1270</td><td></td></tr><tr><td>35mm x 10mm Petrischale, steril, unbehandelt</td><td>CellTreat</td><td>P886-229638</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysin-beschichtete Objektträger</td><td>Sigma</td><td>P0425-72EA</td><td></td></tr><tr><td>Liquid Blocker</td><td>Pen Elektronenmikroskopie Sciences (EMS)</td><td>71310</td><td></td></tr><tr><td>Humid Box</td><td>Evergreen</td><td>240-9020-Z10</td><td></td></tr><tr><td>Wheaton Coplin Glasfärbeschale für 5 oder 10 Objektträger</td><td>Fisher</td><td>08-813E</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD Antifade-Montage Medium mit DAPI</td><td>Vector Labs</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Cover Slides (22mmx60mm)</td><td>Fisher</td><td>12-544-G</td><td></td></tr><tr><td>Klarer Nagellack</td><td>Amazon</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Microsopes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalognummer </td><td>Comments</td></tr><tr><td>SteREO Discovery.V8</td><td>Zeiss</td><td>495015-0001-000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Observer Z1</td><td>Zeiss</td><td>4109431007994000</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss ZEN 2012 blue edition Bildsoftware</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ORCA-Flash 4.0 CMOS-Kamera</td><td>Hamamatsu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primärantikörper<</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>strong>Name</td><td>Unternehmen</td><td>Katalognummer<</td><td>strong>Comments</td></tr><tr><td>Maus anti-SYCP3</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-74569</td><td>1 von 50</td></tr><tr><td>Kaninchen anti-SYCP3</td><td>Fisher (Novus)</td><td>NB300-231</td><td>1 von 1000</td></tr><tr><td>Ziege anti-SCP3</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-20845</td><td>1 von 50</td></tr><tr><td>Humane Anti-Centromere Protein</td><td>Antikörper Incorporated</td><td>15-235</td><td>1 von 100</td></tr><tr><td>Maus Anti-Alpha-Tubulin</td><td>Sigma</td><td>T9026</td><td>1 zu 1000</td></tr><tr><td>Maus Anti-AIM1</td><td>BD Biosciences</td><td>611082</td><td>1 zu 200</td></tr><tr><td>Maus Anti-& Gamma H2AX</td><td>Thermo Fisher</td><td>MA1-2022</td><td>1 zu 500</td></tr><tr><td>Maus anti-CENT3</td><td>Abnova</td><td>H00001070-M01</td><td>1 zu 200</td></tr><tr><td>Kaninchen anti-pericentrin</td><td>Abcam</td><td>ab4448</td><td>1 zu 200</td></tr><tr><td>Kaninchen anti-REC8</td><td>Mit freundlicher Genehmigung von&nbsp; Dr. Karen Schindler</td><td>N/A</td><td>1 zu 1000</td></tr></tbody></table>

eine seminiferous röhrchen-squash-technik für die zytologische analyse der spermatogenese mit dem maus-modell

A Seminiferous Tubule Squash Technique for the Cytological Analysis of Spermatogenesis Using the Mouse Model

