Zelloberflächen-Biotinylierungs-Assay
Kennzeichnung der Zelle Oberflächenproteine mit Biotin stellt ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung zellulärer Transportwege bei der Regulierung der Membranproteine beteiligt. Eine Zelle unterhält einen streng regulierten Satz der Proteine an der Oberfläche, so dass es zu erhalten und auf extrazelluläre Informationen über mehrere Signalwege reagieren kann. Endozytose, einen Prozess der verschlingt, wird vorgeschlagen, zu verursacht deren Verinnerlichung durch Verordnung diese Zelle Oberflächenproteine beteiligen. Diese Proteine Kennzeichnung daher, bevor sie Endocytosed mit Wirkstoffen sind wie Biotin hilft Wissenschaftlern deren Verinnerlichung zu quantifizieren und ihre Rollen in zelluläre Signalwege zu studieren.
In diesem Video werden wir diskutieren die Prinzipien und Methoden der Zelloberfläche Biotinylierungen-Assays und erkunden einige Möglichkeiten, in denen Wissenschaftler diese Methode heute anpassen.
Betrachten wir zunächst die Prinzipien hinter der Zelloberfläche Biotinylierungen-Assay.
Wie bereits erwähnt, verwenden Zellen endocytic Wege, um die räumlich-zeitliche Dichte und Verteilung der Oberflächenproteine zu regulieren. Verinnerlichten Proteine werden durch spezifische zelluläre Signalwege, woraufhin sie werden abgeschoben, die Lysosomen zum Abbau oder Recycling-zurück an die Zelloberfläche für kontinuierliche Aktivität transportiert. Zelloberfläche Biotinylierungen ist entworfen, um diese Prozesse zu messen.
Die in diesem Test verwendete Variable Biotin – auch bekannt als Vitamin H – ist ein kleines, wasserlösliches Molekül. Eine häufig verwendete Ableitung von Biotin für Oberfläche Kennzeichnung Experimente ist die Sulfo-NHS-SS-Biotin, bestehend aus der Sulfo-Gruppe, die N-Succinimide Ester Hydroxygruppe, Disulfid Bindung und natürlich Biotin. Lassen Sie uns diese riesige Struktur vereinfachen, indem ersetzt Biotin mit dem Buchstaben "b".
Die Sulfo-Gruppe in dieser Struktur vermittelt einen starken Angriff, die diese Form der Biotin-Membran impermeant macht. Kennzeichnung der Zelle Oberflächenproteine erfolgt durch Hinzufügen von Sulfo-NHS-SS-Biotin auf Zellen, die bei einer Temperatur, die restriktive, Endozytose ist gepflegt. Die NHS-Gruppe reagiert mit der primäre Amine auf Oberflächenproteine, bilden kovalente Bindungen.
Dann sind die markierten Zellen auf eine Temperatur verschoben, die freizügig, Endozytose, ist in dem einige der markierten Proteine verinnerlicht wird. Schließlich sind Zellen auf die restriktive Temperatur zurückverschoben, Endozytose zu stoppen. Um speziell verinnerlichten Proteine, hydrophile, Membran-impermeant Reduktionsmittel quantifizieren — wie L-Glutathion – wird hinzugefügt. Dies wird reagieren mit den Disulfid-Bindungen auf Unendocytosed Sulfo-NHS-SS Biotin und Biotin Gruppen aus Spalten. Zu diesem Zeitpunkt sind verbleibenden biotinylierte Proteine diejenigen deren Etiketten vor das Reduktionsmittel geschützt waren, weil sie zuvor verinnerlicht wurden.
Zellen sind dann lysiert und die Endocytosed biotinylierte Proteine sind isoliert quantifiziert werden. Isolierung erfolgt in der Regel durch synthetische Perlen mit Streptavidin beschichteten Zelle Lysates hinzufügen. Da Streptavidin eine extrem hohe Affinität für Biotin besitzt, Heften biotinylierte Proteine sich an die beschichteten Perlen. Eine Reihe von Wasch-Schritte zum Entfernen von kontaminierende Proteine und schließlich eine Elution Schritt wird durchgeführt, um gebundene Proteine freizugeben. Die Zielproteine können dann durch Techniken wie Western Blot analysiert werden.
