Ein einfacher Ansatz, experimentelle Autoimmune Neuritis bei C57BL/6 Mäusen für funktionale und neuropathologische Bewertungen zu induzieren

Dieser Bericht beschreibt einen einfachen Ansatz, um erfolgreich experimentelle autoimmune Neuritis (EAN) mit dem Myelin Protein zero (P0)_180-199 Peptid in Kombination mit Freunds kompletten Adjuvans und Pertussis-Toxin zu induzieren. Wir präsentieren Ihnen eine ausgereifte Paradigma in der Lage, präzise Bewertung des Ausmaßes der funktionelle Defizite und Neuropathologie, die in diesem EAN auftreten.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die experimentelle Autoimmunneuritis (EAN) in einem Mausmodell zur funktionellen und pathologischen Analyse des Krankheitsprozesses erfolgreich zu induzieren. Das EAN-Modell kann verwendet werden, um Schlüsselfragen im Zusammenhang mit der peripheren Neuropathie zu beantworten. Es ist auch ein wunderbares Modell, um die Wirksamkeit neuartiger Therapeutika zu untersuchen.

Der Hauptvorteil dieses Ansatzes besteht darin, dass er ein einfaches und objektives Funktionstestparadigma bietet, das bei der Verwendung des EAN-Modells in der Maus angewendet werden kann. Heute demonstriert mir Sang Won Yoo, ein Student im Labor für Neurotrophin- und Myelinbiologie an der Universität Melbourne, das Verfahren. Schalten Sie drei Tage vor der Krankheitseinleitung das Gerät zur Beurteilung der motorischen Funktion ein und schalten Sie die Lichttaste ein.

Nimm die Maus und senke sie auf einen Behälter mit roter Lebensmittelfarbe. Platzieren Sie die Maus in das Gehfach und stellen Sie die Laufbandgeschwindigkeit auf 15 Zentimeter pro Sekunde ein. Schalten Sie das Laufband ein und klicken Sie auf Aufnahme, um das Bildgebungssystem für die Gangfunktion zu verwenden, um die Laufbewegung der Maus 36 Sekunden lang aufzuzeichnen.

Stoppen Sie nach 36 Sekunden die Aufzeichnung und das Laufband und speichern Sie die Übungslauf-Videodatei des Übungslaufs im dafür vorgesehenen Ordner. Einen Tag vor der ersten Immunisierung verwenden Sie eine 0,5-Milliliter-Spritze, die mit einer 30-1/2-Gauge-Nadel ausgestattet ist, um 1,6 Mikrogramm pro Milliliter Pertussis-Toxin in 250 Mikroliter isotonisches PBS-IP der Maus an anästhesierte sechs bis acht Wochen alte männliche C57BL/6-Mäuse zu verabreichen. Bewerten Sie dann die Mäuse auf einer Skala von null bis vier auf einer Skala von null bis vier gemäß der Tabelle und führen Sie eine motorische Funktionsbewertung durch, wie gerade gezeigt.

Kombinieren Sie am nächsten Tag gleiche Volumina frisch zubereiteter Peptidlösungen in 0,9% Kochsalzlösung und 20 Milligramm pro Milliliter Mycobacterium tuberculosis in vollständigem Freund-Adjuvans in einem Beadbeader und mischen Sie die Lösungen bei maximaler Geschwindigkeit für eine Minute bei Raumtemperatur. Laden Sie eine Spritze mit einer 23-Gauge-Nadel mit dem Inokulum und drehen Sie die Spritze um und schütteln Sie sie, bevor Sie die Luft aus dem Spritzenschaft evakuieren. Entfernen Sie vor der Abgabe des Inokulums die Haare seitlich der Mittellinie zwischen den Schulterblättern und desinfizieren Sie die exponierte Haut mit 70% Ethanol.

