Induktion und Mikro-CT-Bildgebung des zerebralen höhlenartigen Fehlbildungen im Mausmodell
4. September 2017
Dieses Protokoll zeigt die Induktion der zerebralen höhlenartigen Fehlbildung Krankheit in einem Mausmodell und Verwendungen Kontrast verstärkt Mikro-Computertomographie um Läsion Belastung zu messen. Diese Methode steigert den Wert der etablierten Mausmodelle, die molekularen Grundlagen und mögliche Therapien für zerebrale höhlenartigen Missbildungen und anderen zerebrovaskulären Krankheiten zu studieren.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, zerebrale kavernöse Fehlbildungen bei neonatalen Mäusen zu induzieren und die Krankheitslast mittels Mikro-CT zu messen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der zerebralen Gefäßerkrankungen, wie z. B. zerebrale kavernöse Malformationen, zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Krankheitslast der zerebralen kavernösen Malformation in neonatalen Mausmodellen im Vergleich zu bestehenden Methoden genau und effizient bestimmt werden kann.
Dievisuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Induktion von zerebralen kavernösen Malformationen und Mikro-CT-Analyseschritten schwer zu erlernen sind, da sie Erfahrung und den Einsatz ausgefeilter Software erfordert. Beginnen Sie mit dem Auflösen von 4-HT in 100%igem Ethanol bis zu einer Konzentration von 10 Milligramm pro Milliliter. Bereiten Sie 30 Mikroliter Alaquads vor und lagern Sie sie dann bei minus 80 Grad Celsius.
Verdünnen Sie das Alaquad am Tag der Anwendung bei 4-HT in Maisöl auf 0,5 Milligramm pro Milliliter. Verwenden Sie dann eine Insulinspritze, um 50 Mikroliter 4-HT in P1-Neugeborene zu injizieren, um experimentelle CCM-Läsionen zu induzieren. Beginnen Sie die Probenvorbereitung, indem Sie eine 10-Milliliter-Spritze, die mit einer 29-Gauge-Nadel ausgestattet ist, mit drei Millilitern 2 % Paraformaldehyd und PBS füllen.
Führen Sie dann eine intrakardiale Profusion bei euthenisiertem P8-Welpen durch, indem Sie die Nadel in den Ventrikel des Mausherzens einführen und langsam das volle Volumen an Paraformaldehyd injizieren. Nachdem Sie den Kopf mit einer Schere abgenommen haben, entfernen Sie die Haut vom Kopf und schälen Sie den Schädel mit einer Pinzette ab, um das gesamte Gehirn in 4% Paraformaldehyd und PBS zu zerlegen. Nach der Befestigung des Gehirns über Nacht bei 4 Grad Celsius.
Am nächsten Tag wird das Hinterhirn mit einer Pinzette abgetrennt und mit PBS-Lösung gespült. Dann inkubieren Sie das Hinterhirn 48 Stunden lang in Lugols Jodlösung. Trocknen Sie das Hinterhirn nach der Inkubation kurz an der Luft, um überschüssige Lugolsche Jodlösung zu entfernen.
Verpacken Sie dann das jodgefärbte Hinterhirn von Lugol in 0,65-Mikroliter-Mikrozentrifugenröhrchen und verschließen Sie es vollständig mit Kunststoffparaffinfolie, um ein Schrumpfen des Gewebes zu vermeiden. Legen Sie die Mikrozentrifugenröhrchen in Fünf-Milliliter-Plastikröhrchen mit Schwämmen, um zu verhindern, dass sie sich während des Scans bewegen. Montieren Sie den Schlauch mit dem Hinterhirn vertikal auf einer Aluminiumhalterung im Mikro-CT-System.
Legen Sie die Scan-Parameter fest. Verwenden Sie 540 Projektionen und eine Belichtungszeit von zwei Sekunden mit Quellenbedingungen von 50 Kilovolt und 10 Watt, um die tomographischen Datensätze zu erfassen. Die Röntgenbilder aus dem Scan werden automatisch von einer hardwarebasierten Projektionsrekonstruktionssoftware rekonstruiert, die vom Mikro-CT-System bereitgestellt wird, wodurch eine Bildserie von 16-Bit-Axialschnitten erzeugt wird.
