JoVE Science Education

Advanced Biology

Zelloberflächen-Biotinylierungs-Assay

Cell-surface Biotinylation Assay

JoVE Science Education
Cell Biology

This content is Free Access.

JoVE Science Education Cell Biology

Cell-surface Biotinylation Assay

4.7: An Introduction to Endocytosis and Exocytosis

4.9: FM Dyes in Vesicle Recycling

77,964 Views

•

09:13 min

•

April 30, 2023

Overview

Eine Zelle kann Regeln die Menge an bestimmte Proteine auf der Zellmembran durch Endozytose, nach welcher Zelle Oberflächenproteine effektiv im Zytoplasma abgesondert werden. Einmal innerhalb einer Zelle diese Oberflächenproteine können entweder vernichtet oder “recycelt” zurück an die Membran. Die Zelle Oberfläche Biotinylierungen Assay bietet Forschern einen Weg, diese Phänomene zu studieren. Die Technik nutzt ein Derivat von niedermolekularer Biotin, die Oberflächenproteine beschriften kann und dann chemisch gespalten werden. Wenn die Oberfläche Protein Endocytosed ist, wird das Biotin-Derivat von Spaltung geschützt werden. Somit durch Analyse der uncleaved, Endocytosed Biotin Label, Wissenschaftler können die Beträge der verinnerlichten Oberflächenproteine beurteilen.

In diesem Video überprüfen wir die Konzepte hinter der Biotinylierungen-Assay, Eintauchen in die chemische Struktur der Biotin-Ableitung und der Mechanismus der Spaltung. Danach ist eine generalisierte Protokoll der Technik, und schließlich, eine Beschreibung, wie Forscher derzeit es verwenden, um die Dynamik der verschiedenen Zelle Oberflächenproteine zu studieren.

Procedure

Kennzeichnung der Zelle Oberflächenproteine mit Biotin stellt ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung zellulärer Transportwege bei der Regulierung der Membranproteine beteiligt. Eine Zelle unterhält einen streng regulierten Satz der Proteine an der Oberfläche, so dass es zu erhalten und auf extrazelluläre Informationen über mehrere Signalwege reagieren kann. Endozytose, einen Prozess der verschlingt, wird vorgeschlagen, zu verursacht deren Verinnerlichung durch Verordnung diese Zelle Oberflächenproteine beteiligen. Diese Proteine Kennzeichnung daher, bevor sie Endocytosed mit Wirkstoffen sind wie Biotin hilft Wissenschaftlern deren Verinnerlichung zu quantifizieren und ihre Rollen in zelluläre Signalwege zu studieren.

In diesem Video werden wir diskutieren die Prinzipien und Methoden der Zelloberfläche Biotinylierungen-Assays und erkunden einige Möglichkeiten, in denen Wissenschaftler diese Methode heute anpassen.

Betrachten wir zunächst die Prinzipien hinter der Zelloberfläche Biotinylierungen-Assay.

Wie bereits erwähnt, verwenden Zellen endocytic Wege, um die räumlich-zeitliche Dichte und Verteilung der Oberflächenproteine zu regulieren. Verinnerlichten Proteine werden durch spezifische zelluläre Signalwege, woraufhin sie werden abgeschoben, die Lysosomen zum Abbau oder Recycling-zurück an die Zelloberfläche für kontinuierliche Aktivität transportiert. Zelloberfläche Biotinylierungen ist entworfen, um diese Prozesse zu messen.

Die in diesem Test verwendete Variable Biotin – auch bekannt als Vitamin H – ist ein kleines, wasserlösliches Molekül. Eine häufig verwendete Ableitung von Biotin für Oberfläche Kennzeichnung Experimente ist die Sulfo-NHS-SS-Biotin, bestehend aus der Sulfo-Gruppe, die N-Succinimide Ester Hydroxygruppe, Disulfid Bindung und natürlich Biotin. Lassen Sie uns diese riesige Struktur vereinfachen, indem ersetzt Biotin mit dem Buchstaben “b”.

Die Sulfo-Gruppe in dieser Struktur vermittelt einen starken Angriff, die diese Form der Biotin-Membran impermeant macht. Kennzeichnung der Zelle Oberflächenproteine erfolgt durch Hinzufügen von Sulfo-NHS-SS-Biotin auf Zellen, die bei einer Temperatur, die restriktive, Endozytose ist gepflegt. Die NHS-Gruppe reagiert mit der primäre Amine auf Oberflächenproteine, bilden kovalente Bindungen.