Da jetzt Sie die Konzepte hinter den Biotinylierungen-Assay kennen, betrachten wir ein allgemeines Protokoll zeigt, wie zum Ausführen dieses Verfahrens zur Messung der Endozytose Oberflächenproteine.
Beginnen Sie mit kultivierten Zellen auf 4° c abgekühlt Platzieren sie auf Eis, um die Temperatur zu halten, die Endozytose restriktiv ist. Als nächstes die Membran undurchlässig Sulfo-NHS-SS-Biotin Reagenz wird hinzugefügt, und Zellen werden in der Dunkelheit für ca. 30 Minuten inkubiert. Damit ausreichend Zeit für Biotin Etiketten kovalent an Oberflächenproteine befestigen. Zellen sind dann aus Eis entfernt und für ca. 30 Minuten bei 37° C inkubiert. Bei dieser Temperatur sind Oberflächenproteine biotinylierte Endocytosed. Nach Inkubation der Zellen werden auf 4° C gekühlt und hydrophilen Reduktionsmittel wie L-Glutathion wird hinzugefügt. Dieses reagiert mit Disulfid-Bindungen und löst die Biotin-Gruppen aus beschriftet, Unendocytosed Proteine.
Als nächstes werden durch Zentrifugation, so brechen Zellmembranen und Verfügbarmachen biotinylierte Proteine Zellen lysiert. Im Anschluss daran Lysates werden hinzugefügt, um Streptavidin beschichteten Perlen und biotinylierte Proteine binden dürfen. Perlen sind mit kalten Phosphat gepufferte Kochsalzlösung und eluierten mit einem Puffer mit Wasch- und Reduktionsmittel gewaschen. Diese Reagenzien denaturieren gebundene Proteine aus Perlen und aktivieren Sie ihre Erholung im Eluat. Proteine im Eluat sind auf der Grundlage ihrer molekularen Masse durch Gelelektrophorese getrennt. Zu guter Letzt erlauben Western Blot und Sondierung von der Blot mit Protein-spezifischen Antikörpern Visualisierung des Zielproteins. Prozentuale Endocytosed Protein kann aus der daraus resultierenden Band dichten quantifiziert werden.
Nun, da Sie die Methodik der Zelle Biotinylierungen verstehen, schauen wir wie es in bestimmten Experimenten verwendet wird.
Die häufigste Anwendung dieses Protokolls Biotinylierungen ist die endocytic bei bestimmten Zelle Oberflächenproteine messen. Hier waren Wissenschaftler, die Interesse an der Evaluation der Internalisierung der Dopamin-Transporter oder DAT. Folgt man das Standardprotokoll, konnten die Wissenschaftler den Prozentsatz der Endocytosed DATs messen. Dies ist eine repräsentative Immunoblot zeigen Gasse T, entsprechend "Gesamtbetrag" des Proteins vor Internalisierung, Lane, die S für "ausgezogen"-Proben ist, wo Zellen wurden nie durch Endozytose fortgesetzt sondern behandelt mit Reduktionsmittel und Lane, ich stellt die Ergebnisse der "verinnerlicht" Proteine.
Neben der Messung nur Endozytose Oberflächenproteine, untersuchen die Wissenschaftler die Auswirkungen von Drogen auf diesen Prozess. In dieser Studie bewertet Forscher die Flächendichte von DATs in Reaktion auf die Behandlung mit Aktivator Proteinkinase C (PKC), dessen Aktion vorgeschlagen worden ist, um DAT Verinnerlichung zu induzieren. Wissenschaftler bestätigt dies durch eine Anpassung der in-vitro- Biotinylierungen-Protokoll für den Einsatz in ein Ex-Vivo -Test auf Maus Hirngewebe. Die Daten zeigten eine ca. 30 % Verlust von DAT aus der Zellmembran, als Reaktion auf die Aktivierung der PKC.