Im Lugolschen Jodkontrast zeigte die Mikro-CT ausreichend detektierte CCM-Läsionen. Gescannte Röntgenbilder wurden rekonstruiert, um 3D-Bilder des Mäusegehirns zu erstellen, die die Visualisierung ganzer Läsionen im Hirnparenchym in verschiedenen Tiefen und Orientierungen und die Beurteilung der Struktur in der 3D-Lokalisation von Läsionen im Gehirn ermöglichten. Diese Tabelle zeigt ein Beispiel für die quantitative Ausgabe der markierten einzelnen Läsionen.
Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik Forschern auf dem Gebiet der Gefäßerkrankungen den Weg, um Mechanismen und therapeutische Optionen für zerebrale kavernöse Malformationen in Mausmodellen zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man CCM-Läsionen in Mausmodellen induziert und wie man die CCM-Läsionslast mit der Mikro-CT-Technik erfasst und analysiert.
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Übersicht
Dieses Protokoll demonstriert die Induktion der zerebralen kavernösen Malformation bei neugeborenen Mäusen und nutzt die Mikro-CT, um die Läsionslast zu messen. Diese Methode verbessert das Verständnis der molekularen Grundlagen und potenzieller Therapien für die zerebrale kavernöse Malformation und andere zerebrovaskuläre Erkrankungen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Wissenschaft der Gefäbiologie
- Mausmodelle
Hintergrund
- Zerebrale kavernöse Malformationen (CCMs) sind vaskuläre Läsionen, die zu erheblichen neurologischen Problemen führen können.
- Bestehende Methoden zur Bestimmung der Krankheitslast in Mausmodellen sind oft ineffizient.
- Mikro-CT bietet eine nichtinvasive Möglichkeit, Läsionen sichtbar zu machen und zu quantifizieren.
- Das Verständnis von CCMs kann Einblicke in andere zerebrovaskuläre Erkrankungen liefern.
Zweck der Studie
- Induktion zerebraler kavernöser Malformationen bei neugeborenen Mäusen.
- Genaue Messung der Krankheitslast mittels Mikro-CT.
- Verbesserung der Methoden zur Erforschung zerebrovaskulärer Erkrankungen.
Verwendete Methoden
- Lösen von 4-HT in Ethanol, um eine Lösung zur Induktion von CCMs herzustellen.
- Herstellung von Aliquots zur Lagerung bei -80 Grad Celsius.
- Verwendung von kontrastverstärkter Mikro-CT zur Bildgebung.
- Visuelle Demonstration des Induktions- und Analyseprozesses.
Hauptergebnisse
- Die Methode ermöglicht eine genaue und effiziente Bestimmung der CCM-Krankheitslast.
- Mikro-CT bietet eine klare Visualisierung der Läsionen in den Mausmodellen.
- Die Induktion von CCMs wurde erfolgreich bei neugeborenen Mäusen erreicht.
- Dieser Ansatz kann die weitere Erforschung potenzieller Therapien erleichtern.
Schlussfolgerungen
- Dieses Protokoll erhöht den Wert von Mausmodellen für die Untersuchung von CCMs.
- Mikro-CT ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Beurteilung der zerebrovaskulären Krankheitslast.
- Zukünftige Studien können auf dieser Methodik aufbauen, um therapeutische Optionen zu erforschen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die quantitative Mikro-CT-Bildgebung zerebraler kavernöser Malformationen (CCMs) in genetisch veränderten Mausmodellen ermöglicht eine präzise Beurteilung der Läsionslast und unterstützt dadurch die Aufklärung von Wirkmechanismen sowie die Validierung von Zielstrukturen in der Forschung zu zerebrovaskulären Erkrankungen. Dieser Ansatz erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Testung therapeutischer Hypothesen in frühen Entwicklungsstadien und unterstützt die Priorisierung von Forschungsprojekten, indem er eine robuste und reproduzierbare Quantifizierung von Läsionen bereitstellt. Die Kombination hochauflösender Bildgebung mit genetischen Krankheitsmodellen stellt diesen Arbeitsablauf als entscheidenden Wendepunkt für die translationale Durchgängigkeit in der vaskulären Biologie dar.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht eine gründliche Untersuchung der Genfunktion von CCM und deren Beteiligung an Signalwegen in Krankheitsmodellen.
