Name: Ein einfacher Ansatz, experimentelle Autoimmune Neuritis bei C57BL/6 Mäusen für funktionale und neuropathologische Bewertungen zu induzieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie experimentelle Autoimmune Neuritis bei C57BL/6-Mäusen induzieren, um periphere Neuropathie funktionell und neuropathologisch zu untersuchen. Dieses Protokoll ermöglicht die Bewertung neuer Therapeutika.

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DGG ist NHMRC Peter Doherty und Multiplesklerose Forschung Australien (MSRA) frühe Karriere Fellow. JLF wird unterstützt durch eine MSRA Postdoctoral Fellowship. Diese Arbeit wurde unterstützt durch die Australian National Health und Medical Research Council (NHMRC) Projekt #APP1058647 gewähren, JX.

alle hier beschriebene Verfahren wurden von Florey Instituts für Neurowissenschaften und psychische Gesundheit (Melbourne Brain Zentrum)-Tier-Ethik-Kommission genehmigt und folgen Sie der australischen Code of Practice für die Verwendung von Tieren für wissenschaftliche Zwecke.
 1. EAN Induktion Hinweis: EAN bei männlichen C57BL/6 Mäusen im Alter zwischen 6-8 Wochen erfolgreich induziert werden kann. Die Induktion-Protokoll dauert insgesamt 9 Tage. Tag 0 bezieht sich auf den Tag der ersten Immunisierung. Für dieses Protokoll Injektionen wurden unter Narkose durchgeführt (siehe Schritt unten 1.1.2).
<ol><li>Am Tag-1: <ol><li>bereiten das Pertussis-Toxin (siehe Tabelle der Materialien) Lösung von 1,6 µg/mL mit der sterilen 0,1 M Maus-isotonische Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (MT-PBS).</li>
		<li>Anesthetization mit Isofluran: <ol>, <li>platzieren Sie den Mauszeiger (C57BL/6, Männlich, 6-8 Wochen) in der Anesthetization Kammer und passen Sie die Sauerstoffzufuhr auf 1 L/min</li>
			<li>Schalten Sie den Verdampfer Isoflurane, passen Sie es auf 2,5 % für Anesthetization, und den Monitor atmen und warten Sie 2 Minuten, oder bis primäre Reflexe (Hornhaut und hinteren Gliedmaßen) reagieren nicht mehr</li></ol>
		</li> <li>Entfernen Sie die Maus aus der Kammer Anesthetization und verwalten die obige Pertussis-Toxin-Lösung über eine intraperitoneale (i.p.) Injektion mit einer 0,5 mL Spritze mit einer Nadel 30 1/2 G 250 µL.</li>
		<li>Immunisierung der injizierbare Inokulum vorbereiten: <ol><li>Prepare Lösung A mit 2 mg/mL Lösung von P0 180-199 Peptid (mit &#62; 98 % Reinheit, Sequenz S-S-K-R-G-R-Q-T-P-V-L-Y-A-M-L-D-H-S-R-S) in 0,9 % Kochsalzlösung.</li>
			<li>Vorbereitung Lösung B mit 20 mg/mL Lösung von Mycobacterium Tuberculosis (siehe Tabelle der Materialien) in Freund &#39; s komplettes Adjuvans (FCA, bestehend aus: 15 % Mannide Monoolate + 85 % Paraffinöl und 0,5 mg/mL der ausgetrocknete getötet und getrockneten M Mycobacterium Butyricum).</li>
			<li>Zu das endgültige Inokulum zum Einspritzen, gleiches Volumen Teile Lösungen A und B in einem Wulst Schläger kombinieren und mischen Sie sie mit einer maximalen Geschwindigkeit für 1 min bei Raumtemperatur. 
			Hinweis: Lösungen A und B können als Lager gehalten und bei 4 ° C für maximal einen Monat gelagert, sondern das kombinierte endgültige Inokulum muss frisch zubereitet werden, am Tag der Injektion Maus.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>An Tag 0, verwalten 50 µL des Inokulums (Vorbereitung in Schritt 1.1.4 beschrieben) in eine Maus über eine subkutane Injektion mit einer Nadel 23 G. 
	Hinweis: Die Injektion kann platziert werden zwischen den Schulterblättern oder zwischen den hinteren Gliedmaßen und Rute über die Caudale Dorsum.</li>
	<li>On Tag1 machen die Pertussis-Toxin-Lösung von 1,2 µg/mL (in MT-PBS) und verwalten 250 µL in eine Maus über i.p.-Injektion mit einer 0,5 mL Spritze mit einer Nadel 30 1/2 G.</li>
	<li>Am 3. Tag, wiederholen Sie Schritt 1.3 oben. 
	Hinweis: Lager-Lösungen A und B können aus und bei 4 ° c für maximal einen Monat gelagert werden. Allerdings muss das letzte injizierbare Inokulum, produziert durch die Kombination von Stammlösungen A und B, am Tag der Injektion erfolgen.</li>
	<li>Am 8. Tag verwalten 50 µL des Inokulums (Vorbereitung in Schritt 1.1.4 beschrieben) in eine Maus über eine subkutane Injektion (siehe Schritt 1.2 oben), an der gleichen Einstichstelle wie in Schritt 1.2 (für jedes Tier)</li></ol>
 2. klinische Bewertung <ol><li>durchführen, klinische Bewertung, täglich ab am Tag 0.</li>
	<li>Geben jedem Mausklick eine Punktzahl von 0, 1, 2, 3 oder 4 nach den veröffentlichten Kriterien 4. Siehe Tabelle 1 für die EAN klinische Wertung. 
	Hinweis: aus Gründen der Kohärenz eine Anstrengungen unternommen werden sollten Mäuse gleichzeitig Tor täglich von der gleichen Forscher.</li>
</ol> 3. Motor-Funktion Bewertung Hinweis: die Motorleistung wird parallel mit klinischen erzielte bei der gleichen Altersgruppe Tiere bewertet. Der motorischen Funktion Bewertung Apparat muss an einen Computer angeschlossen werden, dass ein Gang-Funktion-imaging-System (siehe Tabelle der Materialien) installiert hat. Es wird auch empfohlen, dass alle Mäuse zu beurteilenden an die ausgeführte Aufgabe vor EAN Induktion gewöhnt werden sollten. Zu diesem Zweck werden Praxis läuft (2 Testläufe per Mausklick) drei Tage vor der Krankheit Induktion (Tag-3) durchgeführt.
<ol><li>Zug auf das motorische Funktion Bewertung Gerät und schalten Sie die Lichttaste.</li>
	<li>Genick der Maus fest und Tinte seine Füße durch Absenken auf einen Behälter, gefüllt mit roter Tinte gedrückter Schwanzspitze. 
	Hinweis: Dieser Schritt ist erforderlich für die C57BL/6-Belastung, aber kann übersprungen werden, wenn eine Maus-Sorte mit einem weißen Fellfarbe verwendet wird.</li>
	<li>Platzieren Sie den Mauszeiger in das Fach zu Fuß und stellen Sie die Laufband Geschwindigkeit 15 cm/s.</li>
	<li>Schalten Sie das Laufband und klicken Sie auf die &#34; Rekord &#34;-Taste, um die laufende Bewegung der Maus über die Gangart Funktion imaging-System zu erfassen (siehe Tabelle der Materialien).</li>
	<li>Verwenden Sie einen Zeitgeber und messen jedes Rennen um 36 s. Nach 36 s, Aufnahme beenden und Stop der Tretmühle. 
	Hinweis: Mäuse, die erfolgreich ausgeführte Aufgabe für dieses 36 s-Intervall können nicht gelten als gescheitert zu sein.</li>
	<li>Speichern die video-Datei im Ordner "benannten".</li>
	<li>Wiederholen Sie die oben genannten Schritte für jede Maus beurteilt werden. Testen Sie die Mäuse mit der gleichen ausgeführte Aufgabe alle 3 Tage.</li>
	<li>Analysieren die bearbeiteten video-Dateien mit Software für Gang Funktionsparameter (siehe Tabelle der Materialien). 
	Hinweis: Die Details der Analyse verschiedener Motorparameter variieren unter Software also entnehmen Sie bitte den Hersteller &#39; s Anweisung vor der Analyse. Histologischen Nachweis der axonalen zu gewinnen und Myelinschäden entweder über Immunohistochemistry oder Elektronenmikroskopie, Tier Gewebe zu den Phase Motorik Abschlusstest je nach den spezifischen Zielen der Forschung eingenommen werden können.</li>
</ol>