Dann sind die markierten Zellen auf eine Temperatur verschoben, die freizügig, Endozytose, ist in dem einige der markierten Proteine verinnerlicht wird. Schließlich sind Zellen auf die restriktive Temperatur zurückverschoben, Endozytose zu stoppen. Um speziell verinnerlichten Proteine, hydrophile, Membran-impermeant Reduktionsmittel quantifizieren — wie L-Glutathion – wird hinzugefügt. Dies wird reagieren mit den Disulfid-Bindungen auf Unendocytosed Sulfo-NHS-SS Biotin und Biotin Gruppen aus Spalten. Zu diesem Zeitpunkt sind verbleibenden biotinylierte Proteine diejenigen deren Etiketten vor das Reduktionsmittel geschützt waren, weil sie zuvor verinnerlicht wurden.

Zellen sind dann lysiert und die Endocytosed biotinylierte Proteine sind isoliert quantifiziert werden. Isolierung erfolgt in der Regel durch synthetische Perlen mit Streptavidin beschichteten Zelle Lysates hinzufügen. Da Streptavidin eine extrem hohe Affinität für Biotin besitzt, Heften biotinylierte Proteine sich an die beschichteten Perlen. Eine Reihe von Wasch-Schritte zum Entfernen von kontaminierende Proteine und schließlich eine Elution Schritt wird durchgeführt, um gebundene Proteine freizugeben. Die Zielproteine können dann durch Techniken wie Western Blot analysiert werden.

Da jetzt Sie die Konzepte hinter den Biotinylierungen-Assay kennen, betrachten wir ein allgemeines Protokoll zeigt, wie zum Ausführen dieses Verfahrens zur Messung der Endozytose Oberflächenproteine.

Beginnen Sie mit kultivierten Zellen auf 4° c abgekühlt Platzieren sie auf Eis, um die Temperatur zu halten, die Endozytose restriktiv ist. Als nächstes die Membran undurchlässig Sulfo-NHS-SS-Biotin Reagenz wird hinzugefügt, und Zellen werden in der Dunkelheit für ca. 30 Minuten inkubiert. Damit ausreichend Zeit für Biotin Etiketten kovalent an Oberflächenproteine befestigen. Zellen sind dann aus Eis entfernt und für ca. 30 Minuten bei 37° C inkubiert. Bei dieser Temperatur sind Oberflächenproteine biotinylierte Endocytosed. Nach Inkubation der Zellen werden auf 4° C gekühlt und hydrophilen Reduktionsmittel wie L-Glutathion wird hinzugefügt. Dieses reagiert mit Disulfid-Bindungen und löst die Biotin-Gruppen aus beschriftet, Unendocytosed Proteine.

Als nächstes werden durch Zentrifugation, so brechen Zellmembranen und Verfügbarmachen biotinylierte Proteine Zellen lysiert. Im Anschluss daran Lysates werden hinzugefügt, um Streptavidin beschichteten Perlen und biotinylierte Proteine binden dürfen. Perlen sind mit kalten Phosphat gepufferte Kochsalzlösung und eluierten mit einem Puffer mit Wasch- und Reduktionsmittel gewaschen. Diese Reagenzien denaturieren gebundene Proteine aus Perlen und aktivieren Sie ihre Erholung im Eluat. Proteine im Eluat sind auf der Grundlage ihrer molekularen Masse durch Gelelektrophorese getrennt. Zu guter Letzt erlauben Western Blot und Sondierung von der Blot mit Protein-spezifischen Antikörpern Visualisierung des Zielproteins. Prozentuale Endocytosed Protein kann aus der daraus resultierenden Band dichten quantifiziert werden.

Nun, da Sie die Methodik der Zelle Biotinylierungen verstehen, schauen wir wie es in bestimmten Experimenten verwendet wird.