Meiotische Progression bei Männern ist ein Prozess, der die konzertierte Aktion eine Reihe von stark regulierten zelluläre Ereignisse erfordert. Während der Meiose auftretende Fehler können zu Unfruchtbarkeit, Schwangerschaftverlust oder Gendefekte führen. Beginnend mit dem Beginn der Pubertät und während der gesamten Erwachsenenalter, kontinuierliche halbsynchrone Wellen von Spermatozyten Spermatogenese zu unterziehen und letztlich bilden haploide Spermien. Die erste Welle der Maus Spermatozyten unterziehen meiotische Einleitung erscheinen am 10. Tag Post-Partum (10 Dpp) und in das Lumen der seminiferous Röhrchen als reifes Sperma auf 35 Dpp freigesetzt werden. Daher ist es vorteilhaft, Mäuse innerhalb dieser Entwicklungsstörungen Zeitfenster zu nutzen, um hoch angereicherten Populationen von Interesse zu erhalten. Analyse der seltenen Zelle Stadien ist schwieriger bei älteren Mäusen aufgrund des Beitrags von aufeinanderfolgenden spermatogenic Wellen, die die Vielfalt der zellularen Bevölkerungen innerhalb der Tubuli zu erhöhen. Die hier beschriebene Methode ist eine leicht implementierte Technik für die zytologische Auswertung der Zellen innerhalb der seminiferous Röhrchen von Mäusen, einschließlich Spermatogonien, Spermatozyten und Spermatids gefunden. Die Röhrchen Squash Technik bewahrt die Integrität der isolierten männlichen Keimzellen und ermöglicht die Untersuchung der zellulären Strukturen, die mit anderen Techniken nicht einfach visualisiert werden. Um die Anwendungsmöglichkeiten dieser Röhrchen-Squash-Technik zu demonstrieren, wurde Spindel Montage in Spermatozyten voran durch die Prophase, Metaphase, die ich Übergang (G2/MI Übergang) überwacht. Darüber hinaus wurden Centrosome Vervielfältigung, meiotische Geschlechtschromosomen Inaktivierung (MSCI) und Chromosom Blumenstrauß Bildung als Beispiele der zytologischen Strukturen beurteilt, die mit dieser Röhrchen-Squash-Methode beobachtet werden können. Diese Technik kann verwendet werden, um bestimmte Mängel während der Spermatogenese aufzeigen, die durch Mutation oder exogene Störung verursacht werden und trägt somit zum molekularen Verständnis der Spermatogenese.

Hier haben wir die Röhrchen-Squash-Methode verwendet, um vergängliche Zell-Populationen in der Prophase, Metaphase visualisieren ich (G2/MI) Übergang, die angereichert wurden, durch das Ernten von Hoden von juvenile Wildtyp Mäusen durchläuft die erste Welle der Spermatogenese (24 (DPP). Abbildung 1 zeigt repräsentative Bilder von den verschiedenen Phasen der Zelle, die mit den Röhrchen Squash Methode visualisiert werden können. Populationen von Metaphase bere...

Diese Röhrchen-Squash-Technik soll rasch zytologischen Merkmale entwickeln Maus Spermatozyten unter Beibehaltung der zellulären Integrität zu beurteilen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von allen Stufen der Spermatogenese und neben anderen biochemischen und molekularen biologischen Ansätze zur Erforschung der Maus Meiose leicht umgesetzt werden kann.

Eine Seminiferous Röhrchen-Squash-Technik für die zytologische Analyse der Spermatogenese mit dem Maus-Modell

Meiotic progression in males is a process that requires the concerted action of a number of highly regulated cellular events. Errors occurring during ...