<ol><li>Newswanger, D. L., Warren, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guillain-Barre+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Am+Fam+Physician%22%5BJournal%5D)">Guillain-Barre syndrome.</a> Am Fam Physician. 69 (10), 2405-2410 (2004).</li>
<li>Ruiz, E., Ramalle-Gomara, E., Quinones, C., Martinez-Ochoa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trends+in+Guillain-Barre+syndrome+mortality+in+Spain+from+1999+to+2013%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Trends in Guillain-Barre syndrome mortality in Spain from 1999 to 2013.</a> Int J Neurosci. 126 (11), 985-988 (2016).</li>
<li>Walling, A. D., Dickson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guillain-Barre+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Am+Fam+Physician%22%5BJournal%5D)">Guillain-Barre syndrome.</a> Am Fam Physician. 87 (3), 191-197 (2013).</li>
<li>Gonsalvez, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Functional+and+Neuropathological+Testing+Paradigm+Reveals+New+Disability-Based+Parameters+and+Histological+Features+for+P0180-199-Induced+Experimental+Autoimmune+Neuritis+in+C57BL%2F6+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">A Functional and Neuropathological Testing Paradigm Reveals New Disability-Based Parameters and Histological Features for P0180-199-Induced Experimental Autoimmune Neuritis in C57BL/6 Mice.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 76 (2), 89-100 (2017).</li>
<li>Berg, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guillain-Barre+syndrome%3A+pathogenesis%2C+diagnosis%2C+treatment+and+prognosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurol%22%5BJournal%5D)">Guillain-Barre syndrome: pathogenesis, diagnosis, treatment and prognosis.</a> Nat Rev Neurol. 10 (8), 469-482 (2014).</li>
<li>Koller, H., Schroeter, M., Kieseier, B. C., Hartung, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+inflammatory+demyelinating+polyneuropathy--update+on+pathogenesis%2C+diagnostic+criteria+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurol%22%5BJournal%5D)">Chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy--update on pathogenesis, diagnostic criteria and therapy.</a> Curr Opin Neurol. 18 (3), 273-278 (2005).</li>
<li>Griffin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathology+of+the+motor-sensory+axonal+Guillain-Barre+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Pathology of the motor-sensory axonal Guillain-Barre syndrome.</a> Ann Neurol. 39 (1), 17-28 (1996).</li>
<li>Taylor, W. A., Hughes, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+allergic+neuritis+induced+in+SJL+mice+by+bovine+P2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Experimental allergic neuritis induced in SJL mice by bovine P2.</a> J Neuroimmunol. 8 (2-3), 153-157 (1985).</li>
<li>Zou, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P0+protein+peptide+180-199+together+with+pertussis+toxin+induces+experimental+autoimmune+neuritis+in+resistant+C57BL%2F6+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">P0 protein peptide 180-199 together with pertussis toxin induces experimental autoimmune neuritis in resistant C57BL/6 mice.</a> J Neurosci Res. 62 (5), 717-721 (2000).</li>
<li>Miletic, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P0%28106-125%29+is+a+neuritogenic+epitope+of+the+peripheral+myelin+protein+P0+and+induces+autoimmune+neuritis+in+C57BL%2F6+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">P0(106-125) is a neuritogenic epitope of the peripheral myelin protein P0 and induces autoimmune neuritis in C57BL/6 mice.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 64 (1), 66-73 (2005).</li>
<li>Hafer-Macko, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+motor+axonal+neuropathy%3A+an+antibody-mediated+attack+on+axolemma%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Acute motor axonal neuropathy: an antibody-mediated attack on axolemma.</a> Ann Neurol. 40 (4), 635-644 (1996).</li>
<li>Griffin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+nodal+changes+in+the+acute+motor+axonal+neuropathy+pattern+of+the+Guillain-Barre+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurocytol%22%5BJournal%5D)">Early nodal changes in the acute motor axonal neuropathy pattern of the Guillain-Barre syndrome.</a> J Neurocytol. 25 (1), 33-51 (1996).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte in Bezug auf diese Arbeit.