Die häufigste Anwendung dieses Protokolls Biotinylierungen ist die endocytic bei bestimmten Zelle Oberflächenproteine messen. Hier waren Wissenschaftler, die Interesse an der Evaluation der Internalisierung der Dopamin-Transporter oder DAT. Folgt man das Standardprotokoll, konnten die Wissenschaftler den Prozentsatz der Endocytosed DATs messen. Dies ist eine repräsentative Immunoblot zeigen Gasse T, entsprechend “Gesamtbetrag” des Proteins vor Internalisierung, Lane, die S für “ausgezogen”-Proben ist, wo Zellen wurden nie durch Endozytose fortgesetzt sondern behandelt mit Reduktionsmittel und Lane, ich stellt die Ergebnisse der “verinnerlicht” Proteine.

Neben der Messung nur Endozytose Oberflächenproteine, untersuchen die Wissenschaftler die Auswirkungen von Drogen auf diesen Prozess. In dieser Studie bewertet Forscher die Flächendichte von DATs in Reaktion auf die Behandlung mit Aktivator Proteinkinase C (PKC), dessen Aktion vorgeschlagen worden ist, um DAT Verinnerlichung zu induzieren. Wissenschaftler bestätigt dies durch eine Anpassung der in-vitro- Biotinylierungen-Protokoll für den Einsatz in ein Ex-Vivo -Test auf Maus Hirngewebe. Die Daten zeigten eine ca. 30 % Verlust von DAT aus der Zellmembran, als Reaktion auf die Aktivierung der PKC.

Zu guter Letzt können durch die Feinabstimmung der Biotinylierungen-Assay, auch Wissenschaftler messen recycling von Membranproteinen. Hier untersuchen die Forscher waren die Oberfläche Kanal-Protein CFTR, verantwortlich für die Durchführung von Chlorid-Ionen. Um zu beurteilen, recycling, Forscher ein standard Biotinylierungen-Protokoll in einer Gruppe von Zellen durchgeführt, und das Protokoll für die zweite Gruppe von Zellen durch Hinzufügen von Schritten nach Spaltung Biotin aus Unendocytosed Oberflächenproteine geändert. Diese zusätzlichen Schritte enthalten, Erhöhung der Temperatur wieder auf 37° C zu ermöglichen, recycling von einige der verinnerlichten, Biotin markiert die Rezeptor-Proteine. Durch Berechnung der Differenz zwischen den verinnerlichten Proteinen vor und nach dem recycling stattfindet, konnten die Wissenschaftler Prozent CFTR recycelt zurück an die Membran zu quantifizieren.

Sie beobachtete Jupiters Einführung in die Zelloberfläche Biotinylierungen-Assay. Das Video beschrieben die Verfahrensschritte des Assays und erklärt die Reaktion auftritt bei jedem Schritt. Zu guter Letzt erkundeten wir einige Beispiel-Experimente, die die Anwendbarkeit dieser Methode nachgewiesen. Wie immer vielen Dank für das ansehen!

Transcript

Labeling of cell surface proteins with biotin presents a powerful tool to study cellular transport pathways involved in regulating membrane proteins. A cell maintains a tightly regulated set of proteins at the surface, so that it can receive and respond to extracellular information via several signaling pathways. Endocytosis, a process of engulfing, is suggested to be involved in regulation of these cell surface proteins by causing their internalization. Therefore, labeling these proteins before they are endocytosed with agents like biotin helps scientists quantify their internalization and study their roles in cellular pathways.

In this video, we will discuss the principles and methodology of cell-surface biotinylation assays, and explore some ways in which scientists are adapting this method today.

Let’s first review the principles behind the cell-surface biotinylation assay.

As mentioned earlier, cells use endocytic pathways to regulate the spatiotemporal density and distribution of surface proteins. Internalized proteins are transported through specific cellular pathways, following which they can be either shunted to the lysosome for degradation, or recycled back to the cell surface for continued activity. Cell-surface biotinylation is designed to measure these processes.

The tag used in this assay, biotin—also known as vitamin H—is a small, water-soluble molecule. A commonly used derivative of biotin for surface labeling experiments is the sulfo-NHS-SS-biotin, which consists of the sulfo group, the N-hydroxy succinimide ester group, the disulfide bond, and of course biotin. Let’s simplify this huge structure by replacing biotin with the letter “B.”

The sulfo group in this structure imparts a strong charge that makes this form of biotin membrane impermeant. Labeling of cell surface proteins is done by adding sulfo-NHS-SS-biotin to cells maintained at a temperature that’s restrictive to endocytosis. The NHS group reacts with the primary amines on surface proteins, forming covalent bonds.