Das übergeordnete Ziel dieser Samenkanälchenquetschtechnik ist es, die zytologischen Merkmale von Mausspermatogonien, Spermatozyten und Spermatiden zu visualisieren und gleichzeitig ihre zelluläre Integrität zu erhalten. Für diese Demonstration konzentrieren wir uns auf die Analyse von Spermatozyten, die sich einer Meiose unterziehen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der männlichen Fortpflanzungsbiologie zu beantworten, wie z. B. die Differenzierung von spermatogonialen Stammzellen, die meiotische Chromosomensegregation und die postmeiotische Differenzierung von runden Spermatiden.Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die zelluläre Integrität der männlichen Keimzellen erhalten bleibt, was die Untersuchung von Zellstrukturen ermöglicht, die mit anderen Techniken nicht leicht sichtbar gemacht werden können. Diese Methode kann verwendet werden, um unser Verständnis der väterlichen Ursachen der Unfruchtbarkeit bei jedem Platy zu verbessern. Und es kann auf Säugetiersysteme wie Hoden von Mäusen oder Organspendern angewendet werden.Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, einen guten Kürbis zu machen. Der Einsatz von ausreichend Kraft und die richtige Anordnung der Tubuli sind wichtige Faktoren, um eine gleichmäßige Monoschicht von Zellen zu erzeugen. Für jede Maus, die präpariert werden soll, beladen Sie zwei 35-Millimeter-Petrischale, eine mit drei Millilitern PBS und die andere mit zwei Millilitern frisch hergestellter Fixativ-Lyselösung.Wählen Sie Mäuse aus, die die erste Welle der Spermatogenese durchlaufen, um eine angereicherte Population von Interesse zu beobachten. Nachdem Sie die Maus geopfert haben, reinigen Sie den Bauch mit 70% Alkohol und fahren Sie dann mit der Operation fort. Machen Sie eine V-förmige Öffnung in die Bauchbeckenhöhle und entfernen Sie die Hoden, indem Sie mit einer Pinzette an der Nebenhoden-Fettpolsterung ziehen, ohne jedoch die Tunica albuginea zu stören.Übertragen Sie die Hoden in die Schale, die PBS enthält. Entfernen Sie dort die Hodentunica albuginea, indem Sie das Gewebe mit einer scharfen Pinzette punktieren, und sammeln Sie die losen Samenkanälchen. Übertragen Sie dann die Tubuli in die Schale mit Fixativ Lysis Solution und lassen Sie die Reaktion fünf Minuten lang bei Raumtemperatur ablaufen.Während der Inkubation bereiten Sie einen mit Poly-L-Lysin beschichteten Objektträger vor, indem Sie die Ränder des Objektträgers mit einem Flüssigblockerstift umrandeten und dann den Objektträger innerhalb der Ränder mit 100 Mikrolitern Fixative Lysis Lösung füllen. Nach der fünfminütigen Inkubation werden die Samenkanälchen mit einer sterilen Pinzette und einer Schere vorsichtig auseinander gekitzelt und geschnitten, so dass 20 Millimeter große Einzelsegmente entstehen. Übertragen Sie anschließend fünf 20-Millimeter-Tubulussegmente auf den vorbereiteten Objektträger.Dann zerkleinern Sie die Segmente weiter mit einer Schere in 1,5 bis drei Millimeter Länge. Ordnen Sie nun mit der Pinzette die Segmente so an, dass sie sich nicht überlappen. Verteilen Sie sie gleichmäßig auf der Folie.Im Idealfall nehmen 20 bis 40 kurze Längen eine Rutsche ein. Beginnen Sie damit, überschüssige Flüssigkeit auf der Objektträgervorbereitung mit einem saugfähigen Tuch zu entfernen. Tragen Sie nun einen Deckslip auf und drücken Sie die Tubuli mit dem Druck der Handballen 10 bis 20 Sekunden lang zusammen.Ziel ist es, genügend Kraft aufzubringen, um die Spermatozyten aus den Samenkanälchen zu dispergieren. Überprüfen Sie mit einem Präpariermikroskop, ob die Segmente durch den Kürbis unterbrochen wurden. Gießen Sie dann etwas flüssigen Stickstoff in einen kleinen Dewar und frieren Sie den Objektträger 15 Sekunden lang schockfrosten oder bis die Flüssigkeit aufhört zu sprudeln.Um mit dem Amino-Blotting fortzufahren, entfernen Sie sofort den Deckglas mit einer scharfen Spitze oder Kante. Obwohl nicht ideal, können gefrorene Objektträger sofort bei minus 80 Grad Celsius konserviert und bis zu zwei Wochen aufbewahrt werden. Um das Deckglas später zu entfernen, tauchen Sie die Objektträger 15 Sekunden lang in flüssigen Stickstoff und hebeln Sie das Deckglas ab.Um mit der Aminomarkierung fortzufahren, waschen Sie die Objektträger dreimal fünf Minuten lang pro Waschgang in PBS mit einem 50-Milliliter-Coplin-Glas. Tragen Sie nach den Waschungen einen Milliliter Antikörperverdünnungspuffer auf jeden Objektträger auf, der als Block dient. Lassen Sie die Blockreaktion ein bis zwei Stunden in einer befeuchteten Kammer laufen.Lassen Sie die Objektträger während dieses Vorgangs niemals austrocknen. Klopfen Sie dann die Objektträger auf ein Papiertuch, um den