Anwendung des High-Speed-Höchstauflösung Geschwindigkeit Mikroskopie in Live primäre Zilie

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, Proteintransportwege in primären Zilien zu identifizieren. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Zilien zu beantworten, wie z.B. die Unterschiede der Proteintransportwege in normalen und dysfunktionalen Zilien. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine ausreichend hohe Auflösung hat, um die Transportwege von Subbeugungsproteinen in lebenden Zellen zu erkennen.

Zu Beginn tauen Sie gefrorene Brühen von speziell entwickelten NIH-3T3-Zellen bei 37 Grad Celsius auf, eineinhalb Wochen vor dem Experiment. Die aufgetauten Zellen werden in einen 25 Quadratzentimeter großen Zellkulturkolben mit drei Millilitern vorgewärmtem Medium überführt. Halten Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius in einem 5%igen Kohlendioxid-Inkubator.

Kultivieren Sie die Zellen, bis sie eine Konfluenz von 80 % erreichen, und teilen Sie dann die Zellen. Um die Zellen zu spalten, trypsinisieren Sie sie mit 0,25%Trypsin für zwei Minuten bei 37 Grad Celsius. Nach der kurzen Inkubation aspirieren Sie das Trypsin und ersetzen es durch zwei Milliliter vorgewärmtes Kulturmedium.

Pipettieren Sie das Medium, um Zellcluster aufzubrechen, entfernen Sie dann 75 % der Zellen aus dem Kolben und bringen Sie das Gesamtvolumen des Mediums wieder auf drei Milliliter. Teilen Sie die Zellen vor dem Experiment mindestens dreimal, um die Homogenität ihres Zellzyklus zu gewährleisten. Zwei Tage vor dem Experiment spalten Sie die Zellen und plattieren sie mit 60-70 % Konfluenz auf einer 35-Millimeter-Glasbodenplatte mit 1,5 Millilitern des gleichen Nährmediums.

Dann, einen Tag vor dem Experiment, transfizieren Sie die Zellen chemisch mit dem gewünschten Plasmid. Mischen Sie 500-1000 Nanogramm des Plasmids im Verhältnis eins zu 2,5 mit dem Transfektionsreagenz und 0,25 Milliliter reduziertes Serummedium ohne Antibiotika für 30 Minuten. Sobald sich der Transfektionskomplex gebildet hat, aspirieren Sie das Medium aus der 35-Millimeter-Glasbodenschale und ersetzen Sie es durch das 0,25-Millimeter-Transfektionsgemisch und weitere 1,25 Millimeter reduziertes Serummedium ohne Antibiotika und stellen Sie die Platte wieder in den Inkubator.

Bei Zellen mit extern markiertem SSTR3-Konstrukt nehmen Sie das Medium eine Stunde vor dem Experiment aus der Glasbodenschale. Waschen Sie die Zellen fünfmal mit einem Milliliter PBS und fügen Sie einen Milliliter reduziertes Serummedium hinzu, das mit einem Mikromolar Alexa 647 konjugiertem Streptavidin ergänzt wird. Nehmen Sie spätestens 15 Minuten vor dem Experiment das Medium aus der Glasbodenschale und waschen Sie die Zellen fünfmal mit einem Milliliter PBS.

Geben Sie dann einen Milliliter des Bildgebungspuffers in die Glasbodenschale. Befestigen Sie die Glasbodenplatte auf dem Tisch im Mikroskop. Finden Sie eine GFP-Expresszelle mit dem GFP-Filterset und lokalisieren Sie eine Zelle, die SSTR3-GFP in einer primären Zilie korrekt exprimiert.

Sobald eine geeignete Zelle gefunden wurde, richten Sie den NPHP4-mCherry-Spot an der Basis der primären Zilien an der Position auf der Bildgebungsebene aus, die der Einzelpunktbeleuchtung des Lasers entspricht. Nehmen Sie mit der Snap-Funktion auf der Registerkarte "Kamera" des Fensters "Fokussteuerung" ein Epifluoreszenzbild von NPHP4-mCherry- und SSTR3-Proteinen auf, die mit grünem Fluoreszenzprotein markiert sind. Sobald die Referenzbilder erhalten sind, reduzieren Sie lokal die Konzentration der markierten Einzelmoleküle, indem Sie die Übergangszone 20 Sekunden lang mit einer Laserbeleuchtung von einem Milliwatt photobleichen.

Um sich auf die Einzelmolekülverfolgung vorzubereiten, reduzieren Sie die Laserbeleuchtungsleistung auf 0,5 Milliwatt für Moleküle, die mit Alexa 647 markiert wurden. Stellen Sie die Verstärkung und Intensivierung auf maximal und die Bildrate auf zwei Millisekunden ein. Klicken Sie dann auf die Stream-Schaltfläche auf der Registerkarte Kamera des Fensters für die Fokussteuerung und aktivieren Sie den entsprechenden Beleuchtungslaser.

Erfassen Sie die nicht photogebleichten markierten Einzelmoleküle, während sie durch den photogebleichten Bereich der Übergangszone transportiert werden. Und denken Sie daran, nicht mehr als zwei Minuten Video aufzunehmen, um die Auswirkungen der Ziliardrift zu vermeiden. Nachdem Sie die einzelnen Moleküle erfasst haben, verarbeiten Sie die Videos mit einem 2D-Gaußschen Anpassungsalgorithmus wie Glimpse vom Gelles-Labor, der den Schwerpunkt des Anregungspunkts jedes einzelnen Moleküls, die Spread-Funktion und einen umfassenden Interessenbereich genau lokalisiert.

Wählen Sie schließlich alle Einzelmolekülpositionen mit einer Genauigkeit von besser als 10 Nanometern aus und korrigieren Sie das Zentrum der Zilien basierend auf der Verteilung der Einzelmolekülpositionen, die mit einer 2D-Gaußschen Funktion ausgestattet sind. Wie in diesem Video beschrieben, kann die Einzelpunktbeleuchtung verwendet werden, um ein mit AF647 markiertes SSTR3-Molekül durch die mit NPHP4-mCherry markierte Übergangszone zu verfolgen. Vor der Datenanalyse ist die Überlagerung des Einzelmolekülvideos mit der Weitfeldbeleuchtung ein nützlicher Validierungsschritt, um sicherzustellen, dass der Laser richtig ausgerichtet ist und ein angemessenes Signal-Rausch-Verhältnis vorhanden ist.

Hier ist eine Zelle mit einem primären Zilium abgebildet, das durch die Färbung identifiziert wurde. IFT20 ist Bestandteil des intraflagellären Transportkomplexes, der Fracht entlang von Mikrotubuli in primären Zilien transportiert, die durch Arl13b-mCherry markiert sind. Nach der Identifizierung wird die Schnellmikroskopie verwendet, um einzelne IFT20-GFP-Proteine zu verfolgen.

Als nächstes wird ein 2D-zu-3D-Transformationsalgorithmus verwendet, um die räumliche Wahrscheinlichkeitsdichteverteilung des Proteins innerhalb der primären Zilien entlang einer einzigen Dimension zu erzeugen. Diese Region mit hoher Dichte kolokalisiert wahrscheinlich mit den axonemalen Mikrotubuli in Übereinstimmung mit der bekannten Lage des intraflagellären Transportweges. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, die Probe genau auf den Laser auszurichten, um systematische Fehler zu minimieren.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Einzelmolekül-Tracking mit Schnellmikroskopie durchführt, und Sie werden wissen, wie Sie den Einzelmolekül-Transportweg in primären Zilien erhalten.