Verwenden Sie dann eine Adson-Pinzette, um die Haut zu greifen, und geben Sie 50 Mikroliter der Lösung per subkutaner Injektion an das Pertussis-Toxin, das der Maus injiziert wurde. Am nächsten Morgen verabreichen Sie 1,2 Mikrogramm pro Milliliter Pertussis-Toxin in 250 Mikrolitern PBS IP, wie gerade gezeigt, gefolgt von einer weiteren Injektion von 1,2 Mikrogramm pro Milliliter Pertussis-Toxin IP 48 Stunden später. Drei Tage später nach der dritten Pertussis-Injektion verabreichen Sie weitere 50 Mikroliter frisch zubereitetes Inokulum an der gleichen Injektionsstelle wie zuvor und überwachen Sie den klinischen Score und die motorische Funktion der Tiere zweimal pro Woche bis zum Ende des Versuchs.

P0 180-199 Peptid-induzierte EAN in C57BL/6-Mäusen führt zu einer monophasischen Erkrankung mit einem klinischen Score ab sechs Tagen nach der Erstimmunisierung und einem maximalen Schweregrad des Scores 25 Tage nach der Erstimmunisierung, gefolgt von einer gewissen Verbesserung des klinischen Scores 40 Tage nach der Erstimmunisierung. Die Mäuse beginnen bereits sechs Tage nach der ersten Immunisierung bei einer einfachen Laufaufgabe zu versagen, wobei sie 35 Tage nach der Immunisierung nur wenig in der Lage sind, eine einfache Laufaufgabe auf dem Laufband zu erledigen, die sich 55 Tage nach der ersten Immunisierung nicht verbessert. Die Untersuchung von halbdünnen Schnitten der Ischiasnerven von Peptid-induzierten EAN-Mäusen zeigt Bereiche mit Demyelinisierung im Vergleich zu Ischiasnerven von altersgleichen gesunden Kontrollen.

Hochleistungs-Transmissionselektronenmikroskopie-Bilder ermöglichen die Identifizierung spezifischer neuropathologischer Merkmale wie Demyelinisierung, Schädigung der Myelinlamelle und Anzeichen von Axonstress wie mitochondriale Schwellungen. Diese Tiere zeigen auch akute axonale Schäden, was durch eine traumatisch erhöhte Expression von Beta-Amyloid-Vorläuferproteinen in den Ischiasnerven belegt wird, die in altersgleichen gesunden Kontrollgeweben nicht beobachtet wird. Eine Verbreiterung der Knoten und eine Störung der Paranoden sind ebenfalls zu beobachten.

Sobald die subkutane Injektion gemeistert ist, können sie innerhalb von etwa fünf bis 10 Minuten pro Maus durchgeführt werden, wobei die Wahrscheinlichkeit eines Injektionsfehlers minimal ist. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wirklich wichtig, dass Sie die Injektionsstelle beobachten, um sicherzustellen, dass das gesamte Inokulum an der Injektionsstelle verbleibt und nichts davon austritt. Die Videoaufzeichnung des Laufbandgangs ist großartig, da sie die Berechnung anderer Parameter wie Schwungphase oder Schrittlänge ermöglicht, und diese Messungen können beim Testen der Wirksamkeit neuartiger Therapeutika wichtig werden.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein wirklich gutes Verständnis dafür haben, wie man EAN bei männlichen C57BL/6-Mäusen induziert. Darüber hinaus sollten Sie ein wirklich gutes Verständnis dafür haben, wie Sie subkutane Injektionen sicher und wirklich genau platzieren, um sicherzustellen, dass kein Injektionsfehler auftritt. Vergessen Sie nicht, dass bei der Arbeit mit Nadeln und Inokulum die Gefahr von Verletzungen besteht, insbesondere bei der Verwendung von scharfen Gegenständen.

Um Verletzungsgefahr zu vermeiden, ist es also eine wirklich gute Idee, immer die Pinzette zu verwenden und Haut oder Gewebe niemals mit der Hand zu greifen und auch Einwegspritzen zu verwenden, ohne dabei wieder zu verschließen.