Puffer vorsichtig zu entfernen und sie wieder in die befeuchtete Kammer zu legen. Tragen Sie dann 100 Mikroliter verdünnten Primärantikörper auf jeden Objektträger auf und übertragen Sie sie auf 40 Grad Celsius, wo die Bindungsreaktion über Nacht ablaufen kann.Wenn die Antikörperlösung knapp ist, kann die Hälfte des Volumens verwendet werden, wenn sie mit einem Deckglas oder Parafilm abgedeckt wird. Verwenden Sie am nächsten Tag drei Waschgänge in PBS, um den primären Antikörper zu entfernen. Tragen Sie anschließend 100 Mikroliter verdünnten Sekundärantikörper auf und lassen Sie diese Reaktion ein bis eineinhalb Stunden bei Raumtemperatur ablaufen.Um Photobleichen zu vermeiden, bewahren Sie die Objektträger während dieser Inkubation in einer dunklen, befeuchteten Kammer auf. Waschen Sie anschließend die Objektträger zweimal mit PBS. Punktieren Sie nun die Folien mit einem Montagemedium, das DAPI enthält.Versiegeln Sie dann die Deckgläser mit Nagellack und fahren Sie mit der Bildgebung fort. Verwenden Sie zum Aufnehmen von Bildern ein Epifluoreszenzmikroskop mit einem automatisierten Tisch, der eine präzise Bewegung der Z-Achse ermöglicht. Verwenden Sie auch eine hochauflösende Kamera, um Bilder aufzunehmen.Bewerten Sie nun die Folien mit einem 20-fach-Objektiv. Bestimme die Qualität der Kürbiszubereitung. Ein qualitativ hochwertiger Kürbis hat eine Monoschicht von Kernen, die gleichmäßig verteilt sind.Einige Regionen des Kürbisses können besser sein als andere. Notieren Sie sich die Koordinaten der besten Regionen, um sie bei höherer Vergrößerung leicht zu finden. Erhöhen Sie nun die Vergrößerung auf bis zu 100x.Nehmen Sie dann Bilder von bekannten Regionen auf, die eine konsistente Monoschicht von Kernen aufweisen. Legen Sie die obere und untere Z-Stapel fest, um sicherzustellen, dass das gesamte fokussierte Licht erfasst wird. Die optimale Anzahl von Z-Stapeln wird in der Regel von der Bilderfassungssoftware festgelegt und ist für jedes Objektiv unterschiedlich.Kompilieren Sie aus den Bildern mit Hilfe einer Verarbeitungssoftware ein Bild mit erweiterter Tiefe. Die Software kombiniert das fokussierte Licht jedes Z-Stapels, was für eine optimale Bildgebung von Tubuluskürbispräparationen unerlässlich ist. Mit der beschriebenen Tubulus-Squash-Methode wurden transitorische Zellpopulationen sichtbar, die den Übergang von der Prophase zur Metaphase 1 durchlaufen.Angereicherte Populationen von Metaphase-1-Spermatozyten wurden unter Verwendung der Antikörper gegen Alpha-Tubulin sichtbar gemacht. Um die Zellen in der ersten Prophase sichtbar zu machen, wurden Tubuluskürbispräparate mit einem Antikörper gegen das Synaptonemale Complex Protein 3 immunmarkiert. Leptoten-, Zygoten- und Pachytendiploten-inszenierte Spermatozyten wurden beide identifiziert.Antikörper gegen die Zellzykluskinase Aurora B wurden verwendet, um spätere Ereignisse der Meiose eins sichtbar zu machen. Diese Kinase lokalisiert während der Metaphase am inneren Zentromer, relokalisiert dann während der Anaphase in die mittlere Zone der Spindel und schließlich während der Zytokinese in die Spaltfurche. Durch die Aufrechterhaltung der zellulären Integrität ermöglicht die Tubulus-Squash-Technik die Visualisierung der subzellulären Organisation in Strukturen, die mit der ersten Prophase assoziiert sind.Die Dynamik des Chromosomenbouquets kann bis zur ersten Phase verfolgt werden. Die Zentriolduplikation in der Zentrosomdisjunktion kann ebenfalls sichtbar gemacht werden. Im frühen Diplotenstadium wurden Spermatozyten, die nach Zentriolduplikation eine Zentrosomdisjunktion durchliefen, mit Antikörpern gegen Pericentrin, einer Proteinkomponente der perizentriolären Matrix, und Antikörpern gegen Centrin-3 zur Markierung von Zentriolen visualisiert.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die zytologischen Merkmale der Entwicklung von Mausspermatozyten schnell beurteilen und gleichzeitig die zelluläre Integrität bewahren können. Einmal gemeistert, kann das Sezieren durch Zerquetschen in weniger als einer Stunde pro Maus durchgeführt werden. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, genügend Kraft aufzuwenden, um die Spermatozyten aus den Samenkanälchen zu verteilen.Darüber hinaus können die Fixiermittelkonzentration und die Inkubationszeit in Abhängigkeit von der zu untersuchenden Zellstruktur optimiert werden. Alternative Visualisierungsstrategien, wie z.B. DNA- und RNA-Fischansätze, lassen sich mit dieser Technik leicht umsetzen. Durch die Ergänzung von Tubulusquetschen mit nachgeschalteten biochemischen Assays ist es möglich, die mechanistischen Determinanten einer erfolgreichen meiotischen Progression zu bewerten.

