4.8: Zelloberflächen-Biotinylierungs-Assay

Die Markierung von Zelloberflächenproteinen mit Biotin stellt ein leistungsfähiges Werkzeug dar, um zelluläre Transportwege zu untersuchen, die an der Regulierung von Membranproteinen beteiligt sind. Eine Zelle hält einen streng regulierten Satz von Proteinen an der Oberfläche aufrecht, so dass sie extrazelluläre Informationen über mehrere Signalwege empfangen und darauf reagieren kann. Es wird vermutet, dass die Endozytose, ein Prozess des Verschlingens, an der Regulation dieser Zelloberflächenproteine beteiligt ist, indem sie deren Internalisierung bewirkt. Daher hilft die Markierung dieser Proteine, bevor sie mit Wirkstoffen wie Biotin endozytiert werden, den Wissenschaftlern, ihre Internalisierung zu quantifizieren und ihre Rolle in zellulären Signalwegen zu untersuchen.

In diesem Video werden wir die Prinzipien und die Methodik von Biotinylierungsassays auf der Zelloberfläche diskutieren und einige Möglichkeiten untersuchen, wie Wissenschaftler diese Methode heute anpassen.

Schauen wir uns zunächst die Prinzipien hinter dem Biotinylierungsassay auf der Zelloberfläche an.

Wie bereits erwähnt, nutzen Zellen endozytäre Wege, um die räumlich-zeitliche Dichte und Verteilung von Oberflächenproteinen zu regulieren. Internalisierte Proteine werden über spezifische zelluläre Wege transportiert, woraufhin sie entweder zum Abbau zum Lysosom geschoben oder zur fortgesetzten Aktivität zurück an die Zelloberfläche zurückgeführt werden können. Die Biotinylierung auf der Zelloberfläche soll diese Prozesse messen.

Das in diesem Assay verwendete Tag, Biotin - auch bekannt als Vitamin H - ist ein kleines, wasserlösliches Molekül. Ein häufig verwendetes Derivat von Biotin für Oberflächenmarkierungsexperimente ist das Sulfo-NHS-SS-Biotin, das aus der Sulfogruppe, der N-Hydroxysuccinimidestergruppe, der Disulfidbindung und natürlich Biotin besteht. Vereinfachen wir diese riesige Struktur, indem wir Biotin durch den Buchstaben ?B.?

Die Sulfogruppe in dieser Struktur verleiht eine starke Ladung, die diese Form der Biotinmembran undicht macht. Die Markierung von Zelloberflächenproteinen erfolgt durch Zugabe von Sulfo-NHS-SS-Biotin zu Zellen, die bei einer Temperatur gehalten werden, die für die Endozytose restriktiv ist. Die NHS-Gruppe reagiert mit den primären Aminen auf Oberflächenproteinen und bildet kovalente Bindungen.

Dann werden die markierten Zellen auf eine Temperatur gebracht, die für die Endozytose akzeptabel ist, während der einige der markierten Proteine internalisiert werden. Schließlich werden die Zellen wieder auf die restriktive Temperatur gebracht, um die Endozytose zu stoppen. Um internalisierte Proteine spezifisch zu quantifizieren, wird ein hydrophiles, membranundurchlässiges Reduktionsmittel wie L-Glutathion zugesetzt. Dies reagiert mit den Disulfidbindungen an unendozytiertem Sulfo-NHS-SS-Biotin und spaltet Biotingruppen ab. Zu diesem Zeitpunkt sind die verbleibenden biotinylierten Proteine diejenigen, deren Markierungen vor dem Reduktionsmittel geschützt waren, weil sie zuvor internalisiert wurden.

Die Zellen werden dann lysiert und die endozytierten biotinylierten Proteine werden isoliert, um sie zu quantifizieren. Die Isolierung erfolgt in der Regel durch Zugabe von Zelllysaten zu synthetischen Kügelchen, die mit Streptavidin beschichtet sind. Da Streptavidin eine extrem hohe Affinität zu Biotin hat, heften sich die biotinylierten Proteine an die beschichteten Kügelchen. Eine Reihe von Waschschritten zur Entfernung kontaminierender Proteine und schließlich ein Elutionsschritt werden durchgeführt, um gebundene Proteine freizusetzen. Die Zielproteine können dann mit Techniken wie Western Blotting analysiert werden.

Da Sie nun die Konzepte hinter dem Biotinylierungsassay kennen, schauen wir uns ein verallgemeinertes Protokoll an, das zeigt, wie dieses Verfahren zur Messung der Endozytose von Oberflächenproteinen durchgeführt wird.

