Induktion und Mikro-CT-Bildgebung des zerebralen höhlenartigen Fehlbildungen im Mausmodell
September 4th, 2017
Dieses Protokoll zeigt die Induktion der zerebralen höhlenartigen Fehlbildung Krankheit in einem Mausmodell und Verwendungen Kontrast verstärkt Mikro-Computertomographie um Läsion Belastung zu messen. Diese Methode steigert den Wert der etablierten Mausmodelle, die molekularen Grundlagen und mögliche Therapien für zerebrale höhlenartigen Missbildungen und anderen zerebrovaskulären Krankheiten zu studieren.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, zerebrale kavernöse Fehlbildungen bei neonatalen Mäusen zu induzieren und die Krankheitslast mittels Mikro-CT zu messen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der zerebralen Gefäßerkrankungen, wie z. B. zerebrale kavernöse Malformationen, zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Krankheitslast der zerebralen kavernösen Malformation in neonatalen Mausmodellen im Vergleich zu bestehenden Methoden genau und effizient bestimmt werden kann.
Dievisuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Induktion von zerebralen kavernösen Malformationen und Mikro-CT-Analyseschritten schwer zu erlernen sind, da sie Erfahrung und den Einsatz ausgefeilter Software erfordert. Beginnen Sie mit dem Auflösen von 4-HT in 100%igem Ethanol bis zu einer Konzentration von 10 Milligramm pro Milliliter. Bereiten Sie 30 Mikroliter Alaquads vor und lagern Sie sie dann bei minus 80 Grad Celsius.
Verdünnen Sie das Alaquad am Tag der Anwendung bei 4-HT in Maisöl auf 0,5 Milligramm pro Milliliter. Verwenden Sie dann eine Insulinspritze, um 50 Mikroliter 4-HT in P1-Neugeborene zu injizieren, um experimentelle CCM-Läsionen zu induzieren. Beginnen Sie die Probenvorbereitung, indem Sie eine 10-Milliliter-Spritze, die mit einer 29-Gauge-Nadel ausgestattet ist, mit drei Millilitern 2 % Paraformaldehyd und PBS füllen.
Führen Sie dann eine intrakardiale Profusion bei euthenisiertem P8-Welpen durch, indem Sie die Nadel in den Ventrikel des Mausherzens einführen und langsam das volle Volumen an Paraformaldehyd injizieren. Nachdem Sie den Kopf mit einer Schere abgenommen haben, entfernen Sie die Haut vom Kopf und schälen Sie den Schädel mit einer Pinzette ab, um das gesamte Gehirn in 4% Paraformaldehyd und PBS zu zerlegen. Nach der Befestigung des Gehirns über Nacht bei 4 Grad Celsius.
Am nächsten Tag wird das Hinterhirn mit einer Pinzette abgetrennt und mit PBS-Lösung gespült. Dann inkubieren Sie das Hinterhirn 48 Stunden lang in Lugols Jodlösung. Trocknen Sie das Hinterhirn nach der Inkubation kurz an der Luft, um überschüssige Lugolsche Jodlösung zu entfernen.
Verpacken Sie dann das jodgefärbte Hinterhirn von Lugol in 0,65-Mikroliter-Mikrozentrifugenröhrchen und verschließen Sie es vollständig mit Kunststoffparaffinfolie, um ein Schrumpfen des Gewebes zu vermeiden. Legen Sie die Mikrozentrifugenröhrchen in Fünf-Milliliter-Plastikröhrchen mit Schwämmen, um zu verhindern, dass sie sich während des Scans bewegen. Montieren Sie den Schlauch mit dem Hinterhirn vertikal auf einer Aluminiumhalterung im Mikro-CT-System.
Legen Sie die Scan-Parameter fest. Verwenden Sie 540 Projektionen und eine Belichtungszeit von zwei Sekunden mit Quellenbedingungen von 50 Kilovolt und 10 Watt, um die tomographischen Datensätze zu erfassen. Die Röntgenbilder aus dem Scan werden automatisch von einer hardwarebasierten Projektionsrekonstruktionssoftware rekonstruiert, die vom Mikro-CT-System bereitgestellt wird, wodurch eine Bildserie von 16-Bit-Axialschnitten erzeugt wird.
Im Lugolschen Jodkontrast zeigte die Mikro-CT ausreichend detektierte CCM-Läsionen. Gescannte Röntgenbilder wurden rekonstruiert, um 3D-Bilder des Mäusegehirns zu erstellen, die die Visualisierung ganzer Läsionen im Hirnparenchym in verschiedenen Tiefen und Orientierungen und die Beurteilung der Struktur in der 3D-Lokalisation von Läsionen im Gehirn ermöglichten. Diese Tabelle zeigt ein Beispiel für die quantitative Ausgabe der markierten einzelnen Läsionen.
Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik Forschern auf dem Gebiet der Gefäßerkrankungen den Weg, um Mechanismen und therapeutische Optionen für zerebrale kavernöse Malformationen in Mausmodellen zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man CCM-Läsionen in Mausmodellen induziert und wie man die CCM-Läsionslast mit der Mikro-CT-Technik erfasst und analysiert.
