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FM-Farbstoffe im Vesikel-Recycling

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FM Dyes in Vesicle Recycling

4.8: Cell-surface Biotinylation Assay

4.13: An Introduction to Cell Death

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08:36 min

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April 30, 2023

Overview

FM-Farbstoffe sind eine Klasse von fluoreszierende Moleküle, die wichtige Verwendung gefunden hat, bei der Untersuchung der Vesicle recycling-Prozess. Durch eine chemische Struktur können sich diese Moleküle in der äußeren Broschüre Phospholipid Bilayer Membranen einfügen. Nach Membran einsetzen werden sie in die Zelle über Endocytosed Vesikel verinnerlicht und freigegeben, wenn diese Bläschen zurück, die Membran recyceln. Da diese Farbstoffe fluoreszieren stark in die hydrophobe Umgebung innerhalb von Membranen und schwach in der extrazellulären Kompartiment, FM-Fluoreszenz-Ebenen können verwendet werden, um vesikuläre Aktivitäten während des recycling-Prozesses zu verfolgen.

Dieses Video bietet eine Einführung in die Verwendung von FM Farbstoffen in Experimenten Vesicle recycling untersuchen soll. Wir überprüfen zunächst die Biochemie des FM Farbstoffe und wie deren Eigenschaften erlauben ihre Verwendung in diesen Experimenten. Wir gehen dann durch ein allgemeines Protokoll für die Verwendung von FM-Farbstoffe in solchen Studien, und schließlich diskutieren einige neuere Forschungen, dass diese einzigartige Moleküle verwendet.

Procedure

FM-Farbstoffe sind Membran-Farbstoffe, die zum Bild Vesicle recycling weit verbreitet sind. Dies ist der Prozess, durch den eine Zelle Bläschen aus eigener Membran Zellengröße zu bewahren bildet, teure Proteine wiederverwenden und nacheinander transportieren Moleküle in den extrazellulären Raum. Dieser Prozess wird am häufigsten bei neuronalen Synapsen untersucht wo es die Freisetzung von Neurotransmittern beteiligt ist. Neben der Prüfung Vesicle recycling, sind FM Farbstoffe verwendet, um mehrere andere Phänomene, wie z. B. Sekretion in chromaffin Zellen und Zellmembranen Reparatur nach Verletzung zu studieren.

Dieses Video konzentriert sich auf die Verwendung von FM-Farbstoffe in einem Experiment studiert Vesicle recycling. Wir gehen über eine Schritt für Schritt-Protokoll, die FM Farbstoffe verwendet, um den recycling-Prozess in stimulierte Nervenzellen zu quantifizieren. Zu guter Letzt werden wir einige Beispiel-Experimente, überprüfen die dieses einzigartige Molekül auf unterschiedliche Weise nutzen.

Vor dem Sprung in das Verfahren, betrachten wir zunächst die biochemischen Eigenschaften des FM-Farbstoffe, die uns ihre Funktion im Vesicle recycling Experimente zu verstehen helfen wird.

Strukturell, FM Farbstoffe sind Styryl-Moleküle, die ihren Namen von der Wissenschaftler abgeleitet, die sie synthetisiert — Fei Mao. Diese Farbstoffe haben drei wesentliche Strukturmerkmale: Kopf, Schweif und Brücke. Die Brücke besteht aus zwei aromatischen Ringen mit einer Variablen Doppelbindung Region zwischen ihnen. Dieser gesamte Abschnitt schafft das Fluorophor.

Es ist die Natur von jedem Fluorophor, dass wenn durch ankommende Licht bei einer bestimmten Wellenlänge der Erregung geschlagen, seine Atome die Energie absorbieren und seine Elektronen in einen angeregten Zustand erhöhen. Diese Elektronen zurück in den Grundzustand durch emittierende Energie schwingungsmäßig, und schließlich als Licht einer Emissionswellenlänge. Das hydrophobe Ende ermöglicht das FM-Molekül auf Partition in Lipid Bilayer der Zellmembran, und den hydrophilen Kopf hat eine Ladung, die seine Lokalisierung in der äußeren Membran Broschüre einschränkt.