Dieser Bericht beschreibt eine einfache Methode um EAN verwendet P0180-199 Peptid bei C57BL/6 Mäusen, so dass die Quantifizierung der wichtigsten neuropathologische und funktionelle Defizite bei Mäusen mit EAN induziert induzieren. DISTINCT zu dem hier beschriebenen EAN Induktion-Protokoll ist die Verwendung der Anästhesie während der Durchführung der Impfung-Injektionen. Die Verwendung von Isofluran-Narkose verbessert erheblich die Möglichkeit, sicherzustellen, dass das Gesamtvolumen des Inokulums an der gewü...

Periphere Neuropathien kann entweder genetisch bedingt oder erworben, mit erworbenen Neuropathien haben entweder metabolische, ischämische, entzündliche oder giftige Fällungsmitteln. Diese Krankheiten sind auch sinnvoll als axonalen oder demyelinative Ursprungs eingestuft. Die häufigsten erworbenen demyelinisierenden periphere Neuropathien akuten entzündlichen demyelinisierenden Polyneuropathie (AIDP sind, auch bekannt als Guillain-Barré-Syndrom, GBS) und chronisch entzündlichen demyelinisierenden Polyneuropathie (CIDP)1, 2 , 3 , 4; Beide zeichnen sich pathogenetisch durch eine Autoimmunreaktion gegen die Myelinscheide, Demyelinisierung peripherer Nerven verursacht. Bei diesen Erkrankungen aktivierte T-Zellen der Blut-Nerven-Schranke und generieren eine Immunreaktion in der PNS. Aktivierung von Makrophagen innerhalb der Nerv dann verursacht Demyelinisierung entweder direkt über phagocytic Angriff, oder indirekt über freigesetzten Entzündungsmediatoren, was in klinischen Behinderungen wie Lähmungen und sensorische Dysfunktion5. Während demyelinated Axone die Fähigkeit behalten, Remyelinated nach Demyelinisierung, Remyelinisierung ist oft verzögert oder unvollständig, wodurch Anfälligkeit der nackten Axone zu irreversiblen Schäden, das ist die wesentliche Ursache für dauerhafte klinischen Behinderung. Derzeit wirksamsten Behandlungen sind immunmodulatorische, aber trotz ihrer Wirksamkeit in vielen Fällen die Erholung ist oft langsam und ~ 25 % der Patienten erleben residual funktionelle Defizite, die ihre Lebensqualität6deutlich zu reduzieren, 7.
EAN ist eine weit verbreitete Tiermodell der demyelinisierenden peripheren Neuropathie, der wertvolle Einblicke in die Pathogenese und ein Mittel zur Beurteilung neuartiger Therapeutika4zur Verfügung gestellt hat. Dieses Modell induziert werden kann in verschiedenen Arten wie Kaninchen, Ratten, Mäuse und Meerschweinchen, und wird durch Immunisierung mit neurogenen Antigene induziert. Hängt jedoch letztlich die erfolgreiche EAN Induktion eine entsprechende Immunantwort für Krankheit auftreten. Angesichts der Arten (und inter-Arten/Stamm) Variationen in Funktion des Immunsystems, wurden mehrere Kombinationen von Antigenen und Hilfsstoffe entwickelt, um erfolgreich EAN induzieren. In Bezug auf murinen genetische Werkzeuge ist der C57BL/6 die am weitesten verbreitete; Das traditionelle P2 Protein Peptid 57-81 (P257-81), die Krankheit in der anfälligen SJL Maus Belastung8 führt ist jedoch nicht in der Lage zu unerlaubten Pathogenese, funktionelle Defizite in der C57BL/6-Belastung führen. Glücklicherweise, Sensibilisierung Paradigmen mit P0106-125 oder P0180-199 Peptide, geliefert in adjuvante kombiniert mit der Injektion von Keuchhusten Toxin bewältigt diese Barriere, so dass genetische Spezialtools in genutzt werden die EAN Mausmodell.
Hier ist eine einfache Methode für die Induktion von EAN in den Mäusen C57BL/6 vorgestellt. Darüber hinaus erfolgt eine detaillierte Gesamtkonzept, um die funktionelle und neuropathologische Defizite, die mit der Krankheit assoziiert zu bewerten. Die P0180–199 Peptid9 wurde anstelle der P057-81 alternative10gewählt. Das P0180–199 Modell produzieren weniger schwere klinische Symptome im Vergleich zu den P057-81 alternative10beschrieben worden und dürfte daher die Einführung von potenziell zu widerstehen schädliche genetische Störungen, von chirurgischen Eingriffen (z. B. osmotischen Pumpe Implantation) erholen und Laufband Gangart Funktionsprüfung4zugänglich ist. Jedoch konnte das Laufband Gangart Funktionstests und histologischen Protokolle hier beschriebenen leicht angewendet werden, wenn die Krankheit in einer P057-81 induzierte Variante zu studieren.