Zu guter Letzt können durch die Feinabstimmung der Biotinylierungen-Assay, auch Wissenschaftler messen recycling von Membranproteinen. Hier untersuchen die Forscher waren die Oberfläche Kanal-Protein CFTR, verantwortlich für die Durchführung von Chlorid-Ionen. Um zu beurteilen, recycling, Forscher ein standard Biotinylierungen-Protokoll in einer Gruppe von Zellen durchgeführt, und das Protokoll für die zweite Gruppe von Zellen durch Hinzufügen von Schritten nach Spaltung Biotin aus Unendocytosed Oberflächenproteine geändert. Diese zusätzlichen Schritte enthalten, Erhöhung der Temperatur wieder auf 37° C zu ermöglichen, recycling von einige der verinnerlichten, Biotin markiert die Rezeptor-Proteine. Durch Berechnung der Differenz zwischen den verinnerlichten Proteinen vor und nach dem recycling stattfindet, konnten die Wissenschaftler Prozent CFTR recycelt zurück an die Membran zu quantifizieren.
Sie beobachtete Jupiters Einführung in die Zelloberfläche Biotinylierungen-Assay. Das Video beschrieben die Verfahrensschritte des Assays und erklärt die Reaktion auftritt bei jedem Schritt. Zu guter Letzt erkundeten wir einige Beispiel-Experimente, die die Anwendbarkeit dieser Methode nachgewiesen. Wie immer vielen Dank für das ansehen!
Eine Zelle kann Regeln die Menge an bestimmte Proteine auf der Zellmembran durch Endozytose, nach welcher Zelle Oberflächenproteine effektiv im Zytopl…
Kennzeichnung der Zelle Oberflächenproteine mit Biotin stellt ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung zellulärer Transportwege bei der Regulierung der Membranproteine beteiligt. Eine Zelle unterhält einen streng regulierten Satz der Proteine an der Oberfläche, so dass es zu erhalten und auf extrazelluläre Informationen über mehrere Signalwege reagieren kann. Endozytose, einen Prozess der verschlingt, wird vorgeschlagen, zu verursacht deren Verinnerlichung durch Verordnung diese Zelle Oberflächenproteine beteiligen. Diese Proteine Kennzeichnung daher, bevor sie Endocytosed mit Wirkstoffen sind wie Biotin hilft Wissenschaftlern deren Verinnerlichung zu quantifizieren und ihre Rollen in zelluläre Signalwege zu studieren.
In diesem Video werden wir diskutieren die Prinzipien und Methoden der Zelloberfläche Biotinylierungen-Assays und erkunden einige Möglichkeiten, in denen Wissenschaftler diese Methode heute anpassen.
Betrachten wir zunächst die Prinzipien hinter der Zelloberfläche Biotinylierungen-Assay.
Wie bereits erwähnt, verwenden Zellen endocytic Wege, um die räumlich-zeitliche Dichte und Verteilung der Oberflächenproteine zu regulieren. Verinnerlichten Proteine werden durch spezifische zelluläre Signalwege, woraufhin sie werden abgeschoben, die Lysosomen zum Abbau oder Recycling-zurück an die Zelloberfläche für kontinuierliche Aktivität transportiert. Zelloberfläche Biotinylierungen ist entworfen, um diese Prozesse zu messen.
Die in diesem Test verwendete Variable Biotin – auch bekannt als Vitamin H – ist ein kleines, wasserlösliches Molekül. Eine häufig verwendete Ableitung von Biotin für Oberfläche Kennzeichnung Experimente ist die Sulfo-NHS-SS-Biotin, bestehend aus der Sulfo-Gruppe, die N-Succinimide Ester Hydroxygruppe, Disulfid Bindung und natürlich Biotin. Lassen Sie uns diese riesige Struktur vereinfachen, indem ersetzt Biotin mit dem Buchstaben "b".
