Zelloberflächen-Biotinylierungs-Assay

Kennzeichnung der Zelle Oberflächenproteine mit Biotin stellt ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung zellulärer Transportwege bei der Regulierung der Membranproteine beteiligt. Eine Zelle unterhält einen streng regulierten Satz der Proteine an der Oberfläche, so dass es zu erhalten und auf extrazelluläre Informationen über mehrere Signalwege reagieren kann. Endozytose, einen Prozess der verschlingt, wird vorgeschlagen, zu verursacht deren Verinnerlichung durch Verordnung diese Zelle Oberflächenproteine beteiligen. Diese Proteine Kennzeichnung daher, bevor sie Endocytosed mit Wirkstoffen sind wie Biotin hilft Wissenschaftlern deren Verinnerlichung zu quantifizieren und ihre Rollen in zelluläre Signalwege zu studieren.

In diesem Video werden wir diskutieren die Prinzipien und Methoden der Zelloberfläche Biotinylierungen-Assays und erkunden einige Möglichkeiten, in denen Wissenschaftler diese Methode heute anpassen.

Betrachten wir zunächst die Prinzipien hinter der Zelloberfläche Biotinylierungen-Assay.

Wie bereits erwähnt, verwenden Zellen endocytic Wege, um die räumlich-zeitliche Dichte und Verteilung der Oberflächenproteine zu regulieren. Verinnerlichten Proteine werden durch spezifische zelluläre Signalwege, woraufhin sie werden abgeschoben, die Lysosomen zum Abbau oder Recycling-zurück an die Zelloberfläche für kontinuierliche Aktivität transportiert. Zelloberfläche Biotinylierungen ist entworfen, um diese Prozesse zu messen.

Die in diesem Test verwendete Variable Biotin – auch bekannt als Vitamin H – ist ein kleines, wasserlösliches Molekül. Eine häufig verwendete Ableitung von Biotin für Oberfläche Kennzeichnung Experimente ist die Sulfo-NHS-SS-Biotin, bestehend aus der Sulfo-Gruppe, die N-Succinimide Ester Hydroxygruppe, Disulfid Bindung und natürlich Biotin. Lassen Sie uns diese riesige Struktur vereinfachen, indem ersetzt Biotin mit dem Buchstaben "b".

Die Sulfo-Gruppe in dieser Struktur vermittelt einen starken Angriff, die diese Form der Biotin-Membran impermeant macht. Kennzeichnung der Zelle Oberflächenproteine erfolgt durch Hinzufügen von Sulfo-NHS-SS-Biotin auf Zellen, die bei einer Temperatur, die restriktive, Endozytose ist gepflegt. Die NHS-Gruppe reagiert mit der primäre Amine auf Oberflächenproteine, bilden kovalente Bindungen.

Dann sind die markierten Zellen auf eine Temperatur verschoben, die freizügig, Endozytose, ist in dem einige der markierten Proteine verinnerlicht wird. Schließlich sind Zellen auf die restriktive Temperatur zurückverschoben, Endozytose zu stoppen. Um speziell verinnerlichten Proteine, hydrophile, Membran-impermeant Reduktionsmittel quantifizieren — wie L-Glutathion – wird hinzugefügt. Dies wird reagieren mit den Disulfid-Bindungen auf Unendocytosed Sulfo-NHS-SS Biotin und Biotin Gruppen aus Spalten. Zu diesem Zeitpunkt sind verbleibenden biotinylierte Proteine diejenigen deren Etiketten vor das Reduktionsmittel geschützt waren, weil sie zuvor verinnerlicht wurden.

Zellen sind dann lysiert und die Endocytosed biotinylierte Proteine sind isoliert quantifiziert werden. Isolierung erfolgt in der Regel durch synthetische Perlen mit Streptavidin beschichteten Zelle Lysates hinzufügen. Da Streptavidin eine extrem hohe Affinität für Biotin besitzt, Heften biotinylierte Proteine sich an die beschichteten Perlen. Eine Reihe von Wasch-Schritte zum Entfernen von kontaminierende Proteine und schließlich eine Elution Schritt wird durchgeführt, um gebundene Proteine freizugeben. Die Zielproteine können dann durch Techniken wie Western Blot analysiert werden.

Da jetzt Sie die Konzepte hinter den Biotinylierungen-Assay kennen, betrachten wir ein allgemeines Protokoll zeigt, wie zum Ausführen dieses Verfahrens zur Messung der Endozytose Oberflächenproteine.

