4.9: FM-Farbstoffe im Vesikel-Recycling

FM-Farbstoffe sind Membranfarbstoffe, die häufig zur Abbildung des Vesikelrecyclings verwendet werden. Dabei handelt es sich um den Prozess, bei dem eine Zelle aus ihrer eigenen Membran Vesikel bildet, um die Zellgröße zu erhalten, teure Proteine wiederzuverwenden und anschließend Moleküle in den extrazellulären Raum zu transportieren. Dieser Prozess wird am häufigsten an neuronalen Synapsen untersucht, wo er an der Freisetzung von Neurotransmittern beteiligt ist. Neben der Untersuchung des Vesikelrecyclings werden FM-Farbstoffe verwendet, um verschiedene andere Phänomene zu untersuchen, wie z. B. die Sekretion in chromaffinen Zellen und die Reparatur von Zellmembranen nach Verletzungen.

Dieses Video konzentriert sich auf die Verwendung von FM-Farbstoffen in einem Experiment zur Untersuchung des Vesikelrecyclings. Wir gehen auf ein Schritt-für-Schritt-Protokoll ein, das FM-Farbstoffe verwendet, um den Recyclingprozess in stimulierten Neuronen zu quantifizieren. Zuletzt werden wir einige Beispielexperimente betrachten, die dieses einzigartige Molekül auf unterschiedliche Weise nutzen.

Bevor wir uns in das Verfahren stürzen, wollen wir zunächst die biochemischen Eigenschaften von FM-Farbstoffen überprüfen, die uns helfen werden, ihre Funktion in Vesikelrecycling-Experimenten zu verstehen.

Strukturell gesehen handelt es sich bei FM-Farbstoffen um Styrylmoleküle, die ihren Namen von dem Wissenschaftler ableiten, der sie synthetisiert hat? Fei Mao. Diese Farbstoffe haben drei Hauptstrukturmerkmale: Kopf, Schwanz und Brücke. Die Brücke besteht aus zwei aromatischen Ringen mit einem variablen Doppelbindungsbereich zwischen ihnen. Dieser gesamte Abschnitt erzeugt das Fluorophor.

Es liegt in der Natur eines jeden Fluorophors, dass seine Atome, wenn sie von einfallendem Licht einer bestimmten Anregungswellenlänge getroffen werden, diese Energie absorbieren und seine Elektronen in einen angeregten Zustand anheben. Diese Elektronen kehren in den Grundzustand zurück, indem sie Energie schwingungsmäßig und schließlich als Licht einer Emissionswellenlänge abgeben. Der hydrophobe Schwanz ermöglicht es dem FM-Molekül, sich in die Lipiddoppelschichten der Zellmembran aufzuteilen, und sein hydrophiler Kopf hat eine Ladung, die seine Lokalisierung auf das äußere Membransegel beschränkt.

Daher kann es nur über die Endozytose in die Zelle gelangen. FM-Farbstoffe sind akut umweltempfindlich und zeigen eine schwache Fluoreszenz in polaren Lösungsmitteln, aber eine starke Fluoreszenz in hydrophoben Umgebungen wie Membranen. Dadurch entsteht eine kontrastreiche Membranmarkierung, die mit einem Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht und quantifiziert werden kann.

Aufgrund dieser Eigenschaften eignen sich FM-Farbstoffe besonders für die Beurteilung des Vesikelrecyclings an Synapsen. Kurz gesagt, der Prozess beinhaltet die Inkubation der Kulturen mit FM-Farbstoff. Ein Teil der FM-Moleküle wird an die Membranen gebunden, wodurch ihre Fluoreszenzintensität deutlich erhöht wird. Als nächstes initiiert ein Reiz den Internalisierungsprozess der Membran. Daher werden einige FM-Moleküle in der Vesikelmembran eingeschlossen und der Rest der äußeren lokalisierten Farbstoffmoleküle wird weggespült.

Bei der zweiten Stimulation verschmelzen internalisierte gefärbte Vesikel mit der Zellmembran, um ihren Inhalt freizusetzen, und der Farbstoff departitioniert sich schnell, was zu einer raschen Abnahme der Fluoreszenzintensität führt. Diese Entfärbung kann mit Hilfe eines Fluoreszenzmikroskops quantifiziert werden.

Nachdem Sie nun mit den biochemischen Prinzipien von FM-Farbstoffen vertraut sind, sehen wir uns ein Verfahren an, wie Sie ein Experiment durchführen, das das Recycling von synaptischen Vesikeln mit diesen Farbstoffen untersucht.

Saubere, gesunde Proben von neuronalen Kulturen auf Deckgläsern werden im Vorfeld vorbereitet. Diese Zellen werden in eine FM-Farbstofflösung gebracht, wodurch die Membranen markiert werden. Das Deckglas der Probe wird dann auf die Bildgebungskammer des Mikroskops montiert.