<table><tbody><tr><td>C57BL/6, männlich, 6-8 Wochen alt</td><td>Australian Bioresources Cenre, WA, Australien</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pertussis-Toxin-Liste</td><td>Biological Laboratories, Inc., CA, USA</td><td>#181</td><td></td></tr><tr><td>0,1 M Maus-isotonische phosphatierte gepufferte Kochsalzlösung (MT-PBS)</td><td></td><td></td><td>Die Laboratorien haben ihr eigenes Protokoll.</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Pharmachem, QLD, Australia</td><td></td><td>Laboratories wird über ein eigenes Protokoll für die Verabreichung verfügen.</td></tr><tr><td>P0180&ndash; 199 Peptid</td><td>Wuxi Nordisk Biotech Co. Lt. SHG, CHN</td><td></td><td>P0180&ndash; 199, Sequenz S&ndash; S&ndash; K&ndash; R&ndash; G&ndash; R&ndash; Fragen und Fragen; T&ndash; P&ndash; V&ndash; L&ndash; Y&ndash; A&ndash; M&ndash; L&ndash; D&ndash; H&ndash; S&ndash; R&ndash; S</td></tr><tr><td>Hitze tötete Mycobacterium tuberculosis (Stamm H37RA)</td><td>Difco, MI, USA</td><td>#231141</td><td></td></tr><tr><td>Freund's vollständiges Adjuvans (FCA)</td><td>Difco, MI, USA</td><td>#263910</td><td></td></tr><tr><td>16 % Paraformaldehyd (PFA)</td><td>Elektronenmikroskopische Dienstleistungen</td><td>#15710</td><td>Verdünnen auf 4 % PFA am Tag der Gewebeentnahme.</td></tr><tr><td>25% Glutaraldheyd</td><td>ProSciTech Pty Ltd, QLD, Australien</td><td>#11-30-8</td><td>Verdünnen auf 2,5% Glutaraldehyd am Tag der Fixierung.</td></tr><tr><td>Natriumazid</td><td>Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australien</td><td>SL189</td><td>Schaffung eines Lagerbestands von 10% (w/v) in 0,1 MIO. MT-PBS. Bei 0,03 % (v/v) verwenden.</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australien</td><td>SA030</td><td>Verwendung bei 30 % (w/v).</td></tr><tr><td>Optimale Schnitttemperatur (OKT) mittel</td><td>Sakura Finetek, CA, USA</td><td>#4583</td><td></td></tr><tr><td>Normales Eselsserum</td><td>Merck Millipore, MA, USA</td><td>#S30-100</td><td>Verwendung als Antikörperverdünnungsmittel bei 10% (v/v) oder einer anderen Konzentration, die durch ein eigenes Labor bestimmt wurde.</td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma Aldrich, MI, USA</td><td>#90o2-31-1</td><td>Verwendung in Antikörperverdünnungsmitteln bei 0,3 % (v/v) oder einer anderen Konzentration, die durch ein eigenes Labor bestimmt wurde.</td></tr><tr><td>Kaninchen-Anti-Amyloid-Vorläuferprotein (APP)</td><td>Invitrogen (Life Technologies), CA, USA</td><td>S12700</td><td>Wird bei 1:400 verwendet oder titriert im eigenen Labor.</td></tr><tr><td>Kaninchen Anti-Contactin-assoziiertes Protein-1 (Caspr)</td><td>Geschenk von Prof. Elior Peles, Wiezmann Institute of Science, Israel</td><td></td><td>Verwendet bei 1:500 oder titriert im eigenen Labor.</td></tr><tr><td>Geeignete Alexa Fluor konjugierte Sekundärantikörper</td><td>Molekulare Sonden (Life Technologies), OR, USA</td><td>Verschiedene</td><td>Verwendung bei 1:200 oder titrieren im eigenen Labor. Die Wahl der Spezies, in der der Antikörper gezüchtet wurde, und der Wahl von Alexa Fluor liegt im Ermessen des jeweiligen Labors.</td></tr><tr><td>Wässrige Einbettlösung</td><td>Dako (Agilent), CA, USA</td><td></td>#S3023 <td>Jedes Labor hat seine eigenen Vorlieben.</td></tr><tr><td>Name</td><td>Unternehmen</td><td><>Katalognummer<</td><td>strong>Kommentare<</td></tr><tr><td>strong>Ausrüstung0,5</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>mL Spritze mit 301/2 g Nadeln</td><td>BD</td><td>#326105</td><td></td></tr><tr><td>23 g Nadeln</td><td>BD</td><td>#305143</td><td></td></tr><tr><td>Rotes Stempelkissen</td><td></td><td></td><td>Jedes rote Stempelkissen oder jede rote Lebensmittelfarbe kann verwendet werden, um die Füße der Tiere zu markieren.