Daher ist die einzige Möglichkeit, es in die Zelle gehen über Endozytose. FM-Farbstoffe sind akut empfindlich und zeigen schwache Fluoreszenz in polaren Lösungsmitteln, aber starke Fluoreszenz in hydrophobe Umgebung wie Membranen. So entstehen kontrastreiche Beschriftung Membran, die visualisiert werden können und quantifizierte mit einem Fluoreszenzmikroskop.

Diese Eigenschaften machen FM Farbstoffe speziell geeignet, um Vesicle recycling an Synapsen zu beurteilen. Kurz, umfasst der Inkubation der Kulturen mit FM-Farbstoff. Einige der FM Moleküle erhalten Sie zu den Membranen, die ihre Fluoreszenz-Intensitäten erhöht angebracht. Als nächstes startet ein Reiz Internalisierung Membranverfahren. Daher einige FM-Moleküle in der Membran Vesikel gefangen sind, und der Rest der äußeren lokalisierte Farbstoffmoleküle werden weggespült.

Zweite Stimulation verinnerlichten gefärbten Vesikel verschmelzen mit der Zellmembran, deren Inhalte zu veröffentlichen, und der Farbstoff schnell departitions, was zu einem raschen Rückgang der Fluoreszenzintensität. Diese entfärben kann mit Hilfe eines Fluoreszenzmikroskops quantifiziert werden.

Nun, da Sie vertraut mit den biochemischen Prinzipien der FM Farbstoffe sind, betrachten wir ein Verfahren zum Durchführen eines Experiments Prüfung synaptischen Vesikel recycling mit diesen Farbstoffen.

Saubere, gesunde Proben von neuronalen Kulturen auf Deckgläsern sind im Voraus vorbereitet. Diese Zellen werden in einer Farbstofflösung FM, wodurch die Membranen zu etikettierenden verschoben. Die Probe-Deckglas wird dann auf der bildgebenden Kammer des Mikroskops montiert.

Um flüssige Manipulationen wie Waschungen, Fluid-Eingang und Ausgang zu ermöglichen sind Linien angebracht, um eine versiegelte Perfusion Kammer bilden. Montieren Sie die Kammer auf die Bühne ein Fluoreszenzmikroskop. Die Kammer beimessen Sie Drähte und verbinden Sie sie mit dem elektrischen Stimulator. Einmal befestigt, werden die Anregung und Emission Filter entsprechend der FM-Farbstoff verwendet festgelegt.

Farbstoff in den Vesikeln über Endozytose laden wird mit Hilfe einer elektrischen Stimulation induziert. Nach der Stimulation dürfen Nervenausgänge zu erholen. Dann wird die extrazelluläre Farbstoff mit Puffer abgewaschen; Dies minimiert auch die Hintergrundfluoreszenz. Es ist wichtig, die Intensität der Erregung minimum zu beschränken, weil FM Farbstoffe sind anfällig für Immunofluoreszenz, die Fluoreszenz-Intensität aufgrund längerer Erregung schwächer wird. Nach der kurzen Inkubation werden Anfangsbilder gewonnen. Als nächstes wird mit einem zweiten elektrischen Signal Exozytose induziert.

Nach der Messung der Fluoreszenz zu verschiedenen Zeitpunkten nach Stimulation, am Ende, können Nervenausgänge erschöpfend stimuliert werden, alle lösbaren Farbstoff zu entladen. Die danach verbleibende Fluoreszenz gilt als der Hintergrund Fluoreszenzintensität. Dann wird intrinsische Fluoreszenz eines jeden Bildes gemessen mit dem Tool “Region of Interest” in einer nicht-synaptischen Bereich des Bildes. Die Hintergrundfluoreszenz und die intrinsische Fluoreszenz ist dann zum Abtragen von der Fluoreszenzintensität jeden Zeitpunkt normalisierte Fluoreszenzintensität zu erhalten, die dann über der Zeit aufgetragen wird. Der Rückgang der Intensität im Laufe der Zeit stellt Entfärben, das ist eine indirekte Messung von Vesicle recycling.

Nun, da wir die Methodik überprüft haben, schauen Sie wie FM Farbstoffe in bestimmten Experimenten verwendet werden.