Beginnen Sie mit kultivierten Zellen auf 4° c abgekühlt Platzieren sie auf Eis, um die Temperatur zu halten, die Endozytose restriktiv ist. Als nächstes die Membran undurchlässig Sulfo-NHS-SS-Biotin Reagenz wird hinzugefügt, und Zellen werden in der Dunkelheit für ca. 30 Minuten inkubiert. Damit ausreichend Zeit für Biotin Etiketten kovalent an Oberflächenproteine befestigen. Zellen sind dann aus Eis entfernt und für ca. 30 Minuten bei 37° C inkubiert. Bei dieser Temperatur sind Oberflächenproteine biotinylierte Endocytosed. Nach Inkubation der Zellen werden auf 4° C gekühlt und hydrophilen Reduktionsmittel wie L-Glutathion wird hinzugefügt. Dieses reagiert mit Disulfid-Bindungen und löst die Biotin-Gruppen aus beschriftet, Unendocytosed Proteine.

Als nächstes werden durch Zentrifugation, so brechen Zellmembranen und Verfügbarmachen biotinylierte Proteine Zellen lysiert. Im Anschluss daran Lysates werden hinzugefügt, um Streptavidin beschichteten Perlen und biotinylierte Proteine binden dürfen. Perlen sind mit kalten Phosphat gepufferte Kochsalzlösung und eluierten mit einem Puffer mit Wasch- und Reduktionsmittel gewaschen. Diese Reagenzien denaturieren gebundene Proteine aus Perlen und aktivieren Sie ihre Erholung im Eluat. Proteine im Eluat sind auf der Grundlage ihrer molekularen Masse durch Gelelektrophorese getrennt. Zu guter Letzt erlauben Western Blot und Sondierung von der Blot mit Protein-spezifischen Antikörpern Visualisierung des Zielproteins. Prozentuale Endocytosed Protein kann aus der daraus resultierenden Band dichten quantifiziert werden.

Nun, da Sie die Methodik der Zelle Biotinylierungen verstehen, schauen wir wie es in bestimmten Experimenten verwendet wird.

Die häufigste Anwendung dieses Protokolls Biotinylierungen ist die endocytic bei bestimmten Zelle Oberflächenproteine messen. Hier waren Wissenschaftler, die Interesse an der Evaluation der Internalisierung der Dopamin-Transporter oder DAT. Folgt man das Standardprotokoll, konnten die Wissenschaftler den Prozentsatz der Endocytosed DATs messen. Dies ist eine repräsentative Immunoblot zeigen Gasse T, entsprechend "Gesamtbetrag" des Proteins vor Internalisierung, Lane, die S für "ausgezogen"-Proben ist, wo Zellen wurden nie durch Endozytose fortgesetzt sondern behandelt mit Reduktionsmittel und Lane, ich stellt die Ergebnisse der "verinnerlicht" Proteine.

Neben der Messung nur Endozytose Oberflächenproteine, untersuchen die Wissenschaftler die Auswirkungen von Drogen auf diesen Prozess. In dieser Studie bewertet Forscher die Flächendichte von DATs in Reaktion auf die Behandlung mit Aktivator Proteinkinase C (PKC), dessen Aktion vorgeschlagen worden ist, um DAT Verinnerlichung zu induzieren. Wissenschaftler bestätigt dies durch eine Anpassung der in-vitro- Biotinylierungen-Protokoll für den Einsatz in ein Ex-Vivo -Test auf Maus Hirngewebe. Die Daten zeigten eine ca. 30 % Verlust von DAT aus der Zellmembran, als Reaktion auf die Aktivierung der PKC.

Zu guter Letzt können durch die Feinabstimmung der Biotinylierungen-Assay, auch Wissenschaftler messen recycling von Membranproteinen. Hier untersuchen die Forscher waren die Oberfläche Kanal-Protein CFTR, verantwortlich für die Durchführung von Chlorid-Ionen. Um zu beurteilen, recycling, Forscher ein standard Biotinylierungen-Protokoll in einer Gruppe von Zellen durchgeführt, und das Protokoll für die zweite Gruppe von Zellen durch Hinzufügen von Schritten nach Spaltung Biotin aus Unendocytosed Oberflächenproteine geändert. Diese zusätzlichen Schritte enthalten, Erhöhung der Temperatur wieder auf 37° C zu ermöglichen, recycling von einige der verinnerlichten, Biotin markiert die Rezeptor-Proteine. Durch Berechnung der Differenz zwischen den verinnerlichten Proteinen vor und nach dem recycling stattfindet, konnten die Wissenschaftler Prozent CFTR recycelt zurück an die Membran zu quantifizieren.

Sie beobachtete Jupiters Einführung in die Zelloberfläche Biotinylierungen-Assay. Das Video beschrieben die Verfahrensschritte des Assays und erklärt die Reaktion auftritt bei jedem Schritt. Zu guter Letzt erkundeten wir einige Beispiel-Experimente, die die Anwendbarkeit dieser Methode nachgewiesen. Wie immer vielen Dank für das ansehen!