Die Sulfo-Gruppe in dieser Struktur vermittelt einen starken Angriff, die diese Form der Biotin-Membran impermeant macht. Kennzeichnung der Zelle Oberflächenproteine erfolgt durch Hinzufügen von Sulfo-NHS-SS-Biotin auf Zellen, die bei einer Temperatur, die restriktive, Endozytose ist gepflegt. Die NHS-Gruppe reagiert mit der primäre Amine auf Oberflächenproteine, bilden kovalente Bindungen.
Dann sind die markierten Zellen auf eine Temperatur verschoben, die freizügig, Endozytose, ist in dem einige der markierten Proteine verinnerlicht wird. Schließlich sind Zellen auf die restriktive Temperatur zurückverschoben, Endozytose zu stoppen. Um speziell verinnerlichten Proteine, hydrophile, Membran-impermeant Reduktionsmittel quantifizieren — wie L-Glutathion – wird hinzugefügt. Dies wird reagieren mit den Disulfid-Bindungen auf Unendocytosed Sulfo-NHS-SS Biotin und Biotin Gruppen aus Spalten. Zu diesem Zeitpunkt sind verbleibenden biotinylierte Proteine diejenigen deren Etiketten vor das Reduktionsmittel geschützt waren, weil sie zuvor verinnerlicht wurden.
Zellen sind dann lysiert und die Endocytosed biotinylierte Proteine sind isoliert quantifiziert werden. Isolierung erfolgt in der Regel durch synthetische Perlen mit Streptavidin beschichteten Zelle Lysates hinzufügen. Da Streptavidin eine extrem hohe Affinität für Biotin besitzt, Heften biotinylierte Proteine sich an die beschichteten Perlen. Eine Reihe von Wasch-Schritte zum Entfernen von kontaminierende Proteine und schließlich eine Elution Schritt wird durchgeführt, um gebundene Proteine freizugeben. Die Zielproteine können dann durch Techniken wie Western Blot analysiert werden.
Da jetzt Sie die Konzepte hinter den Biotinylierungen-Assay kennen, betrachten wir ein allgemeines Protokoll zeigt, wie zum Ausführen dieses Verfahrens zur Messung der Endozytose Oberflächenproteine.
Beginnen Sie mit kultivierten Zellen auf 4° c abgekühlt Platzieren sie auf Eis, um die Temperatur zu halten, die Endozytose restriktiv ist. Als nächstes die Membran undurchlässig Sulfo-NHS-SS-Biotin Reagenz wird hinzugefügt, und Zellen werden in der Dunkelheit für ca. 30 Minuten inkubiert. Damit ausreichend Zeit für Biotin Etiketten kovalent an Oberflächenproteine befestigen. Zellen sind dann aus Eis entfernt und für ca. 30 Minuten bei 37° C inkubiert. Bei dieser Temperatur sind Oberflächenproteine biotinylierte Endocytosed. Nach Inkubation der Zellen werden auf 4° C gekühlt und hydrophilen Reduktionsmittel wie L-Glutathion wird hinzugefügt. Dieses reagiert mit Disulfid-Bindungen und löst die Biotin-Gruppen aus beschriftet, Unendocytosed Proteine.
Als nächstes werden durch Zentrifugation, so brechen Zellmembranen und Verfügbarmachen biotinylierte Proteine Zellen lysiert. Im Anschluss daran Lysates werden hinzugefügt, um Streptavidin beschichteten Perlen und biotinylierte Proteine binden dürfen. Perlen sind mit kalten Phosphat gepufferte Kochsalzlösung und eluierten mit einem Puffer mit Wasch- und Reduktionsmittel gewaschen. Diese Reagenzien denaturieren gebundene Proteine aus Perlen und aktivieren Sie ihre Erholung im Eluat. Proteine im Eluat sind auf der Grundlage ihrer molekularen Masse durch Gelelektrophorese getrennt. Zu guter Letzt erlauben Western Blot und Sondierung von der Blot mit Protein-spezifischen Antikörpern Visualisierung des Zielproteins. Prozentuale Endocytosed Protein kann aus der daraus resultierenden Band dichten quantifiziert werden.