- Unterstützt die biologische Risikominderung durch Quantifizierung der Läsionsbildung nach gezielter Genlöschung.
- Bietet funktionelle Zielvalidierung durch direkte Messung krankheitsrelevanter Phänotypen.
- Erleichtert eine vorhersagebasierte Zuversicht bei der Auswahl oder Herabstufung molekularer Zielstrukturen für weitere Untersuchungen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Etabliert validierte Mausmodelle und Bildgebungsprotokolle für die nachgeschaltete Wirkstoff-Screening.
- Liefert standardisierte, quantitative Läsionsmetriken, die für die Assay-Entwicklung und die Beurteilung der Reproduzierbarkeit geeignet sind.
- Ermöglicht eine skalierbare, hochdurchsatzfähige Bewertung therapeutischer Interventionen in präklinischen Umgebungen.
- Unterstützt den zuverlässigen Vergleich experimenteller Bedingungen durch konsistente Bildgebungsergebnisse.
Translationale und präklinische Forschung
- Verknüpft präklinische Modelle mit der Humangenetik von Erkrankungen zur Entwicklung translationaler Biomarker.
- Stellt eine lückenlose Übertragung von genetischen Erkenntnissen bis zur präklinischen Validierung therapeutischer Hypothesen sicher.
- Verringert das Übersetzungsrisiko, indem quantitative Endpunkte für den Krankheitsverlauf und die Wirksamkeit von Interventionen bereitgestellt werden.
- Vertieft das mechanistische Verständnis zerebrovaskulärer Pathologien im Hinblick auf die klinische Übertragung.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese Methode verbindet die frühe Entdeckungsforschung mit der präklinischen Forschung, indem sie hypothesengetriebene genetische Modifikationen und quantitative Phänotypisierung in Mausmodellen ermöglicht und somit die Identifizierung von Leitstrukturen sowie die Abstimmung translationaler Biomarker unterstützt.
- Entdeckungsbiologie: Ermöglicht die Überprüfung von Nullhypothesen und die Aufklärung von Signalwegen durch die Induktion und Quantifizierung genetischer Läsionen.
- Screening: Bietet reproduzierbare, quantitative Bildgebungsdaten zur Beurteilung der Assaytauglichkeit und zur Evaluierung von Substanzen.
- Analytik: Liefert volumetrische und numerische Läsionsdaten zur Unterstützung statistischer Vergleiche zwischen experimentellen Gruppen.
- Translationale Forschung: Verbindet genetische Modelle mit krankheitsrelevanten Endpunkten, um die präklinische Kontinuität sicherzustellen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform für Bildgebung und Analyse in unterschiedlichen Programmen der zerebrovaskulären Forschung.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Unschärfen bei der Zielvalidierung.
- Operationaler Wert: Standardisiert die Quantifizierung von Läsionen und die bildgebenden Arbeitsabläufe, um Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit zu gewährleisten.
- Strategischer Wert: Unterstützt Go/No-Go-Entscheidungen und verbessert die Kapitalnutzungseffizienz durch robuste präklinische Daten.
- Portfolio-Wirkung: Fördert die risikoadjustierte Priorisierung und Weiterentwicklung von Programmen zu Gefäßerkrankungen.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse im Umgang mit genetischen Mausmodellen und in Mikro-CT-Bildgebungsprotokollen.
- Benötigt Zugang zu hochauflösenden Mikro-CT-Geräten und spezialisierter Analyse-Software.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise bei Bildgebungsparametern und Dateninterpretation über mehrere Arbeitsgruppen hinweg.
- Kann eine Anpassung der Protokolle an verschiedene genetische Hintergründe oder Läsionstypen erfordern.
- Hängt von einer präzisen Probenvorbereitung und Bildgebungsbedingungen ab, um die Datenqualität sicherzustellen.
Biopharma-Häufig gestellte Fragen
Chapters in this video
0:05
Title
0:57
Induction of Cerebral Cavernous Malformations in Mouse Models
1:38
Sample Preparation for Micro-CT Scans
3:15
Micro-CT Scan of CCM in the Neonatal Mouse Brain
3:57
Results: Rendered 3-D Images Showing CCM Lesions in the Neonatal Mouse
4:34
Conclusion