a-seminiferous-tubule-squash-technique-for-cytological-analysis

Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Protokolle für die Keimzelle der Transplantation und Hodengewebe Xenografting werden beschrieben. Germ-Transplantation führt zu Donor-derived Spermatogenese in den Empfängerländern Hoden und eine funktionelle Rekonstitution Assay für die Identifizierung von Spermatogonien-Stammzellen (SSC). Hodengewebe Xenografting reproduziert Hodenentwicklung und Spermatogenese verschiedener Spender Arten in Empfängermäuse.

Germ Cell Transplantation und Hodengewebe in Mäusen Xenografting

Dieses Video zeigt die Isolierung von Sertoli-Zellen aus Samenkanälchen der Maus, einer Komponente der Hoden. Enzymatischer Verdau und wiederholtes Waschen fördern die Freisetzung von Sertoli-Zellen in die Lösung, die zur Proliferation und zum Wachstum weiter kultiviert werden kann.

Isolierung immunregulatorischer Sertoli-Zellen aus Samenmagentubuli der Maus

Verfahren zur Isolierung und Herstellung von Drosophila Hoden Proben (leben und fest) für die Bildgebung durch Phasenkontrast-und Fluoreszenzmikroskopie sind hierin beschrieben.

Die zytologische Analyse der Spermatogenese: Live-und Fest Zubereitungen aus<em&gt; Drosophila</em&gt; Hoden

Wir beschreiben eine Sortierstrategie für Mausspermatiden mittels Durchflusszytometrie. Die Spermatiden werden in vier hochreine Populationen eingeteilt, darunter runde (Spermiogenese-Schritte 1-9), früh-elongierende (Spermiogenese-Schritte 10-12), spät-elongierende (Spermiogenese-Schritte 13-14) und längliche Spermatiden (Spermiogenese-Schritte 15-16). DNA-Färbung, Größe und Granulosität werden als Selektionsparameter verwendet.