Wir diskutierten das Protokoll mit FM Farbstoffe in stimulierte Nervenzellen. Hier interessierten Wissenschaftler studieren, spontane Vesicle recycling. Sie taten dies mit dem etablierten Protokoll in Kombination mit ein bildgebendes System empfindlich genug, um kleine Änderungen in der Fluoreszenzintensität erkennen. Die Ergebnisse stellen einen Rückgang der Fluoreszenzintensität, die direkt durch spontane synaptischen Freisetzung ist.

Innerhalb des präsynaptischen Neurons Vesikel gliedern sich in zwei Pools: einen Reserve-Pool oder RP, und einen leicht lösbaren Pool RRP. Hier verwendeten die Wissenschaftler FM Farbstoffe, um den Anteil der einzelnen Arten in der Vesikel-Bevölkerung zu analysieren. Diese Wissenschaftler konnten durch sequentielle Anwendung von elektrischen Reizen der zunehmenden Intensität die relativen Anteile der einzelnen Arten von Vesikel Pool zu quantifizieren.

Zu guter Letzt Zellbiologe auch FM Farbstoffe um Faktoren bei der Exocytic-Reparatur von Verwundeten Plasmamembranen zu sezieren. In diesem Experiment konzentrierten sich die Forscher besonders über die Rolle der Sphingomyelinase, ein Lipid-modifizierende Enzym, das in der Membran resealing Prozess. Zuerst erzeugt sie Zellen einen Mangel an Enzyms Sphingomyelinase mit Hilfe der RNA-Behandlung zum Schweigen zu bringen. Als nächstes behandelt sie diese Zellen und einer Kontrollgruppe mit exogenen FM Farbstoff und ein Toxin, die schafft der Plasmamembran Läsionen. Schließlich sahen sie alle Proben, die mit einem konfokalen Mikroskop. Die Ergebnisse zeigten, dass Sphingomyelinase mangelhaft Zellen robuste Anhäufung von intrazellulären FM Moleküle zeigten. Auf der anderen Seite zeigte Kontrollzellen minimal FM Zustrom, was eine Rolle Sphingomyelinase in der Plasmamembran Reparatur.

Sie haben nur Jupiters Video auf FM Farbstoffe im Vesicle recycling angesehen. Das Video beschrieben die Biochemie des FM-Farbstoffe, detaillierte ein Protokoll zum Färben und synaptischen Vesikel recycling zu quantifizieren und schließlich skizziert aktuelle Experimente unter Verwendung dieser Farbstoffe in unterschiedlicher Weise. Wie immer vielen Dank für das ansehen!

Transcript

FM dyes are membrane dyes that are widely used to image vesicle recycling. This is the process by which a cell forms vesicles from its own membrane to preserve cell size, reuse expensive proteins, and consecutively transport molecules to the extracellular space. This process is most commonly studied at neuronal synapses, where it’s involved in release of neurotransmitters. In addition to examining vesicle recycling, FM dyes are used to study several other phenomena, such as secretion in chromaffin cells and cell membrane repair following injury.

This video will focus on the use of FM dyes in an experiment studying vesicle recycling. We’ll go over a step-by-step protocol that uses FM dyes to quantify the recycling process in stimulated neurons. Lastly, we will review some example experiments, which utilize this unique molecule in different ways.

Before jumping into the procedure, let’s first review the biochemical properties of FM dyes, which will help us understand their function in vesicle recycling experiments.

Structurally, FM dyes are styryl molecules that derive their name from the scientist who synthesized them—Fei Mao. These dyes have three main structural features: head, tail, and bridge. The bridge consists of two aromatic rings with a variable double bond region between them. This entire section creates the fluorophore.

It is the nature of any fluorophore that when struck by incoming light at a certain excitation wavelength, its atoms absorb that energy and raise its electrons to an excited state. These electrons return to the ground state by emitting energy vibrationally, and finally as light of an emission wavelength. The hydrophobic tail allows the FM molecule to partition into the lipid bilayers of the cell membrane, and its hydrophilic head has a charge that restricts its localization to the outer membrane leaflet.