</td></tr><tr><td>DigiGate-Geräte (einschließlich Laufband)</td><td>eMouse Specifics Inc. Framingham, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DigiGate Imaging System</td><td>eMouse Specifics Inc. Framingham, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stoppuhr</td><td></td><td></td><td>Es kann ein beliebiger Timer verwendet werden.</td></tr><tr><td>DigiGait 8 Software</td><td>eMouse Specifics Inc. Framingham, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Präpariermikroskop</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Es kann jedes geeignete Präpariermikroskop verwendet werden.</td></tr><tr><td>Aufgeladene Objektträger</td><td>Superfrost Plus, Lomb Scientific Pty Ltd</td><td>SF41296SP</td><td></td></tr><tr><td>Cyrostat</td><td>Leica</td><td></td><td>Es kann ein geeigneter Cyrostat verwendet werden.</td></tr><tr><td>Perfusionsgeräte und Präparierinstrumente</td><td></td><td></td><td>Die Labore werden über eigene Perfusionsprotoktole verfügen.</td></tr><tr><td>Undurchsichtige humifizierte Kammer</td><td></td><td></td><td>Labore können ihre eigenen mit einem undurchsichtigen Kunststoffbehälter herstellen.</td></tr><tr><td>PAP pene</td><td>GeneTex (USA)</td><td></td><td>Wachsstift oder Oberflächenspannung können auch verwendet werden, um eine Vertiefung um den Gewebeschnitt zu schaffen.</td></tr><tr><td>Konfokalmikroskop</td><td>Zeis LSM780</td><td></td><td>Es kann jedes konfokale Mikroskop mit entsprechenden Laserlinien verwendet werden.</td></tr><tr><td>Fidschi/Image J</td><td>Nationale Gesundheitsinstitutionen</td><td></td><td>Erhältlich ab www.fiji.sc</td></tr></tbody></table>

ein einfacher ansatz, experimentelle autoimmune neuritis bei c57bl/6 mäusen für funktionale und neuropathologische bewertungen zu induzieren

A Simple Approach to Induce Experimental Autoimmune Neuritis in C57BL/6 Mice for Functional and Neuropathological Assessments

Experimentelle autoimmune Neuritis (EAN) ist ein gut geschätzt experimentellen Modell der autoimmunen peripheren demyelinisierenden Erkrankungen. EAN Krankheit wird induziert durch Immunisierung von Mäusen mit neurogenen Peptide, entzündlichen Angriff gegen Komponenten des peripheren Nervensystems (PNS) zu lenken. Die jüngsten Fortschritte konnten die Induktion von EAN in der relativ resistent C57BL/6-Maus-Linie mit Myelin Protein zero (P0)106-125 oder P0180-199 Peptide in adjuvante kombiniert mit der Injektion von Pertussis-Toxin geliefert. Die Fähigkeit, EAN induzieren in den Stamm C57BL/6 ermöglicht den Einsatz der zahlreichen genetische Werkzeuge, die auf diesem Hintergrund Maus vorhanden und ermöglicht so das anspruchsvolle Studium der Pathogenese der Krankheit und Vernehmung der mechanistischen Wirkung neuer Therapeutika in Kombination mit transgene Ansätze. In der vorliegenden Studie zeigen wir einen einfachen Ansatz, um erfolgreich EAN verwendet P0180-199 Peptid bei C57BL/6 Mäusen zu induzieren. Wir skizzieren auch ein Protokoll für die Beurteilung der funktionellen Defizite, die in diesem Modell, begleitet von einer Reihe von neuropathologische Funktionen auftreten. Somit ist dieses Modell ein leistungsfähiges experimentellen Modell die Pathogenese der menschlichen peripheren demyelinisierenden Neuropathien zu studieren und die Wirksamkeit der möglichen Therapien zu bestimmen, die darauf abzielen, Myelin-Reparatur zu schützen gegen Nervenschäden in autoimmune Neuritis.