Nun, da Sie die Methodik der Zelle Biotinylierungen verstehen, schauen wir wie es in bestimmten Experimenten verwendet wird.
Die häufigste Anwendung dieses Protokolls Biotinylierungen ist die endocytic bei bestimmten Zelle Oberflächenproteine messen. Hier waren Wissenschaftler, die Interesse an der Evaluation der Internalisierung der Dopamin-Transporter oder DAT. Folgt man das Standardprotokoll, konnten die Wissenschaftler den Prozentsatz der Endocytosed DATs messen. Dies ist eine repräsentative Immunoblot zeigen Gasse T, entsprechend "Gesamtbetrag" des Proteins vor Internalisierung, Lane, die S für "ausgezogen"-Proben ist, wo Zellen wurden nie durch Endozytose fortgesetzt sondern behandelt mit Reduktionsmittel und Lane, ich stellt die Ergebnisse der "verinnerlicht" Proteine.
Neben der Messung nur Endozytose Oberflächenproteine, untersuchen die Wissenschaftler die Auswirkungen von Drogen auf diesen Prozess. In dieser Studie bewertet Forscher die Flächendichte von DATs in Reaktion auf die Behandlung mit Aktivator Proteinkinase C (PKC), dessen Aktion vorgeschlagen worden ist, um DAT Verinnerlichung zu induzieren. Wissenschaftler bestätigt dies durch eine Anpassung der in-vitro- Biotinylierungen-Protokoll für den Einsatz in ein Ex-Vivo -Test auf Maus Hirngewebe. Die Daten zeigten eine ca. 30 % Verlust von DAT aus der Zellmembran, als Reaktion auf die Aktivierung der PKC.
Zu guter Letzt können durch die Feinabstimmung der Biotinylierungen-Assay, auch Wissenschaftler messen recycling von Membranproteinen. Hier untersuchen die Forscher waren die Oberfläche Kanal-Protein CFTR, verantwortlich für die Durchführung von Chlorid-Ionen. Um zu beurteilen, recycling, Forscher ein standard Biotinylierungen-Protokoll in einer Gruppe von Zellen durchgeführt, und das Protokoll für die zweite Gruppe von Zellen durch Hinzufügen von Schritten nach Spaltung Biotin aus Unendocytosed Oberflächenproteine geändert. Diese zusätzlichen Schritte enthalten, Erhöhung der Temperatur wieder auf 37° C zu ermöglichen, recycling von einige der verinnerlichten, Biotin markiert die Rezeptor-Proteine. Durch Berechnung der Differenz zwischen den verinnerlichten Proteinen vor und nach dem recycling stattfindet, konnten die Wissenschaftler Prozent CFTR recycelt zurück an die Membran zu quantifizieren.
Sie beobachtete Jupiters Einführung in die Zelloberfläche Biotinylierungen-Assay. Das Video beschrieben die Verfahrensschritte des Assays und erklärt die Reaktion auftritt bei jedem Schritt. Zu guter Letzt erkundeten wir einige Beispiel-Experimente, die die Anwendbarkeit dieser Methode nachgewiesen. Wie immer vielen Dank für das ansehen!
Kennzeichnung der Zelle Oberflächenproteine mit Biotin stellt ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung zellulärer Transportwege bei der Regulierung der Membranproteine beteiligt. Eine Zelle unterhält einen streng regulierten Satz der Proteine an der Oberfläche, so dass es zu erhalten und auf extrazelluläre Informationen über mehrere Signalwege reagieren kann. Endozytose, einen Prozess der verschlingt, wird vorgeschlagen, zu verursacht deren Verinnerlichung durch Verordnung diese Zelle Oberflächenproteine beteiligen. Diese Proteine Kennzeichnung daher, bevor sie Endocytosed mit Wirkstoffen sind wie Biotin hilft Wissenschaftlern deren Verinnerlichung zu quantifizieren und ihre Rollen in zelluläre Signalwege zu studieren.