Then, the labeled cells are moved to a temperature that is permissive to endocytosis, during which some of the labeled proteins will be internalized. Finally, cells are moved back to the restrictive temperature to stop endocytosis. In order to specifically quantify internalized proteins, a hydrophilic, membrane-impermeant reducing agent—like L-glutathione—is added. This will react with the disulfide bonds on unendocytosed sulfo-NHS-SS biotin, and cleave biotin groups off. At this point, remaining biotinylated proteins are those whose labels were protected from the reducing agent because they were previously internalized.

Cells are then lysed, and the endocytosed biotinylated proteins are isolated to be quantified. Isolation is usually performed by adding cell lysates to synthetic beads coated with streptavidin. Since streptavidin has an extremely high affinity for biotin, the biotinylated proteins attach themselves to the coated beads. A series of washing steps to remove contaminating proteins, and lastly an elution step, is performed to release bound proteins. The target proteins can then be analyzed by techniques like Western blotting.

Since now you know the concepts behind the biotinylation assay, let’s look at a generalized protocol showing how to perform this procedure to measure endocytosis of surface proteins.

Start with cultured cells cooled to 4°C. Place them on ice to maintain the temperature that is restrictive to endocytosis. Next, the membrane impermeable sulfo-NHS-SS-biotin reagent is added, and cells are incubated in the dark for approximately 30 minutes. This allows sufficient time for biotin labels to covalently attach to the surface proteins. Cells are then removed from ice and incubated at 37°C for approximately 30 minutes. At this temperature, biotinylated surface proteins are endocytosed. Following incubation, the cells are cooled to 4°C, and a hydrophilic reducing agent like L-glutathione is added. This reacts with disulfide bonds and releases the biotin groups from labeled, unendocytosed proteins.

Next, cells are lysed by centrifugation, thus breaking cell membranes and exposing biotinylated proteins. Following this, lysates are added to streptavidin-coated beads and biotinylated proteins are allowed to bind. Beads are washed with cold phosphate buffered saline and eluted with a buffer containing detergents and reducing agents. These reagents denature bound proteins off beads and enable their recovery in the eluate. Proteins in the eluate are separated on the basis of their molecular mass by gel electrophoresis. Lastly, Western blotting and probing of the blot with protein-specific antibodies allow visualization of the target protein. Percentage endocytosed protein can be quantified from the resulting band densities.

Now that you understand the methodology of cell biotinylation, let’s look at how it’s used in specific experiments.

The most common application of this biotinylation protocol is to measure the endocytic rate of specific cell surface proteins. Here, scientists were interested in evaluating the internalization of dopamine transporter or DAT. By following the standard protocol, scientists were able to measure the percentage of endocytosed DATs. This is a representative immunoblot showing lane T, corresponding to “total” amount of protein before internalization, lane S is for “stripped” samples where cells were never allowed to proceed through endocytosis but treated with reducing agent, and lane I represents results of “internalized” proteins.

In addition to just measuring endocytosis of surface proteins, scientists also examine the effects of drugs on this process. In this study, researchers assessed the surface density of DATs in response to treatment with an activator of protein kinase C (PKC), whose action has been suggested to induce DAT internalization. Scientists confirmed this by adapting the in vitro biotinylation protocol for use in an ex vivo assay on mouse brain tissue. The data revealed an approximately 30% loss of DAT from the cell membrane, in response to PKC activation.

Lastly, by tweaking the biotinylation assay, scientists can also measure recycling of membrane proteins. Here, researchers were investigating the surface channel protein, CFTR, responsible for conducting chloride ions. To assess recycling, researchers performed a standard biotinylation protocol in one group of cells, and modified the protocol for the second group of cells by adding steps after cleaving biotin off of the unendocytosed surface proteins. These additional steps included raising the temperature back to 37°C to allow recycling of some of the internalized, biotin tagged receptor proteins. By calculating the difference between the internalized proteins before and after recycling takes place, these scientists were able to quantify percent CFTR recycled back to the membrane.

You just watched JoVE’s introduction to cell-surface biotinylation assay. The video described the procedural steps of this assay, and explained the reaction occurring at each step. Lastly, we explored some example experiments that demonstrated the applicability of this method. As always, thanks for watching!

Tags

Leerer Wert Problem