P0180-199 Peptid induzierten EAN C57BL/6 Mäusen führt zu eine monophasische Erkrankung mit klinischen Score Ausbruch aus 6 Tage nach ersten Immunisierung (dpi) und maximale Punktzahl Schweregrad von 25 dpi beobachtet wird gefolgt von einigen klinischen Ergebnis Verbesserung von 40 dpi Dauer (Abbildung 1)4,9. In Bezug auf die Gangart Funktion Mäuse beginnen zu versagen bei laufenden einfach ...

Dieser Bericht beschreibt einen einfachen Ansatz, um erfolgreich experimentelle autoimmune Neuritis (EAN) mit dem Myelin Protein zero (P0)180-199 Peptid in Kombination mit Freunds kompletten Adjuvans und Pertussis-Toxin zu induzieren. Wir präsentieren Ihnen eine ausgereifte Paradigma in der Lage, präzise Bewertung des Ausmaßes der funktionelle Defizite und Neuropathologie, die in diesem EAN auftreten.

Ein einfacher Ansatz, experimentelle Autoimmune Neuritis bei C57BL/6 Mäusen für funktionale und neuropathologische Bewertungen zu induzieren

Experimental autoimmune neuritis (EAN) is a well-appreciated experimental model of autoimmune peripheral demyelinating diseases. EAN disease is induced by ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die experimentelle Autoimmunneuritis (EAN) in einem Mausmodell zur funktionellen und pathologischen Analyse des Krankheitsprozesses erfolgreich zu induzieren. Das EAN-Modell kann verwendet werden, um Schlüsselfragen im Zusammenhang mit der peripheren Neuropathie zu beantworten. Es ist auch ein wunderbares Modell, um die Wirksamkeit neuartiger Therapeutika zu untersuchen.Der Hauptvorteil dieses Ansatzes besteht darin, dass er ein einfaches und objektives Funktionstestparadigma bietet, das bei der Verwendung des EAN-Modells in der Maus angewendet werden kann. Heute demonstriert mir Sang Won Yoo, ein Student im Labor für Neurotrophin- und Myelinbiologie an der Universität Melbourne, das Verfahren. Schalten Sie drei Tage vor der Krankheitseinleitung das Gerät zur Beurteilung der motorischen Funktion ein und schalten Sie die Lichttaste ein.Nimm die Maus und senke sie auf einen Behälter mit roter Lebensmittelfarbe. Platzieren Sie die Maus in das Gehfach und stellen Sie die Laufbandgeschwindigkeit auf 15 Zentimeter pro Sekunde ein. Schalten Sie das Laufband ein und klicken Sie auf Aufnahme, um das Bildgebungssystem für die Gangfunktion zu verwenden, um die Laufbewegung der Maus 36 Sekunden lang aufzuzeichnen.Stoppen Sie nach 36 Sekunden die Aufzeichnung und das Laufband und speichern Sie die Übungslauf-Videodatei des Übungslaufs im dafür vorgesehenen Ordner. Einen Tag vor der ersten Immunisierung verwenden Sie eine 0,5-Milliliter-Spritze, die mit einer 30-1/2-Gauge-Nadel ausgestattet ist, um 1,6 Mikrogramm pro Milliliter Pertussis-Toxin in 250 Mikroliter isotonisches PBS-IP der Maus an anästhesierte sechs bis acht Wochen alte männliche C57BL/6-Mäuse zu verabreichen. Bewerten Sie dann die Mäuse auf einer Skala von null bis vier auf einer Skala von null bis vier gemäß der Tabelle und führen Sie eine motorische Funktionsbewertung durch, wie gerade gezeigt.Kombinieren Sie am nächsten Tag gleiche Volumina frisch zubereiteter Peptidlösungen in 0,9% Kochsalzlösung und 20 Milligramm pro Milliliter Mycobacterium tuberculosis in vollständigem Freund-Adjuvans in einem Beadbeader und mischen Sie die Lösungen bei maximaler Geschwindigkeit für eine Minute bei Raumtemperatur. Laden Sie eine Spritze mit einer 23-Gauge-Nadel mit dem Inokulum und drehen Sie die Spritze um und schütteln Sie sie, bevor Sie die Luft aus dem Spritzenschaft evakuieren. Entfernen Sie vor der Abgabe des Inokulums die Haare seitlich der Mittellinie zwischen den Schulterblättern und desinfizieren Sie die exponierte Haut mit 70% Ethanol.Verwenden Sie dann eine Adson-Pinzette, um die Haut zu greifen, und geben Sie 50 Mikroliter der Lösung per subkutaner Injektion an das Pertussis-Toxin, das der Maus injiziert wurde. Am nächsten Morgen verabreichen Sie 1,2 Mikrogramm pro Milliliter Pertussis-Toxin in 250 Mikrolitern PBS IP, wie gerade gezeigt, gefolgt von einer weiteren Injektion von 1,2 Mikrogramm pro Milliliter Pertussis-Toxin IP 48 