Schritt spezifische Sortierung der Maus Spermatiden durch Durchflusszytometrie

Meiose ist der Entwicklungsprozess durch den Gameten durch eine einzelne Runde der DNA-Replikation und zwei aufeinanderfolgenden Runden Chromosom Segregation gebildet werden. Säugetier-Meiose kann untersucht werden, durch die Verwendung einer Technik um meiotische Chromosomen breitet sich vorzubereiten. Hier zeigen wir einen Weg der Vorbereitung der Oberfläche verbreitet Kerne aus Maus Spermatozyten.

Vorbereitung der meiotischen Chromosom erstreckt sich von Maus Spermatozyten

Sperma-Verflüssigung ist erforderlich für das Sperma aus dem bahnbrechenden Gel befreit zu werden. Diese Studie liefert die Verfahren für das Sammeln von Samen aus dem weiblichen Genitaltrakt Post-Beischlaf und Sperma Verflüssigung Messzeit.

Sammlung von Post-Paarung Sperma aus der weiblichen Fortpflanzungsorgane und Messung von Sperma Verflüssigung bei Mäusen

Präsentiert hier ist ein Protokoll zur Anreicherung von Pachyten-Spermatozyten, runden Spermaatien und lästigen Spermaatiden aus erwachsenen Maushoden mit einem diskontinuierlichen Rinderserum-Albumin-Dichtegradienten mit Standard-Laborgeräten.

Anreicherung von Pachyten-Spermatozyten und Spermatien aus Maushoden mit Standard-Laborgeräten

Hier präsentieren wir eine einfache und effiziente Methode, um lebende meiotische und postmeiotische Keimzellen von erwachsenen Maushoden zu isolieren. Mit einem zytotoxischen, violett-erregten DNA-Bindungsfarbstoff und fluoreszenzaktivierter Zellsortierung kann man hoch angereicherte spermatogene Zellpopulationen für viele nachgelagerte Anwendungen isolieren.

Isolierung von murinen Spermatogenic Cells mit einem violett-erregten Zellpermeable DNA Binding Dye

Dieses Protokoll beschreibt die transilluminationsunterstützte Mikrodissektion von Segmenten von erwachsenen Mausseminiferous Tubuli, die bestimmte Stadien des seminiferen Epithelzyklus darstellen, und Zelltypen darin und anschließende Immunostainierung von Squashpräparaten und intakten Tubulisegmenten.

Transillumination-Assisted Dissection of Specific Stages of the Mouse Seminiferous Epithelial Cycle for Downstream Immunostaining Analyses

Dieser Artikel berichtet über eine in vivo Hemmung von CENP-E durch abdominale Chirurgie und Hodeninjektion von GSK923295, einem wertvollen Modell für die männliche meiotische Teilung. Mit Hilfe der Immunfluoreszenz-, Durchflusszytometrie- und Transmissionselektronenmikroskopie-Assays zeigen wir, dass die CENP-E-Hemmung zu Chromosomenfehlstellungen und Genominstabilität in Mausspermatozyten führt.

Funktionelle Bewertung von Kinesin-7 CENP-E in Spermatozyten mittels In-vivo-Inhibition , Immunfluoreszenz und Durchflusszytometrie

Hier stellen wir eine Methode zur Durchführung der runden Spermatideninjektion (ROSI) bei Mäusen vor, eine Technik mit vielversprechenden klinischen Anwendungen und Nutzen für die Untersuchung der Mechanismen, die der Embryonalentwicklung zugrunde liegen.

Runde Maus-Spermatiden-Injektion

Lernen Sie die Seminiferous-Tubulus-Squash-Technik zur zytologischen Analyse der Spermatogenese bei Mäusen. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung von Spermatozyten während der Meiose unter Erhaltung der Zellintegrität.

Eine Seminiferous Röhrchen-Squash-Technik für die zytologische Analyse der Spermatogenese mit dem Maus-Modell

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