Um Flüssigkeitsmanipulationen wie Waschvorgänge zu ermöglichen, sind Flüssigkeitszu- und -ausgangsleitungen zu einer versiegelten Perfusionskammer verbunden. Montieren Sie die Kammer auf dem Tisch eines Fluoreszenzmikroskops. Befestigen Sie Drähte an der Kammer und verbinden Sie sie mit dem elektrischen Stimulator. Nach dem Anbringen werden die Anregungs- und Emissionsfilter entsprechend dem verwendeten FM-Farbstoff eingestellt.

Die Farbstoffbeladung in Vesikel über Endozytose wird durch eine elektrische Stimulation induziert. Nach der Stimulation können sich die Nervenenden erholen. Dann wird der extrazelluläre Farbstoff mit Puffer abgewaschen; Dadurch wird auch die Hintergrundfluoreszenz minimiert. Es ist wichtig, die Anregungsintensität minimal zu halten, da FM-Farbstoffe anfällig für Photobleichung sind, d. h. eine Schwächung der Fluoreszenzintensität aufgrund längerer Anregung. Nach der kurzen Inkubation werden erste Bilder aufgenommen. Als nächstes wird die Exozytose mit einem zweiten elektrischen Signal induziert.

Nach der Messung der Fluoreszenz zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Stimulation können die Nervenendigungen am Ende erschöpfend stimuliert werden, um alle freisetzbaren Farbstoffe zu entladen. Die danach verbleibende Fluoreszenz wird als Hintergrundfluoreszenzintensität betrachtet. Dann wird die intrinsische Fluoreszenz jedes Bildes mit dem ? Region von Interesse? in einem nicht-synaptischen Bereich des Bildes. Die Hintergrundfluoreszenz und die intrinsische Fluoreszenz werden dann von der Fluoreszenzintensität jedes Zeitpunkts subtrahiert, um eine normalisierte Fluoreszenzintensität zu erhalten, die dann über die Zeit aufgetragen wird. Die Abnahme der Intensität im Laufe der Zeit stellt die Entfärbung dar, die ein indirektes Maß für das Vesikelrecycling ist.

Nachdem wir nun die Methodik überprüft haben, schauen wir uns an, wie FM-Farbstoffe in bestimmten Experimenten verwendet werden.

Wir diskutierten das Protokoll mit FM-Farbstoffen in stimulierten Neuronen. Hier interessierten sich die Wissenschaftler für die Untersuchung des spontanen Vesikelrecyclings. Sie taten dies unter Verwendung des etablierten Protokolls in Kombination mit einem Bildgebungssystem, das empfindlich genug ist, um kleine Änderungen der Fluoreszenzintensität zu erkennen. Die Ergebnisse stellen eine Abnahme der Fluoreszenzintensität dar, die direkt auf die spontane synaptische Freisetzung zurückzuführen ist.

Innerhalb des präsynaptischen Neurons sind Vesikel in zwei Pools unterteilt: einen Reservepool oder RP und einen leicht freisetzbaren Pool oder RRP. Hier verwendeten die Wissenschaftler FM-Farbstoffe, um den Anteil jedes Typs in der Vesikelpopulation zu analysieren. Durch sequentielle Anwendung von elektrischen Stimuli mit zunehmender Intensität waren diese Wissenschaftler in der Lage, die relativen Prozentsätze der einzelnen Arten von Vesikelbecken zu quantifizieren.

Schließlich verwenden Zellbiologen auch FM-Farbstoffe, um Faktoren zu analysieren, die an der exozytären Reparatur verwundeter Plasmamembranen beteiligt sind. In diesem Experiment konzentrierten sich die Forscher insbesondere auf die Rolle der Sphingomyelinase, eines lipidmodifizierenden Enzyms, bei der Wiederversiegelung der Membran. Zunächst erzeugten sie mit Hilfe einer Silencing-RNA-Behandlung Zellen, denen das Enzym Sphingomyelinase fehlte. Anschließend behandelten sie diese Zellen und eine Kontrollgruppe mit exogenem FM-Farbstoff und einem Toxin, das Plasmamembranläsionen erzeugt. Schließlich betrachteten sie alle Proben mit einem konfokalen Mikroskop. Die Ergebnisse zeigten, dass Sphingomyelinase-defiziente Zellen eine robuste Akkumulation von intrazellulären FM-Molekülen zeigten. Auf der anderen Seite zeigten Kontrollzellen einen minimalen FM-Einstrom, was auf eine Rolle der Sphingomyelinase bei der Reparatur der Plasmamembran hindeutet.

Sie haben gerade das Video von JoVE über FM-Farbstoffe im Vesikelrecycling gesehen. Das Video beschrieb die Biochemie von FM-Farbstoffen, beschreibt ein Protokoll zur Färbung und Quantifizierung des synaptischen Vesikelrecyclings und skizziert schließlich aktuelle Experimente, bei denen diese Farbstoffe auf unterschiedliche Weise verwendet werden. Wie immer vielen Dank fürs Zuschauen!