Therefore, the only way it can go into the cell is via endocytosis. FM dyes are acutely environment sensitive, and show weak fluorescence in polar solvents, but strong fluorescence in hydrophobic environments like membranes. This creates high contrast membrane labeling that can be visualized and quantified using a fluorescence microscope.

These properties make FM dyes specifically suited to assess vesicle recycling at synapses. Briefly, the process involves incubating the cultures with FM dye. Some of the FM molecules get attached to the membranes, which significantly increases their fluorescence intensities. Next, a stimulus initiates the membrane internalization process. Therefore, some FM molecules are trapped in the vesicle membrane, and the rest of the outer localized dye molecules are washed away.

On second stimulation, internalized stained vesicles fuse with the cell membrane to release their contents, and the dye quickly departitions, resulting in a rapid decrease in fluorescence intensity. This destaining can be quantified with the help of a fluorescence microscope.

Now that you’re familiar with the biochemical principles of FM dyes, let’s review a procedure on how to perform an experiment examining synaptic vesicle recycling using these dyes.

Clean, healthy samples of neuronal cultures on coverslips are prepared in advance. These cells are moved to a FM dye solution, causing the membranes to be labeled. The sample coverslip is then mounted onto the imaging chamber of the microscope.

To allow fluid manipulations like washes, fluid input and output lines are attached to form a sealed perfusion chamber. Mount the chamber onto the stage of a fluorescence microscope. Attach wires to the chamber and connect them to the electrical stimulator. Once attached, the excitation and emission filters are set according to the FM dye used.

Dye loading into vesicles via endocytosis is induced using an electrical stimulation. After stimulation, nerve terminals are allowed to recover. Then, extracellular dye is washed off with buffer; this also minimizes the background fluorescence. It is important to keep the excitation intensity minimum because FM dyes are prone to photobleaching, which is weakening of fluorescence intensity due to prolonged excitation. Following the short incubation, initial images are obtained. Next, exocytosis is induced with a second electric signal.

After measuring fluorescence at different time points following stimulation, at the end, nerve terminals can be exhaustively stimulated to unload all releasable dye. The fluorescence remaining after that is considered as the background fluorescence intensity. Then, intrinsic fluorescence of each image is measured using the “Region of Interest” tool in a non-synaptic area of the image. The background fluorescence and the intrinsic fluorescence is then subtracted from the fluorescence intensity of each time point to obtain normalized fluorescence intensity, which is then plotted versus time. The decrease in intensity over time represents destaining, which is an indirect measure of vesicle recycling.

Now that we’ve reviewed the methodology, let’s look at how FM dyes are used in specific experiments.

We discussed the protocol using FM dyes in stimulated neurons. Here, scientists were interested in studying spontaneous vesicle recycling. They did this using the established protocol in combination with an imaging system sensitive enough to detect small changes in fluorescence intensity. The results represent a decrease in fluorescence intensity that is directly due to spontaneous synaptic release.

Within the presynaptic neuron, vesicles are divided into two pools: a reserve pool or RP, and a readily releasable pool or RRP. Here, scientists used FM dyes to analyze the fraction of each type in the vesicle population. By sequential application of electrical stimuli of increasing intensities, these scientists were able to quantify the relative percentages of each type of vesicle pool.

Lastly, cell biologist also use FM dyes to dissect factors involved in the exocytic repair of wounded plasma membranes. In this experiment, researchers were particularly focused on the role of sphingomyelinase, a lipid-modifying enzyme, in the membrane resealing process. First, they generated cells deficient in the enzyme sphingomyelinase with the help of silencing RNA treatment. Next, they treated these cells and a control group with exogenous FM dye and a toxin that creates plasma membrane lesions. Finally, they viewed all the samples using a confocal microscope. The results showed that sphingomyelinase deficient cells showed robust accumulation of intracellular FM molecules. On the other hand, control cells showed minimal FM influx, suggesting a role of sphingomyelinase in plasma membrane repair.

You’ve just watched JoVE’s video on FM dyes in vesicle recycling. The video described the biochemistry of FM dyes, detailed a protocol to stain and quantify synaptic vesicle recycling, and finally outlined current experiments utilizing these dyes in different ways. As always, thanks for watching!

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