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Überblick
Dieses Protokoll demonstriert die Induktion der zerebralen kavernösen Malformationskrankheit bei neonatalen Mäusen und nutzt Mikro-CT zur Messung der Läsionslast. Diese Methode verbessert das Verständnis der molekularen Grundlagen und potenzieller Therapien für zerebrale kavernöse Malformationen und andere zerebrovaskuläre Erkrankungen.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Gefäßbiologie
- Mausmodelle
Hintergrund
- Zerebral kavernöse Malformationen (CCMs) sind vaskuläre Läsionen, die zu erheblichen neurologischen Problemen führen können.
- Bestehende Methoden zur Messung der Krankheitslast bei Mausmodellen sind oft ineffizient.
- Mikro-CT bietet eine nicht-invasive Möglichkeit, Läsionen zu visualisieren und zu quantifizieren.
- Das Verständnis von CCMs kann Einblicke in andere zerebrovaskuläre Erkrankungen liefern.
Zweck der Studie
- Induktion zerebraler kavernöser Malformationen bei neonatalen Mäusen.
- Genaue Messung der Krankheitslast mittels Mikro-CT.
- Verbesserung der Methoden zur Untersuchung zerebrovaskulärer Erkrankungen.
Verwendete Methoden
- Auflösen von 4-HT in Ethanol zur Herstellung einer Lösung zur Induktion von CCMs.
- Herstellung von Aliquots zur Lagerung bei -80 Grad Celsius.
- Nutzung kontrastverstärkter Mikro-CT für die Bildgebung.
- Visuelle Demonstration des Induktions- und Analyseprozesses.
Hauptergebnisse
- Die Methode ermöglicht eine genaue und effiziente Bestimmung der CCM-Krankheitslast.
- Mikro-CT bietet eine klare Visualisierung von Läsionen in den Mausmodellen.
- Die Induktion von CCMs wurde erfolgreich bei neonatalen Mäusen erreicht.
- Dieser Ansatz kann weitere Forschung zu potenziellen Therapien erleichtern.
Schlussfolgerungen
- Dieses Protokoll erhöht den Wert von Mausmodellen für die Untersuchung von CCMs.
- Mikro-CT ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Bewertung der Last zerebrovaskulärer Erkrankungen.
- Zukünftige Studien können auf dieser Methodik aufbauen, um therapeutische Optionen zu erkunden.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Quantitative micro-CT imaging of cerebral cavernous malformations (CCMs) in genetically engineered mouse models enables precise assessment of lesion burden, supporting mechanistic de-risking and target validation in cerebrovascular disease research. This approach enhances predictive confidence for early-stage therapeutic hypothesis testing and informs portfolio triage by providing robust, reproducible lesion quantification. Integration of high-resolution imaging with genetic disease models positions this workflow as a critical inflection point for translational continuity in vascular biology pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables rigorous interrogation of CCM gene function and pathway involvement in disease models.
- Supports biological de-risking by quantifying lesion formation following targeted gene deletion.
- Provides functional target validation through direct measurement of disease-relevant phenotypes.
- Facilitates predictive confidence in selecting or deprioritizing molecular targets for further study.
Screening & Assay Development
- Establishes validated mouse models and imaging protocols for downstream compound screening.
- Delivers standardized, quantitative lesion metrics suitable for assay development and reproducibility assessment.
- Enables scalable, high-throughput evaluation of therapeutic interventions in preclinical settings.
- Supports reliable comparison of experimental conditions through consistent imaging outputs.
Translational & Preclinical Research
- Aligns preclinical models with human disease genetics for translational biomarker development.
- Ensures continuity from genetic discovery to preclinical validation of therapeutic hypotheses.
- Reduces translational risk by providing quantitative endpoints for disease progression and intervention efficacy.
- Strengthens mechanistic understanding of cerebrovascular pathology relevant to clinical translation.
Pipeline & Workflow Integration
This method bridges early discovery and preclinical research by enabling hypothesis-driven genetic manipulation and quantitative phenotyping in mouse models, supporting lead identification and translational biomarker alignment.
- Discovery Biology: Facilitates null hypothesis testing and pathway clarification through genetic lesion induction and quantification.
- Screening: Provides reproducible, quantitative imaging outputs for assay readiness and compound evaluation.
- Analytics: Delivers volumetric and numerical lesion data to support statistical comparison across experimental groups.
- Translational Research: Connects genetic models to disease-relevant endpoints for preclinical continuity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging and analysis platform for diverse cerebrovascular research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes lesion quantification and imaging workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by providing robust preclinical data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of vascular disease programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in genetic mouse model handling and micro-CT imaging protocols.
- Demands access to high-resolution micro-CT instrumentation and specialized analysis software.
- Necessitates cross-team standardization of imaging parameters and data interpretation.
- May require adaptation of protocols for different genetic backgrounds or lesion types.
- Dependent on precise sample preparation and imaging conditions to ensure data quality.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:57
Induction of Cerebral Cavernous Malformations in Mouse Models
1:38
Sample Preparation for Micro-CT Scans
3:15
Micro-CT Scan of CCM in the Neonatal Mouse Brain
3:57
Results: Rendered 3-D Images Showing CCM Lesions in the Neonatal Mouse
4:34
Conclusion