In diesem Video werden wir diskutieren die Prinzipien und Methoden der Zelloberfläche Biotinylierungen-Assays und erkunden einige Möglichkeiten, in denen Wissenschaftler diese Methode heute anpassen.
Betrachten wir zunächst die Prinzipien hinter der Zelloberfläche Biotinylierungen-Assay.
Wie bereits erwähnt, verwenden Zellen endocytic Wege, um die räumlich-zeitliche Dichte und Verteilung der Oberflächenproteine zu regulieren. Verinnerlichten Proteine werden durch spezifische zelluläre Signalwege, woraufhin sie werden abgeschoben, die Lysosomen zum Abbau oder Recycling-zurück an die Zelloberfläche für kontinuierliche Aktivität transportiert. Zelloberfläche Biotinylierungen ist entworfen, um diese Prozesse zu messen.
Die in diesem Test verwendete Variable Biotin – auch bekannt als Vitamin H – ist ein kleines, wasserlösliches Molekül. Eine häufig verwendete Ableitung von Biotin für Oberfläche Kennzeichnung Experimente ist die Sulfo-NHS-SS-Biotin, bestehend aus der Sulfo-Gruppe, die N-Succinimide Ester Hydroxygruppe, Disulfid Bindung und natürlich Biotin. Lassen Sie uns diese riesige Struktur vereinfachen, indem ersetzt Biotin mit dem Buchstaben "b".
Die Sulfo-Gruppe in dieser Struktur vermittelt einen starken Angriff, die diese Form der Biotin-Membran impermeant macht. Kennzeichnung der Zelle Oberflächenproteine erfolgt durch Hinzufügen von Sulfo-NHS-SS-Biotin auf Zellen, die bei einer Temperatur, die restriktive, Endozytose ist gepflegt. Die NHS-Gruppe reagiert mit der primäre Amine auf Oberflächenproteine, bilden kovalente Bindungen.
Dann sind die markierten Zellen auf eine Temperatur verschoben, die freizügig, Endozytose, ist in dem einige der markierten Proteine verinnerlicht wird. Schließlich sind Zellen auf die restriktive Temperatur zurückverschoben, Endozytose zu stoppen. Um speziell verinnerlichten Proteine, hydrophile, Membran-impermeant Reduktionsmittel quantifizieren — wie L-Glutathion – wird hinzugefügt. Dies wird reagieren mit den Disulfid-Bindungen auf Unendocytosed Sulfo-NHS-SS Biotin und Biotin Gruppen aus Spalten. Zu diesem Zeitpunkt sind verbleibenden biotinylierte Proteine diejenigen deren Etiketten vor das Reduktionsmittel geschützt waren, weil sie zuvor verinnerlicht wurden.
Zellen sind dann lysiert und die Endocytosed biotinylierte Proteine sind isoliert quantifiziert werden. Isolierung erfolgt in der Regel durch synthetische Perlen mit Streptavidin beschichteten Zelle Lysates hinzufügen. Da Streptavidin eine extrem hohe Affinität für Biotin besitzt, Heften biotinylierte Proteine sich an die beschichteten Perlen. Eine Reihe von Wasch-Schritte zum Entfernen von kontaminierende Proteine und schließlich eine Elution Schritt wird durchgeführt, um gebundene Proteine freizugeben. Die Zielproteine können dann durch Techniken wie Western Blot analysiert werden.
Da jetzt Sie die Konzepte hinter den Biotinylierungen-Assay kennen, betrachten wir ein allgemeines Protokoll zeigt, wie zum Ausführen dieses Verfahrens zur Messung der Endozytose Oberflächenproteine.