Stunden später. Drei Tage später nach der dritten Pertussis-Injektion verabreichen Sie weitere 50 Mikroliter frisch zubereitetes Inokulum an der gleichen Injektionsstelle wie zuvor und überwachen Sie den klinischen Score und die motorische Funktion der Tiere zweimal pro Woche bis zum Ende des Versuchs.P0 180-199 Peptid-induzierte EAN in C57BL/6-Mäusen führt zu einer monophasischen Erkrankung mit einem klinischen Score ab sechs Tagen nach der Erstimmunisierung und einem maximalen Schweregrad des Scores 25 Tage nach der Erstimmunisierung, gefolgt von einer gewissen Verbesserung des klinischen Scores 40 Tage nach der Erstimmunisierung. Die Mäuse beginnen bereits sechs Tage nach der ersten Immunisierung bei einer einfachen Laufaufgabe zu versagen, wobei sie 35 Tage nach der Immunisierung nur wenig in der Lage sind, eine einfache Laufaufgabe auf dem Laufband zu erledigen, die sich 55 Tage nach der ersten Immunisierung nicht verbessert. Die Untersuchung von halbdünnen Schnitten der Ischiasnerven von Peptid-induzierten EAN-Mäusen zeigt Bereiche mit Demyelinisierung im Vergleich zu Ischiasnerven von altersgleichen gesunden Kontrollen.Hochleistungs-Transmissionselektronenmikroskopie-Bilder ermöglichen die Identifizierung spezifischer neuropathologischer Merkmale wie Demyelinisierung, Schädigung der Myelinlamelle und Anzeichen von Axonstress wie mitochondriale Schwellungen. Diese Tiere zeigen auch akute axonale Schäden, was durch eine traumatisch erhöhte Expression von Beta-Amyloid-Vorläuferproteinen in den Ischiasnerven belegt wird, die in altersgleichen gesunden Kontrollgeweben nicht beobachtet wird. Eine Verbreiterung der Knoten und eine Störung der Paranoden sind ebenfalls zu beobachten.Sobald die subkutane Injektion gemeistert ist, können sie innerhalb von etwa fünf bis 10 Minuten pro Maus durchgeführt werden, wobei die Wahrscheinlichkeit eines Injektionsfehlers minimal ist. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wirklich wichtig, dass Sie die Injektionsstelle beobachten, um sicherzustellen, dass das gesamte Inokulum an der Injektionsstelle verbleibt und nichts davon austritt. Die Videoaufzeichnung des Laufbandgangs ist großartig, da sie die Berechnung anderer Parameter wie Schwungphase oder Schrittlänge ermöglicht, und diese Messungen können beim Testen der Wirksamkeit neuartiger Therapeutika wichtig werden.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein wirklich gutes Verständnis dafür haben, wie man EAN bei männlichen C57BL/6-Mäusen induziert. Darüber hinaus sollten Sie ein wirklich gutes Verständnis dafür haben, wie Sie subkutane Injektionen sicher und wirklich genau platzieren, um sicherzustellen, dass kein Injektionsfehler auftritt. Vergessen Sie nicht, dass bei der Arbeit mit Nadeln und Inokulum die Gefahr von Verletzungen besteht, insbesondere bei der Verwendung von scharfen Gegenständen.Um Verletzungsgefahr zu vermeiden, ist es also eine wirklich gute Idee, immer die Pinzette zu verwenden und Haut oder Gewebe niemals mit der Hand zu greifen und auch Einwegspritzen zu verwenden, ohne dabei wieder zu verschließen.

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Das Video zeigt die Induktion einer experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis in einem Mausmodell durch Injektion einer Kombination aus Myelin-Oligodendrozyten-Glykoproteinen und inaktiviertem Mycobacterium tuberculosis. Das Modell ermöglicht es Forschenden, Krankheitsmechanismen zu untersuchen und therapeutische Interventionen zu testen.

Induktion einer experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis im Mausmodell

Dieses Video zeigt die Methode zur Induktion einer experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) durch Injektion von Myelin-abgeleiteten Peptiden mit einem Adjuvans, um autoreaktive T-Zellen zu aktivieren, die ins Gehirn wandern. Pertussis-Toxin wird verabreicht, um die Durchlässigkeit der Blut-Hirn-Schranke zu erhöhen, so dass diese T-Zellen und andere Immunzellen in das Gehirn eindringen können. Diese Immunzellen verursachen eine Demyelinisierung, die zu einer gestörten...