Beginnen Sie mit kultivierten Zellen, die auf 4 °C abgekühlt sind. Legen Sie sie auf Eis, um die Temperatur aufrechtzuerhalten, die für die Endozytose restriktiv ist. Als nächstes wird das membranundurchlässige Sulfo-NHS-SS-Biotin-Reagenz zugegeben, und die Zellen werden etwa 30 Minuten lang im Dunkeln inkubiert. Dies gibt genügend Zeit für die kovalente Bindung von Biotin-Markierungen an die Oberflächenproteine. Die Zellen werden dann aus dem Eis entnommen und mit 37 inkubiert? C für ca. 30 Minuten. Bei dieser Temperatur werden biotinylierte Oberflächenproteine endozytiert. Nach der Inkubation werden die Zellen auf 4" abgekühlt. C und ein hydrophiles Reduktionsmittel wie L-Glutathion wird zugesetzt. Diese reagiert mit Disulfidbindungen und setzt die Biotingruppen aus markierten, unendozytierten Proteinen frei.

Anschließend werden die Zellen durch Zentrifugation lysiert, wodurch die Zellmembranen aufgebrochen und biotinylierte Proteine freigelegt werden. Anschließend werden Lysate zu Streptavidin-beschichteten Kügelchen hinzugefügt und biotinylierte Proteine können binden. Die Kügelchen werden mit kalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen und mit einem Puffer eluiert, der Wasch- und Reduktionsmittel enthält. Diese Reagenzien denaturieren gebundene Proteine von Kügelchen und ermöglichen deren Rückgewinnung im Eluat. Proteine im Eluat werden anhand ihrer Molekülmasse durch Gelelektrophorese getrennt. Schließlich ermöglichen Western Blotting und Sondierung des Blots mit proteinspezifischen Antikörpern die Visualisierung des Zielproteins. Der prozentuale Anteil des endozytierten Proteins kann aus den resultierenden Bandendichten quantifiziert werden.

Nachdem Sie nun die Methodik der Zellbiotinylierung verstanden haben, schauen wir uns an, wie sie in bestimmten Experimenten eingesetzt wird.

Die häufigste Anwendung dieses Biotinylierungsprotokolls ist die Messung der endozytären Rate spezifischer Zelloberflächenproteine. Hier interessierten sich die Wissenschaftler für die Bewertung der Internalisierung des Dopamintransporters (DAT). Durch die Befolgung des Standardprotokolls konnten die Wissenschaftler den Prozentsatz der endozytierten DATs messen. Hierbei handelt es sich um einen repräsentativen Immunoblot, der die Spur T zeigt, die ?total? Proteinmenge vor der Internalisierung, Spur S steht für "stripped" Proben, bei denen die Zellen nie die Endozytose durchlaufen durften, sondern mit einem Reduktionsmittel behandelt wurden, und Spur I die Ergebnisse der ?internalisierten? proteine.

Neben der reinen Messung der Endozytose von Oberflächenproteinen untersuchen die Wissenschaftler auch die Auswirkungen von Medikamenten auf diesen Prozess. In dieser Studie untersuchten die Forscher die Oberflächendichte von DATs als Reaktion auf die Behandlung mit einem Aktivator der Proteinkinase C (PKC), von dem vermutet wurde, dass er die DAT-Internalisierung induziert. Die Wissenschaftler bestätigten dies, indem sie das In-vitro-Biotinylierungsprotokoll für die Verwendung in einem Ex-vivo-Assay an Hirngewebe von Mäusen anpassten. Die Daten zeigten einen Verlust von etwa 30 % an DAT aus der Zellmembran als Reaktion auf die PKC-Aktivierung.

Schließlich können Wissenschaftler durch die Optimierung des Biotinylierungsassays auch das Recycling von Membranproteinen messen. Hier untersuchten die Forscher das Oberflächenkanalprotein CFTR, das für die Leitung von Chloridionen verantwortlich ist. Um das Recycling zu bewerten, führten die Forscher ein Standard-Biotinylierungsprotokoll in einer Zellgruppe durch und modifizierten das Protokoll für die zweite Zellgruppe, indem sie Schritte nach der Abspaltung von Biotin von den nicht endozytierten Oberflächenproteinen hinzufügten. Zu diesen zusätzlichen Schritten gehörte die Erhöhung der Temperatur wieder auf 37? C, um das Recycling einiger der internalisierten, Biotin-markierten Rezeptorproteine zu ermöglichen. Durch die Berechnung der Differenz zwischen den internalisierten Proteinen vor und nach dem Recycling konnten die Wissenschaftler den Prozentsatz des zurückgeführten CFTR in die Membran quantifizieren.

Sie haben gerade die Einführung von JoVE in den Zelloberflächen-Biotinylierungsassay gesehen. Das Video beschrieb die Verfahrensschritte dieses Assays und erläuterte die Reaktion, die bei jedem Schritt abläuft. Abschließend haben wir einige Beispielexperimente untersucht, die die Anwendbarkeit dieser Methode demonstriert haben. Wie immer vielen Dank fürs Zuschauen!