Beginnen Sie mit kultivierten Zellen auf 4° c abgekühlt Platzieren sie auf Eis, um die Temperatur zu halten, die Endozytose restriktiv ist. Als nächstes die Membran undurchlässig Sulfo-NHS-SS-Biotin Reagenz wird hinzugefügt, und Zellen werden in der Dunkelheit für ca. 30 Minuten inkubiert. Damit ausreichend Zeit für Biotin Etiketten kovalent an Oberflächenproteine befestigen. Zellen sind dann aus Eis entfernt und für ca. 30 Minuten bei 37° C inkubiert. Bei dieser Temperatur sind Oberflächenproteine biotinylierte Endocytosed. Nach Inkubation der Zellen werden auf 4° C gekühlt und hydrophilen Reduktionsmittel wie L-Glutathion wird hinzugefügt. Dieses reagiert mit Disulfid-Bindungen und löst die Biotin-Gruppen aus beschriftet, Unendocytosed Proteine.
Als nächstes werden durch Zentrifugation, so brechen Zellmembranen und Verfügbarmachen biotinylierte Proteine Zellen lysiert. Im Anschluss daran Lysates werden hinzugefügt, um Streptavidin beschichteten Perlen und biotinylierte Proteine binden dürfen. Perlen sind mit kalten Phosphat gepufferte Kochsalzlösung und eluierten mit einem Puffer mit Wasch- und Reduktionsmittel gewaschen. Diese Reagenzien denaturieren gebundene Proteine aus Perlen und aktivieren Sie ihre Erholung im Eluat. Proteine im Eluat sind auf der Grundlage ihrer molekularen Masse durch Gelelektrophorese getrennt. Zu guter Letzt erlauben Western Blot und Sondierung von der Blot mit Protein-spezifischen Antikörpern Visualisierung des Zielproteins. Prozentuale Endocytosed Protein kann aus der daraus resultierenden Band dichten quantifiziert werden.
Nun, da Sie die Methodik der Zelle Biotinylierungen verstehen, schauen wir wie es in bestimmten Experimenten verwendet wird.
Die häufigste Anwendung dieses Protokolls Biotinylierungen ist die endocytic bei bestimmten Zelle Oberflächenproteine messen. Hier waren Wissenschaftler, die Interesse an der Evaluation der Internalisierung der Dopamin-Transporter oder DAT. Folgt man das Standardprotokoll, konnten die Wissenschaftler den Prozentsatz der Endocytosed DATs messen. Dies ist eine repräsentative Immunoblot zeigen Gasse T, entsprechend "Gesamtbetrag" des Proteins vor Internalisierung, Lane, die S für "ausgezogen"-Proben ist, wo Zellen wurden nie durch Endozytose fortgesetzt sondern behandelt mit Reduktionsmittel und Lane, ich stellt die Ergebnisse der "verinnerlicht" Proteine.
Neben der Messung nur Endozytose Oberflächenproteine, untersuchen die Wissenschaftler die Auswirkungen von Drogen auf diesen Prozess. In dieser Studie bewertet Forscher die Flächendichte von DATs in Reaktion auf die Behandlung mit Aktivator Proteinkinase C (PKC), dessen Aktion vorgeschlagen worden ist, um DAT Verinnerlichung zu induzieren. Wissenschaftler bestätigt dies durch eine Anpassung der in-vitro- Biotinylierungen-Protokoll für den Einsatz in ein Ex-Vivo -Test auf Maus Hirngewebe. Die Daten zeigten eine ca. 30 % Verlust von DAT aus der Zellmembran, als Reaktion auf die Aktivierung der PKC.