Generierung einer experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis im Mausmodell

In diesem Video wird ein Mausmodell für Multiple Sklerose mit Hilfe der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) erstellt. Der Maus wird eine Emulsion injiziert, die ein neuronales Peptid und ein Adjuvans enthält, wodurch eine Immunantwort ausgelöst wird, die autoreaktive T-Zellen aktiviert. Darauf folgt eine Injektion von Pertussis-Toxin (PTX), um die Durchlässigkeit der Blut-Hirn-Schranke zu erhöhen, so dass die autoreaktiven T-Zellen das Gehirn infiltrieren können. Diese...

Dieses Video zeigt den Prozess der Beurteilung der motorischen Dysfunktion in einem Mausmodell durch die Verabreichung von Pertussis-Toxin und einem Inokulum, das Myelin-imitierende Peptide und Adjuvantien enthält, gefolgt von Laufbandtests, um die motorische Funktion zu beurteilen und die daraus resultierenden Nervenschäden aufgrund von Immunaktivierung und Demyelinisierung zu bewerten.

Bewertung der motorischen Funktion in einem experimentellen Mausmodell für Autoimmunneuritis

Die Transplantation von neuronalen Stammzellen / Vorläuferzellen (NPCs) hält große Versprechungen in der regenerativen Neurologie. Die systemische Verabreichung von NPCs ist in effektive, invasiv und therapeutisch sehr wirksam Protokoll wandte sich Stammzellen im Gehirn und Rückenmark von Nagern und Primaten durch experimentelle chronisch entzündliche Schädigung des zentralen Nervensystems betroffen zu liefern.

Die systemische Injektion von Neural Stem / Progenitor-Zellen in Mäusen mit chronischer EAE

Dieses Manuskript beschreibt die Methoden zur Induktion und Bewertung des experimentellen Modells der autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE), zusammen mit der Beurteilung der Immunzellverteilung und der mRNA-Zytokinspiegel in Lymphknoten, Milz, Blut und Rückenmark mittels Durchflusszytometrie bzw. quantitativer PCR in verschiedenen Krankheitsstadien.

Die Induktion der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis bei Mäusen und die Auswertung des Krankheitsabhängige Verteilung von Immunzellen in verschiedenen Geweben

Dieses Protokoll beschreibt, wie bestimmt werden kann, ob pharmakologische Behandlungen für experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis einen ZNS-Schutz als Folge der Unterdrückung der Immunzellinfiltration zeigen oder während des Ansturms der Immunzellinfiltration neuroprotektiv sind.

Die Bestimmung Unterdrückung des Immunsystems gegen ZNS-Schutz für pharmakologische Interventionen im Bereich der Autoimmun- Demyelinisierung

Wir zeigen eine Technik für die in vivo lebenden Biolumineszenz und Nahinfrarot-Bildgebung von Optikusneuritis und Enzephalitis in der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) -Modell für Multiple Sklerose in SJL / J - Mäusen.

Biolumineszenz und Nah-Infrarot-Imaging von Neuritis und Gehirnentzündung im EAE-Modell der Multiplen Sklerose in Mäusen

Hier präsentieren wir Ihnen Protokolle, um die Beeinträchtigung der neurovaskuläre Einheit während experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis in vivo zu untersuchen. Wir gezielt auf Durchlässigkeit der Blut - Hirn-Schranke und Gelatinase Tätigkeit in Leukozyte Migration über die Glia Limitans ermitteln.

Beeinträchtigung der Endothelzellen und glialen Barrieren des Referats neurovaskuläre während experimentelle Autoimmune Enzephalomyelitis In Vivo Visualisierung

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Induktion einer experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis in einem Mausmodell unter Verwendung von Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein und die Überwachung des Krankheitsprozesses mit einem klinischen Scoring-System. Experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis-bezogene Symptome werden mittels Mausfemur-Mikro-Computertomographie und Freilandtest analysiert, um den Krankheitsprozess umfassend zu beurteilen.

Induktion und diverse Bewertungsindikatoren der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis

Um eine experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis, ein Tiermodell für Multiple Sklerose, zu induzieren, werden Mäuse mit einer Wasser-in-Öl-Emulsion immunisiert, die ein Autoantigen und ein komplettes Freund-Adjuvans enthält. Während für die Herstellung dieser Emulsionen mehrere Protokolle existieren, wird hier ein schnelles, einfaches und standardisiertes Homogenisierungsprotokoll für die Emulsionsherstellung vorgestellt.

Eine schnelle, einfache und standardisierte Homogenisierungsmethode zur Herstellung von Antigen/Adjuvans-Emulsionen zur Induktion experimenteller autoimmuner Enzephalomyelitis

Erfahren Sie, wie Sie experimentelle Autoimmune Neuritis bei C57BL/6-Mäusen induzieren, um periphere Neuropathie funktionell und neuropathologisch zu untersuchen. Dieses Protokoll ermöglicht die Bewertung neuer Therapeutika.

Ein einfacher Ansatz, experimentelle Autoimmune Neuritis bei C57BL/6 Mäusen für funktionale und neuropathologische Bewertungen zu induzieren (Video) | JoVE Journal

Ein einfacher Ansatz, experimentelle Autoimmune Neuritis bei C57BL/6 Mäusen für funktionale und neuropathologische Bewertungen zu induzieren

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