Zu guter Letzt können durch die Feinabstimmung der Biotinylierungen-Assay, auch Wissenschaftler messen recycling von Membranproteinen. Hier untersuchen die Forscher waren die Oberfläche Kanal-Protein CFTR, verantwortlich für die Durchführung von Chlorid-Ionen. Um zu beurteilen, recycling, Forscher ein standard Biotinylierungen-Protokoll in einer Gruppe von Zellen durchgeführt, und das Protokoll für die zweite Gruppe von Zellen durch Hinzufügen von Schritten nach Spaltung Biotin aus Unendocytosed Oberflächenproteine geändert. Diese zusätzlichen Schritte enthalten, Erhöhung der Temperatur wieder auf 37° C zu ermöglichen, recycling von einige der verinnerlichten, Biotin markiert die Rezeptor-Proteine. Durch Berechnung der Differenz zwischen den verinnerlichten Proteinen vor und nach dem recycling stattfindet, konnten die Wissenschaftler Prozent CFTR recycelt zurück an die Membran zu quantifizieren.
Sie beobachtete Jupiters Einführung in die Zelloberfläche Biotinylierungen-Assay. Das Video beschrieben die Verfahrensschritte des Assays und erklärt die Reaktion auftritt bei jedem Schritt. Zu guter Letzt erkundeten wir einige Beispiel-Experimente, die die Anwendbarkeit dieser Methode nachgewiesen. Wie immer vielen Dank für das ansehen!
Q1: What is biotin and why is it used in cell-surface labeling experiments?
Biotin, also known as vitamin H, is a small, water-soluble molecule ideal for labeling cell surface proteins. The sulfo-NHS-SS-biotin derivative used in these assays contains a sulfo group that imparts strong charge, making it membrane impermeant so it labels only surface proteins. This allows scientists to track protein internalization without the label entering the cell prematurely.
Q2: How does temperature control regulate the biotinylation assay protocol?
The assay uses temperature shifts to control endocytosis timing. Cells are maintained at 4°C, a restrictive temperature preventing endocytosis, during initial biotin labeling. They are then moved to 37°C, a permissive temperature allowing endocytosis of labeled proteins. Finally, cells return to 4°C to halt endocytosis, ensuring precise measurement of internalized proteins during the defined window.
Q3: What role does L-glutathione play in distinguishing internalized from surface proteins?
L-glutathione is a hydrophilic, membrane-impermeant reducing agent that cleaves disulfide bonds on the biotin label. It removes biotin from unendocytosed surface proteins but cannot penetrate the cell membrane to reach internalized proteins. This selective cleavage leaves only biotinylated proteins that were protected inside the cell, enabling quantification of internalized proteins.
Q4: How are biotinylated proteins isolated and identified in the cell-surface biotinylation assay?
After cell lysis, biotinylated proteins are isolated using streptavidin-coated beads, which bind biotin with extremely high affinity. Following washing steps to remove contaminants, proteins are eluted using detergents and reducing agents. The recovered proteins are then separated by gel electrophoresis and analyzed using Western blotting with protein-specific antibodies for visualization and quantification.
Q5: What can scientists learn by measuring dopamine transporter endocytosis using biotinylation?
By applying the cell-surface biotinylation assay to dopamine transporter (DAT), scientists can quantify the percentage of DAT proteins internalized from the cell membrane. This measurement reveals how cells regulate neurotransmitter transporter availability and can show how drugs like protein kinase C activators affect transporter internalization, providing insights into cellular signaling and drug responses.
Q6: How can the biotinylation assay be modified to measure protein recycling?
To measure recycling, researchers perform the standard biotinylation protocol, then add steps after cleaving biotin from unendocytosed surface proteins. They raise temperature back to 37°C to allow internalized, biotin-tagged proteins to recycle back to the membrane. By comparing internalized protein amounts before and after recycling, scientists quantify the percentage of proteins recycled, as demonstrated with CFTR channel protein studies.
Q7: Why is the cell-surface biotinylation assay important for studying endocytosis and exocytosis pathways?
The biotinylation assay directly measures how cells regulate surface protein density through an introduction to endocytosis and exocytosis mechanisms. By tracking labeled proteins through internalization, degradation, and recycling pathways, scientists can quantify the spatiotemporal distribution of membrane proteins and understand how cells respond to extracellular signals and regulate cellular transport processes.
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